专利名称：毕赤酵母基因工程菌株及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种毕赤酵母基因工程菌株及其该菌株在生产木质素过氧 化物酶中的用緯。
背景技术：
木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase,简称LiP)是一种来源于真菌的 过氧化物酶，是降解木质素过氧化物酶系的主要成分。它是由一系列含有 血红素辅基的同功酶组成的，分子量在38 43kD之间，其主要成分为 LiPH2。此酶能直接降解植物原料中的木质素，对自然界木材腐朽及制浆 造纸脱木素意义重大。目前，木质素过氧化物酶的生产主要采用白腐真菌。但白腐真菌只有 在限氮或其它不均衡的培养基中才能分泌木质素过氧化物酶，且培养基成 分十分复杂。白腐真菌的经典培养基为Kirk培养基(KirkTK., SchultzE.， Connors WJ, Lorenz LF. and Zeikus JG., Influence of culture parameters on lignin ■ metabolism by phanerochaete chrysosporium, Arch. Microbiol. 117 (1978)277-285)，包括以下成分(1) 基本培养基(每升):KH2P04 4.1mmol， MgS04 6.09mmol， CaCl2 0.55mmol， 1ml无机溶液，0.5ml维生素溶液，其中，无机溶液成分为(每 升)氨基酸7.8X l(y3mol， MgS04 1.2X l(T2mol， MnS04 2.9X l(T3mol， NaCl L7X10-2mol， FeS04 3.59 X 10-4mol， CoCl2 7.75 X 10-4mol， CaCl2 9.0 X 10.4mol， ZnSO43.48X10—4mol， CuS04 4X 10.5mol， A1K(S04)2 2.1 X 10.5mol， H3B03 1.6X 10-4mol和Na2Mo04 4.1 X 10_5mol;维生素溶液成分为(每升) 2mg生物素，2mg叶酸，5mg盐酸硫胺素，5mg核黄素，lOmg维生素B6 盐酸盐，O.lmg维生素Bu， 5mg烟酸，5mgDL —泛酸钙，5mg对氨基苯甲 酸，5mg硫辛酸；(2) 氮源1.2mmol/L酒石酸铵 (3) 碳源1% (质量浓度)葡萄糖(56mmol/L)(4) 缓冲成分20mmol/L的DMS(5) pH: 4.5另外，通过培养白腐真菌生产LiP的周期较长， 一般讲，LiP的合成开 始于第3-4天，而在第6-7天达到高峰(李慧蓉，白腐真菌生物学和生物 技术，化学工业出版社，2005年)。综上所述，利用白腐真菌来生产LiP，由于培养基成分复杂，生产周期 长，造成了实际应用中的困难。发明内容本发明的目的是提供一种毕赤酵母基因工程菌株。 本发明的另一个目的是提供该菌株在生产木质素过氧化物酶LiPH2中 的用途。毕赤酵母基因工程菌株(尸/c/n'"pwton's) WX-33-LiPH2是由毕赤酵母 (P/c/n'a/xwton^)X-33野生菌株作为宿主菌，通过分子生物学方法将LiPH2基因整合到其染色体上，从而得到的一株基因工程菌。此菌株能够快速生 长并且在甲醇诱导下分泌出具有活性的LiP蛋白。本发明的具体制备方法如下1 、诱导培养白腐真菌/Vz""erac/z"efe c/^，oy/ cWww BKM-F-1767菌株 (参见文献李越中，高培基，王祖农.黄孢原毛平革菌合成木素过氧化物 酶的营养调控.微生物学报，1994， 34: 29-36);2、 提取菌株的总RNA，然后采用一步法反转录获得高活性木质素过 氧化物酶基因LiPH2;3、 用pUCm-T载体构建LiPH2基因片段的克隆载体，保存至大肠杆 菌DH5 a中；4、 提取大肠杆菌质粒，通过双酶切切出LiPH2基因，并与pPICZaA 载体连接构建表达载体pPICZ a -LiPH2;5、 电转化把表达载体整合到野生菌株毕赤酵母X-33的染色体上，通
过筛选鉴定，得到整合了木质素过氧化物酶LiPH2基因的酵母菌株WX-33-LiPH2。采用本发明菌株发酵生产木质素过氧化物酶，先在BMGY培养基(1% 酵母提取物，2%蛋白胨，lOOmM磷酸钾缓冲液，pH6.0， 1.34%酵母氮源， 4xlO—V。生物素，1%甘油)中培养本发明菌株，再在BMMY培养基(1%酵 母提取物，2%蛋白胨，lOOmM磷酸钾缓冲液，pH 6.0， 1.34%酵母氮源， 4xl0、/。生物素，0.5%甲醇)中诱导木质素过氧化物酶的分泌，从培养到诱 导两个阶段，酶活生产时间共需30-45h。采用本发明菌株生产木质素过氧化物酶与使用白腐真菌相比，培养基 成分简单，且缩短了产酶时间(用白腐真菌需要3-4天)，为工程应用奠定 了基础。毕赤酵母基因工程菌株的鉴定方法:1 、先对筛选到的菌株，提取其DNA，并用pPICZ a A上特定的5'A0X1 以及3'AOXl引物进行测序，序列结果与LiPH2基因的序列一致。此结果 表明，LiPH2基因确实整合到毕赤酵母X-33的染色体上(见图1)。从图1 可以看出LiPH2基因连接在pPICZa的多克隆位点上；2、当菌体在BMMY培养基中培养时.，每隔24小时添加100%甲醇使 终浓度达到0.5%;每隔12小时取2ml样品1500 3000Xg离心得上清液， 对上清液同时采用测定酶活和SDS-PAGE两种方法来鉴定该菌株是否能够 表达LiPH2。(1 )测定酶活的方法为(参见文献"Tien M, Kirk T K.Proc.Natl. Acad.Sci.USA, 1984,81:2280-2284 ，，)用紫外分光光度计在4cm的石英比色皿中进行反应测定，比色皿中4ml 反应液成分为0.8ml藜芦醇溶液(10mmol/L)、 0.2ml酒石酸缓冲溶液 (lmol/L， pH2.5)、 lml上清液、0.4ml &02溶液(4mmol/L)、 2.6mlH20， 于室温下测定310nm处的吸光度变化，以每分钟氧化藜芦醇形成l P mol藜 芦醛定义为一个酶活力单位(U)，藜芦醛的摩尔吸光系数为；310 = 9300mol/cm。(2) SDS-PAGE标准方法鉴定结果(见图2和图3)能够确定此酵母菌株生产出含有活性的木质 素过氧化物酶。图2中X-33mA为本发明菌株，X-33contro1为不含LiPH2基因的对照 菌株，X-33A为另一株也含有LiPH2基因但检测不到酶活的基因工程菌株。 由此图可以看出，本发明菌株可以生产出有活性的木质素过氧化物酶。图3中1为不含目的基因的对照菌株，2为含有LiPH2基因但检测不 到酶活的基因工程菌株，3为本发明菌株，4为分子量标准物。由此图可以 看出，本发明菌株能够分泌出分子量为41KDa的蛋白，大小与LiPH2基因 编码的蛋白相符。
图1为表达载体pPICZa丄iPH2的结构图；图2为基因工程菌株及其对照菌株进行诱导产酶的酶活测定图； 图3为不同菌株诱导后，上清液的SDS-PAGE图。
具体实施方式
按照文献中方法在250ml三角瓶中静态培养白腐真菌户/2朋erac/2a她 c/^ms/7w^mBKM-F-1767菌株，培养基为25ml;收集菌体，提取菌株的 总RNA，然后采用一步法反转录获得高活性木质素过氧化物酶基因LiPH2; 用pUCm-T载体构建LiPH2基因片段的克隆载体，保存至大肠杆菌DH5 a中；提取大肠杆菌质粒，通过双酶切切出LiPH2基因，并与pPICZaA 载体连接构建表达载体pPICZ a -LiPH2;电转化把表达载体整合到野生菌 株毕赤酵母x-33 (市售，Invitrogen公司生产)的染色体上，通过筛选鉴 定，得到整合了木质素过氧化物酶LiPH2基因的酵母菌株WX-33-LiPH2。实施例l将菌株WX-33-LiPH2在250ml的摇瓶中培养，培养基用50ml BMGY (1%酵母提取物，2%蛋白胨，lOOmM磷酸钾缓冲液，pH6.0， 1.34%酵母 氮源，4xl0—5。/。生物素，1%甘油)，30°C， 250rpm，培养18h;收集菌体， 2500Xg下室温离心5min，轻轻倒出上清液，将菌体在30ml BMMY培养基 (1%酵母提取物，2%蛋白胨，lOOmM磷酸钾缓冲液，pH6.0， 1.34%酵母 氮源，4x10—5%生物素，0.5%甲醇)中悬浮，封口膜包好，再次放入摇床中 进行培养，12小时后可收获到含有酶活的菌液，酶活为16U/L。 实施例2 .将菌株WX-33-LiPH2在250ml的摇瓶中培养，培养基用50ml BMGY (1%酵母提取物，2%蛋白胨，lOOmM磷酸钾缓冲液，pH6.0， 1.34%酵母 氮源，4x1(t5。/。生物素，1%甘油)，3(TC， 250rpm，培养30h;收集菌体， 2500Xg下室温离心5min，轻轻倒出上清液，将菌体在30ml BMMY培养基 (1%酵母提取物，2%蛋白胨，lOOmM磷酸钾缓冲液，pH6.0， 1.34%酵母 氮源，4xlO—V。生物素，0.5%甲醇)中悬浮，封口膜包好，再次放入摇床中 进行培养，15小时后可收获到含有酶活的菌液，酶活为23U/L。
权利要求
1、一种毕赤酵母基因工程菌株，其特征在于该菌株为毕赤酵母(Pichiapastoris)WX-33-LiPH2。
2、 权利要求1所述的毕赤酵母基因工程菌株的用途，其特征在于将所述菌株 用于木质素过氧化物酶的生产中。
全文摘要
本发明涉及一种毕赤酵母基因工程菌株及其该菌株在生产木质素过氧化物酶中的用途。毕赤酵母基因工程菌株(Pichiapastoris)WX-33-LiPH2是由毕赤酵母(Pichiapastoris)X-33野生菌株作为宿主菌，通过分子生物学方法将LiPH2基因整合到其染色体上，从而得到的一株基因工程菌。采用本发明菌株发酵生产木质素过氧化物酶，先在BMGY培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液，pH6.0，1.34％酵母氮源，4×10<sup>-5</sup>％生物素，1％甘油)中培养本发明菌株，再在BMMY培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液，pH6.0，1.34％酵母氮源，4×10<sup>-5</sup>％生物素，0.5％甲醇)中诱导木质素过氧化物酶的分泌，培养基成分简单，酶活生产时间仅需30-45h。
文档编号C12N1/19GK101148644SQ200710176739
公开日2008年3月26日 申请日期2007年11月2日 优先权日2007年11月2日
发明者文湘华, 玮 王 申请人:清华大学