专利名称：一种检测乙型肝炎病毒p基因ymdd变异的置换扩增法的制作方法
技术领域：
本发明涉及乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus HBV)基因及其变异的分子检测方法。尤 其是HBV基因组包括DNA和RNA以及YMDD基因变异的多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaction) PCR扩增检测法和检测试剂盒。
背景技术：
乙型肝炎是一种严重威胁人类健康的传染病，据世界卫生组织报导，全球约20亿人曾 感染过HBV，其中超过了 3.5亿人为慢性乙肝病毒HBV感染者，我国是乙肝感染高流行区。 乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科，也是慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭及原发性肝细胞癌的主 要原因。乙肝感染的诊断目前主要依据血清学酶免方法检测，随着PCR技术出现而发展了 许多HBV基因扩增PCR检测法，然而PCR太过灵敏容易带来假阳性问题。乙肝感染的控 制主要采用乙型肝炎疫苗接种预防，乙肝的治疗采用a -干扰素和核苷酸类抗病毒药拉米夫 定(Lamivudine)。然而拉米夫定治疗中受药物选择而容易产生耐药变异株。据临床统计， 血清e抗原阳性病人经一年拉米夫定治疗，会有14-32%耐药，长期治疗，第二、三、四年 的耐药率增加至38%、 49%和66% (KarayianmisR， Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2003，51:p761-785)。耐药株基因变异主要在HBV多聚酶活性区PoL/RT片段(349-692 aa， 即rtl-rt344),常见的是酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸YMDD变异，即由YMDD 变异为YIDD (rtM204I/aaM5521)或YVDD (rtM204V/aaM552V) , YVDD常伴有rtL180 M 变异(Lai CL.，et. al.， Clin.Infect.Dis,2003，36: p687-696)。而且血清HBV RNA的YMDD变异 更早于HBV DNA变异检测(Hatakeyama., et. al., Hepatology; 2007,45-5: pll79-86)。因此， 检测HBV YMDD基因变异尤其RNA的YMDD变异对调整治疗用药、及时用阿德福韦 (adefovir)代替拉米夫定的耐药无效治疗具有重要的指导意义。目前对HBV YMDD变异株的检测方法多采用PCR或RT-PCR扩增HBV多聚酶P基因 产物测序法(Chayamak,et.al.,Hepatology 1998,27: pl711-1716); PCR-RFLP限制性片段长度 多态性分析法(Allen ML, etal., Journal of Clinical Microbiology 1999,37-10:p3338-3347和中 国专利200710036511.9);各种荧光PCR分析法(Whallyey SA, et al.， J Clinical Microbiol, 2001， 39:pl456-1459 ; Wang PZ, et al,， World Clin J Digestol 2004，12-3:p600-603和中国专利 200510065445.9);以及线性探针反向杂交法INNO-LipA(Osinwg C.,et al., Journal of Clinical Microliology 2003,41-72:p5473-5477)。这些基于传统PCR技术的应用方法不仅存在着繁琐、费时，不便于临床快速监测，最重要的是PCR技术太过于灵敏，极易产生假阳性扩增。基因芯片技术是近十年来发展起来的高效大规模并行分析技术，广泛应用于生物学许多 领域。并且在HBV拉米夫定抗药性检测中得到应用(Jang H.,et.al.， Journal of Clinical Microbiology,2004,42-9: p4181-4188;中国专禾ij:03111452.0和02221161.6等)。然而这种固相 生物芯片加工繁琐昂贵，分子在固相表面较液相中反应不均一，不充分，芯片之间的加工 差异而导致重复性不好。需要专用复杂仪器，不便于推广等。我国HBV慢性感染者众多， 在拉米夫定治疗中亟待发展更有效，简便，快捷的耐药YMDD变异检测方法,以建立完善的 耐药监测体系以指导临床合理用药。
发明内容
针对上述领域中的缺陷，提供一种检测乙型肝炎病毒P基因YMDD变异的置换扩增法， 通过置换法降低扩增灵敏度来规避PCR产物再污染导致的假阳性问题，同时给合荧光显色， 可检测各变异株的含量。一种检测乙型肝炎病毒P基因YMDD motif(模体)及变异的置换扩增法，其特征在于 将待测P基因RT区(…sYMDDv…)DNA/RNA作为保留杂交序列与包括一套以上的指示 DNA首尾互补序列杂交，连接酶反应，指示加首尾DNA的首尾共价连接，形成置换指示 DNA环，再反向PCR扩增；所述待测P基因RT区包括YMDD、及变异YIDD和YVDD 基因的DNA和RNA样本，所述指示DNA的序列是与HBV基因包括P基因RT区序列 无关的基因序列，无关定义为6-8 base碱基以上连续相同为相关，反之无关。所述保留杂 交序列为待测基因中P基因RT区含变异(或突变)序列，长度为20-100bp;从变异基因开 始断开，形成左、右半部分序列，链长10-50base;所述保留杂交序列优选为P基因RT区 一段长30-60base序列片段。所述首尾互补杂交序列是指保留杂交序列的右半部分序列加在 指示DNA上游首端，左半部分序列反接在指示DNA的下游尾端，形成指示加首尾DNA， 所述指示DNA序列长度为80-1000 bp;所述指示DNA序列优选长度为150-500 bp。所述连 接酶反应的连接酶指DNAligase包括T4 Ugase，Taq ligase;所述连接反应包括0'C-2(TC连接 反应和热循环连接反应。所述反向PCR扩增是采用指示DNA正中间序列的右半部分作为 反向引物RevF，左半部分以互补反义序列作为反向引物RevR,反向扩增置换指示DNA 环。所述置换扩增体系中还包括有荧光分子信标或荧光染料。所述荧光分子信标为 Molecular Beacon, Taqmen或LightCycler，荧光分子信标序列与待测模板保留序列杂交或与 指示模板序列杂交。所述荧光染料为DNA荧光染料包括SYBR Green。检测乙型肝炎病毒P基因YMDD变异的试剂盒，包括DNA/RNA纯化试剂，Taq连接 酶及缓冲液、抑制Olligo、 dNTP、 Taq Polymerase及缓冲液，DNA荧光染料或分子信标，凝胶电泳试剂，其特征在于还包括指示加首尾DNA和反向引物Rev F和Rev R。 本发明置换指示PCR (见图1)工作原理及流程如下基本原理是将待测PCR就是工作PCR的常规概念转变成为用指示PCR系统置换待测 PCR来工作。具体置换方法就是选取待测基因一段作为特异保留杂交序列，将这段序列分 成左右两半分别加在指示DNA首尾两端，加了首尾的指示DNA就能与待测目的基因杂交， 从而指示DNA首尾靠近，缺口连接,使指示DNA成环。再反向PCR扩增首尾连接了的指 示DNA。这种置换效率较直接扩增基因效率低，降低了直接PCR的太过的灵敏度。减少指 示DNA的量或比例，可以极大地降低非特异性扩增。杂交链缺口两侧碱基配对要完全正确 才能连接，因此，可以分析待测基因的单碱基变异。1. 准备指示DNA:以待测乙型肝炎病毒HBV多聚酶催化区POL/RT片段蛋白序列---sYMDDv—，其核酸 序列5'-c tgt t/c tg get ttc agt tat atg gat gat gtg gt w(aA) ttg g-3，作为待测HBV非耐药株基因 的保留杂交序列。变异YIDD核酸序列5，- c tgt t/c tg get ttc agt tat att gat gat gtg gtw(a/t) ttg g-3，和变异YVDD核酸序列5，-c tgt t/c tg get ttc agt tat gtg gat gat gtg gtw(a/t) ttg g-3，作为拉米 夫定耐药株基因的保留杂交序列。选取一段与HBV无关的日本血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶GST基因(13-341nt/aa5-114)约 300 bp的序列作为YMDD的指示DNA 1 ，同样的序列首尾各除去约50 bp的GST 83-270nt 近200 bp的序列作为YIDD的指示DNA 2，同样的序列首尾再各除去约25 bp的GST 105-250nt近约150 bp的序列作为YVDD的指示DNA3;指示DNAl， 2， 3构成独立一套 指示系统。以此类推，选取另一无关的基因序列作为第二套指示系统，……等等。每个保留杂交序列从变异碱基开始断开分成左半部分L和右半部分R。右半部分序列以 有意义链序列3'末端加在指示DNA上游5'端20bp序列前面合成指示DNA 5'端制备 引物，左半部以互补反义序列3'端接在指示DNA下游尾端20bp的反意义链序列5'端之 前合成指示DNA3'端制备引物。以此对磷酸化的引物和用pfo酶扩增生成平末端的指示 加首尾DNA，其首尾两端包含部分待测模板保留序列，制备的指示PCR产物用琼脂糖凝胶 电泳纯化及柱纯化。2. 待测模板一指示DNA杂交连接酶反应指示加首尾DNA与纯化的待测标本杂交，如有阳性模板则通过其保留杂交序列与指示 加首尾DNA两头末端序列杂交，使指示DNA两侧5'末端和3'末端因结合待测模板杂交 序列而促使同一指示DNA首尾靠近契合(juxtaposed)，其首尾末端磷酸基与羟基间缺口经耐 热连接酶TaqLigase连接修复而生成环状指示DNA。并且杂交链缺口两侧碱基要完全匹配 才能修复成环，因此，YMDD指示DNA只能与YMDD motif杂交成环；YIDD指示DNA只能 与YIDD motif杂交成环；YVDD指示DNA只能与YVDD motif杂交成环;单碱基错误匹配不能修复成环而不会相互之间错配。而未杂交的双链同一指示模板链的首尾平末端不能连 接，双链指示DNA分子之间平末端的连接效率较双链中单链的缺口修复效率低太多，并因 加入过量的平端8-20bp无关序列的Oligo寡聚物双链DNA而几乎全被抑制。结果只有阳性 标本模板有杂交序列帮助的指示DNA才能形成环状指示DNA，而阴性标本则只存在线性 指示DNA。调节指示DNA含量或与待测标本模板比例,可以控制杂交成环效率从而控制最终反向 PCR的非特异性背景及检测分析灵敏度。采用连接酶链反应Ligase Chain Reaction (Barany R,PNAS 1991,88:pl89-193)热循环连接催化,第一循环产生的指示DNA环可以作为第二轮循 环的杂交模板，从而进一步提高最终PCR检测的灵敏度。3. 环状指示DNA反向PCR:环状YMDD指示DNA分子1 ， YIDD指示DNA分子2, YVDD指示DNA分子3均采用 同一套DNA序列，只是从两端逐渐縮短,用指示DNA正中间共同的序列作为工作指示PCR 引物，向首尾外侧延伸反向扩增环状DNA，间接指示待测模板的存在与多少。而非环状各 种指示DNA则反向PCR因中间断开而无法指数扩增。PCR产物用Agarose凝胶检测分析, YMDD指示DNA分子1将产生约300 bp的片段，YIDD指示DNA分子2将产生约200 bp 的片段,YVDD指示DNA分子3将产生约150 bp的片段。反向实时荧光PCR将反向PCR系统中加入DNA结合染料SYBR Green,或与Molecular Beacon, Taqmen，LightCycler等荧光分子探针联用可实时定量检验待测标本模板含量。 一种 新型UT-PCR采用将PCR —侧引物5'末端接上一段通用序列,再与该通用序列互补的 Taqmen荧光分子探针联用实时定量检测(Zhang Y., Nucleic Acids Research，2003,31-20:e123), 通用Taqmen不仅减少了荧光分子探针对模板扩增的干扰，而且本底更低。4. 指示DNA的变通线性指示DNA正中间可以断开，换句话说，可以合成左、右分开独立的两条指示DNA， 一条首端加右半部分保留杂交区序列，另一条尾端加左半部分保留杂交序列。中间断开端 的序列仍作为反向PCR引物序列。除了不便于指示加首尾DNA的制做，纯化。其余与成 环指示DNA方法全部相同。本发明优点(1) 待测PCR可以置换成许多指示PCR，避免仅一套工作系统扩增产物的再污染。(2) 拓展了常规PCR灵敏范围，即可降低灵敏度减少非特异性扩增，又可进一步增加 灵敏度检测极微量基因。(3) 待测DNA与RNA均可杂交直接置换成指示DNA，无需RNA逆转录成cDNA，特 别适合大量RNA病毒的直接检测。(4) 尤其适合待测基因的单碱基及多碱基变异分析。(5)实时荧光置换PCR，易设置指示对照，定量更准确；与高通量荧光PCR仪联用，适 合高通量大规模并行分析。
图1:本发明置换PCR示意图其中(l)待测模板示意图左侧长直线代表含YMDD motif模板，粗线为有意义链或RNA， 细线为反意义链。(2) 指示模板右图上断开的双环代表一套指示加首尾模板DNA，包括环线代表的一段与待测基因无关的序列和两端的与待测模板互补的保留杂交序列(短直线部分)。(3) 左侧代表阳性反应待测模板与指示加首尾DNA序列杂交后经Taq连接酶修复缺口，形成环状指示DNA，并被反向PCR扩增。(4) 右侧代表阴性反应缺口指示加首尾DNA被过量平端双链Oligo竞争抑制，不能被Taq 连接酶环化，没有扩增。图2A:为慢性乙肝耐药变异检测电泳结果.其中M lane (列)为DNA Marker, 1为正常血清标本，2-4为3例YMDD阳性，5为一例 YMDD和YIDD混合感染，6为一例YIDD阳性，7为 一例YVDD阳性感染，8为阴性pUC 19 对照，9为混合质粒pYMDD,pYIDD和pYVDD阳性对照 图2B:为乙型肝炎YIDD和YVDD阳性标本基因商业测序结果。具体实施方法下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。所用试剂均为市售。 实施例步骤慢性乙型肝炎感染者长期拉米夫定治疗的6例血清和1例正常人血清标本。分别用等 量酚/氯仿及单独氯仿抽提，天根Tiangen公司DNA纯化柱纯化。每份标本分别加入混合的 指示DNA分子1 ，分子2，分子3以及双链寡聚DNA抑制物，标本指示DNA杂交连接酶 反应，以该连接酶反应液l一2ul作为模板，加入反向PCR引物Reverse F和Reverse R,反向 PCR扩增。同时以pUCYMDD (531_582aa)， pUC YIDD和pUC YVDD质粒混合作为阳 性对照，单独的pUC19质粒作为阴性对照。 (一)指示加首尾DNA及引物的准备(1).合成指示PCR引物(采用固相亚磷酰胺三酯法或商业定购5'末端磷酸化的引物)YMDD 5，端引物MF:首先待测HBV P基因YMDD保留杂交序列右半部分有意义链 18base，再加指示DNA1的首(5')端最开始的22base有意义链序列。5，-tg gat gat etg gtW ttg gta ggt tat tgg aaa att aag g-3,YMDD3'端引物MR:首先待测HBVP基因YMDD保留杂交序列左半部分反意义链 20base，再加指示DNA1的尾端最开始的20base反意义链序列。 5，-t ata act gaa age caR aca gtc ttt act ata tgc aat tc-3，YIDD 5'端引物IF:首先待测HBV P基因YIDD保留杂交序列右半部分有意义链 17base，再加指示DNA2的首(5')端最开始的19base有意义链序列。 5，陽t gat gat gtg gtW ttg gaa gag cat ttg tat gag c隱3，YIDD 3，端引物IR:首先待测HBV P基因YIDD保留杂交序列左半部分反意义链 21base，再加指示DNA2的尾端最开始的18base反意义链序列。 5，-at ata act gaa age caR aca gtc tgc acg etc ttt tgg-3，YVDD 5'端引物VF:首先待测HBV P基因YVDD保留杂交序列右半部分有意义链 17base，再加指示DNA3的首(5')端最开始的19base有意义链序列。 5'-g gat gat gtg gtW ttg gat gaa ggt gat aaa tgg-3，YVDD 3'端引物VR:首先待测HBV P基因YVDD保留杂交序列左半部分反意义链 21base，再加指示DNA3的尾端最开始的17base反意义链序列。 5，-ac ata act gaa age caR aca gec acc caa cat gtt gtg-3， 分别PCR扩增指示加首尾DNA并用商业PCR产物纯化柱纯化。无关序列指示DNA M 5' 端指示引物Primer(5uM) lul 3' 端指示引物Primer(5uM) lul 10 Xpfu buffer 5ul 10mMdNTP lul pfii lul 幽Q_50ul置95'C变性5分钟，25个循环，94°C 30秒，52°C 30秒，72°C45秒。25个循环 后72"C10分钟。指示PCR产物经天根Tiangen公司的DNA凝胶纯化试剂盒按说明书纯化。 (2).合成平端双链抑制Oligo寡聚物搜寻一段与待测模板和指示DNA都无关((定义4 base碱基或4碱基以上连续相同为相 关，反之无关)的短序列，合成一段8-20 base单链01igo，再合成一段与之序列互补反意义链 的8-20 base单链Oligo,双链Oligo (lOOuM)混合，95'C加热5分钟，快速冰浴冷却，贮存。本实施例采用非常稀有的归位内切酶Homing Endonucleases I-Ceu I部分识别序列:5，-ggt cct aag gta gcg-3'禾口互补反意义链5，-cgc tac ctt agg acc-3，。 (3).合成反向PCR引物:取指示DNA正中间约40bp长的序列，右半部分约20 base长的有意义链序列作为5'端 反向PCR引物RevF: 5，-at ggt gat gtt aaa tta aca c-3，；左半部分约20 base长的反意义链作为 3'端反向PCR弓I物RevR: 5 ， -ate aat ata ata agg aag att g-3 ，。(二) 待测标本的纯化临床标本核酸纯化(1) HBV DNA样本的纯化等量酚-氯仿抽提，商业DNA纯化柱纯化(详细步骤按Tiangen说明书进行)1) :加100-200ul样本于1.5ml EP管中加等量的酚/氯仿/异戊醇(25: 24: 1)抽提，漩涡振荡，台式离心机离心最高速5分钟。2) :上清100-200ul转移至新EP管中，加等量氯仿，振荡，离心。3) :上清加4倍的Tiangen结合缓冲液移至纯化柱，洗涤缓冲液洗柱两次，加50ul dH20洗脱收集纯化的样本。(2) HBVRNA样本的纯化异硫氰酸胍一步法提取总RNA (Chomczynski， P. et， al. 1987 Anal. Biochem. Vol 162:pl56)。样本于EP管中加1ml的Trizole(0.5ml 4M异硫氰酸胍,和0.5ml酚，加0.05ml 2M醋酸钠PH4.0)变性液裂解，强烈漩涡振荡或用针头反复抽吸，再加200ul氯 仿振荡，离心5分钟，取上清加等量0.5ml异丙醇置-20'C2小时再离心沉淀，70% 乙醇洗涤一次，力卩50ul DEPC处理的dH20溶解。Oligo(dT)顺磁珠纯化mRNA: —般没有必要纯化mRNA，如需要更纯的模板，按 Promega公司说明书进行。(三) 待测标本与指示加首尾DNA杂交连接酶反应纯化的待测样本 lul 纯化的指示加首尾DNA lul 10X Taq连接酶缓冲液 2ul 抑制OIigo(lOOuM) luldH20_1M20ul置95'C变性5分钟，上述20ul杂交反应液中再加耐热连接酶(采用自制连接酶TaL)0.5-lul，置50。C (40°C-70°C)温育10分钟。如果此步骤(三)采用连接酶链反应Ligase Chain Reaction热循环连接催化，第一循环 产生的指示DNA环可以作为第二轮循环的杂交模板，从而进一步提高最终PCR检测的灵敏 度。(四)反向PCR:杂交连接酶反应液 2ul 反向引物Primer Rev F lul 反向引物Primer Rev R lul lOmMdNTP lul 10 XTaq PCR buffer 5ul Taq polymerase luldH20_^150ul置94。C变性5分钟，25-30个循环，94°C 30秒，54°C 30秒，72。C30秒。25-30个循 环后72。C10分钟。(五)PCR产物分析1. 琼酯糖凝胶1.5%- 2.0% agarose电泳分析或在反向PCR液中加lul荧光分子探针或SYBR Green染料，荧光PCR扩增实时检测。2. 电泳结果(见图2A):乙型肝炎6例慢性感染血清标本，其3例YMDD阳性(见电泳凝胶2-4 lanes),凝胶显 示300bp大小片段;仅一例YIDD阳性(电泳凝胶lane 6)，显示200bp片段;一例YVDD阳性(电 泳凝胶lane 7)，显示150bp片段;还有一例为YMDD和YIDD混合感染(电泳凝胶lane 5)， 同时显示300bp和200bp大小两条带。正常血清标本没有扩增(电泳凝胶lane l);阳性对照 pUCYMDD/YIDD/YVDD混合质粒组(电泳凝胶lane 9)同时显示300bp、 200 bp和150 bp三 条带。阴性pUC19对照没有扩增(电泳凝胶lane 8)，不显示任何DNA条带。乙型肝炎YIDD禾BYVDD阳性标本基因经克隆，商业测序检测(见图2B)，其基因序 列为YIDD和YVDD突变。 -实验证明，本发明的检测结果与商业测序相符合。
权利要求
1、一种检测乙型肝炎病毒P基因YMDD motif及变异的置换扩增法，其特征在于将待测P基因RT区DNA/RNA作为保留杂交序列与包括一套以上的指示DNA首尾互补序列杂交，连接酶反应，指示加首尾DNA的首尾共价连接，形成置换指示DNA环，再反向PCR扩增；所述待测P基因RT区包括YMDD、及变异YIDD和YVDD基因的DNA和RNA样本，所述保留杂交序列为待测基因中P基因RT区含变异序列长度为20-100bp序列；从变异基因开始断开形成左、右半部分序列，链长10-50base；所述指示DNA的序列是与HBV基因包括P基因RT区序列无关的基因序列，序列长度为80-1000bp；所述首尾互补杂交序列是指保留杂交序列的右半部分序列加在指示DNA上游首端，左半部分序列反接在指示DNA的下游尾端，形成指示加首尾DNA，所述指示DNA所述连接酶反应包括0℃-20℃连接反应和热循环连接反应；所述反向PCR扩增是采用指示DNA正中间序列的右半部分作为反向引物Rev F，左半部分以互补反义序列作为反向引物Rev R，反向扩增置换指示DNA环。
2、 根据权利要求1所述的置换扩增法，其特征在于所述保留杂交序列为P基因RT 区一段长30-60base序列片段。
3、 根据权利要求1所述的置换扩增法，其特征在于所述指示DNA序列长度为150-500bp。
4、 根据权利要求1所述的置换扩增法，其特征在于所述连接酶反应中的连接酶指DNAligase。
5、 根据权利要求4所述的置换扩增法，其特征在于:DNAligase为T4 ligase或Taq ligase。
6、 根据权利要求1所述的置换扩增法，其特征在于所述置换扩增体系中还包括有荧 光分子信标或荧光染料。
7、 根据权利要求6所述的置换扩增法，其特征在于所述荧光分子信标为Molecular Beacon, Taqmen或LightCycler，荧光分子信标序列与待测模板保留序列杂交或与指示模板 序列杂交。
8、 根据权利要求6所述的置换扩增法，其特征在于所述荧光染料为DNA荧光染料。
9、 根据权利要求8所述的置换扩增法，其特征在于所述DNA荧光染料为SYBR Green。
10、 根据权利要求1-9任一所述置换方法制备的检测乙型肝炎病毒P基因YMDD变异 的试剂盒，包括DNA/RNA纯化试剂，Taq连接酶及缓冲液、抑制Olligo、 dNTP、 Taq Polymerase及缓冲液，DNA荧光染料或分子信标，凝胶电泳试剂，其特征在于还包括指 示加首尾DNA和反向引物Rev F和Rev R。
全文摘要
本发明涉及“一种检测乙型肝炎病毒P基因YMDD变异的置换扩增法”，其特征在于待测HBV P基因YMDD motif及变异YIDD，YVDD序列通过杂交-连接酶反应置换成指示DNA，再反向扩增指示系统。所述YMDD杂交序列分成左右两半分别加在一段指示DNA首尾两端，加了首尾指示DNA与P基因YMDD区序列杂交，使其首尾靠近契合，杂交链缺口连接酶连接。所述反向扩增指示DNA，采用指示DNA正中间序列作为引物，反向扩增首尾共价相连指示DNA。其缺口两侧碱基匹配依赖性连接使其适合单碱基变异基因分析。一个检测可置换成许多指示PCR，避免仅一套系统扩增产物的再污染。待测RNA也可以杂交-连接反应置换成指示DNA而直接检测。或与SYBR Green染料或荧光分子探针联用还适用于待测基因的实时定量分析。
文档编号C12P19/34GK101250581SQ200710176760
公开日2008年8月27日 申请日期2007年11月2日 优先权日2007年11月2日
发明者廖同兵, 洪 江 申请人:北京万达因生物医学技术有限责任公司