专利名称：一种利用秸秆细胞壁蛋白构建的高效纤维素酶解体系的制作方法
技术领域：
本发明属于纤维素酶解发酵技术领域，特别涉及一种利用秸秆细胞壁蛋白和 木霉纤维素酶之间的协同作用，构件的纤维素高效酶解体系及其在木质纤维素降 解中的应用。
背景技术：
木质纤维素是自然界中最丰富的可再生资源，也是生产生物能源、化工产品 的重要原料。木质纤维素具有极其复杂的结构，除了纤维素以外，仍然有大量的 半纤维素、木质素、胶质、蛋白质、矿物质、脂肪酸等存在。木质纤维素的酶解 是其转化的中心环节，尽管进行了广泛的研究，然而转化效率仍然较低。天然纤 维素通常由纤维束组成，平行排列的纤维束通过氢键和范德华力紧密结合在一 起，形成了极其致密的结晶结构。由于木质纤维素中木质素的存在，纤维素酶可 以与之通过非共价键产生非特异结合，这大大降低了纤维素酶的利用效率。从木 质纤维素的结构特点和转化的经济可行性角度分析，木质纤维素的致密结构、木 质素对纤维素酶的非特异性吸附和和高昂的纤维素酶成本是其高效转化的瓶颈， 也是实现其工业化生产亟待解决的问题。
目前纤维素酶主要来源于微生物，而植物内源性纤维素酶解体系没有得到重 视。植物细胞壁中存在比较丰富的酶蛋白，在植物生长的各个阶段，酶蛋白参与 了细胞壁的松弛、合成、分解等过程。与其它来源的纤维素酶相比，植物内源性 细胞壁酶蛋白对细胞壁的作用具有高效、基因调控复杂等特点。植物收获后的秸 秆仍然处于生理上的衰老阶段，其中也存在比较丰富的细胞壁酶蛋白，它们对该 阶段细胞壁结构的变化也起重要作用。尽管从已经植物生理角度对细胞壁酶蛋白 进行了一定的研究，然而其在木质纤维素降解中的潜在价值及其应用迄今没有研 究。
本发明从对纤维素降解具有促进作用的秸秆细胞壁蛋白入手，从新的角度分 析和解决木质纤维素转化中的瓶颈问题。分别从秸秆细胞壁中分离出了具有氢键断裂作用的蛋白Zeal，具有改变木质素结构的蛋白Zea2， (1， 3),(1， 4)-fi-葡聚
糖外切酶、e-葡萄糖苷酶、e-葡聚糖内切酶、木聚糖酶和果胶酶。在分析上
述酶蛋白与木霉纤维素酶相互作用的基础上，充分利用各组分之间的协同作用， 构建了一种新型高效的纤维素酶解体系。植物秸秆资源丰富，将秸秆细胞壁蛋白 应用于木质纤维素的降解，不仅提高了纤维素的酶解效率，也为降低纤维素酶的 成本开辟了崭新的方向，而且实现了资源的高值化利用，达到了利用植物自身资 源高效降解的目的。
发明内容
本发明涉及一种利用秸秆细胞壁蛋白与木霉纤维素酶之间的协同作用，构建 纤维素高效酶系的方法及其在木质纤维素降解中的应用。
本发明的构思如下在植物的衰老过程中，仍然有丰富的细胞壁蛋白，它们 参与了细胞壁结构变化的调节。以秸秆为原料，分离到了纤维素酶具有协同作用
的非水解性蛋白Zeal和Zea2; (1， 3),(1， 4)-B-葡聚糖外切酶、B-葡萄糖苷酶、 B-葡聚糖内切酶、木聚糖酶和果胶酶。蛋白Zeal能够削弱或打断纤维素内部的 非共价键，使底物变的疏松，从而使纤维素酶更容易与其结合；蛋白Zea2能够 与木质素反应，减少木质素与纤维素酶的非特异性结合。利用秸秆细胞壁蛋白与 木霉纤维素酶之间的协同作用，开发了新型纤维素酶解体系。
一种利用秸秆细胞壁蛋白构建的高效纤维素酶系及其在木质纤维素降解中 的应用，其特征在于包括以下步骤
1. 玉米秸秆细胞壁总蛋白的提取将秸秆置于l-2倍的研磨缓冲液中研磨，过 滤后滤渣置于提取缓冲液中，然后过滤；液体即为细胞壁总蛋白。总蛋白中包
括植物内源性纤维素酶(i， 3)，(1， 4)-B-葡聚糖外切酶、e-葡萄糖苷酶和e-
葡聚糖内切酶；与纤维素酶具有协同作用的蛋白Zeal和Zea2;具有酶解非 纤维素组分的木聚糖酶和果胶酶，它们能够提高底物中纤维素的可及性。
2. 蛋白Zeal、 Zea2的分离、纯化将l)中得到的粗细胞壁蛋白进行硫酸铵 沉淀，DEAE-琼脂糖(图1A)和葡聚糖GJ5 (图1B)层析，得到蛋白Zea 1， 分子量为60.2kDa (图3)。将l)中得到的粗细胞壁蛋白进行硫酸铵沉淀，Phenyl-Superose HR 5/5 (图2A)和葡聚糖G-75 (图2B)层析，得到蛋白Zea 2，分子量为39.6kDa (图4) 。 Zeal能够打断底物中的氢键，使底物变得 疏松，从而提高底物的可及性。Zea2能够改变木质素的结构，减少木质素与 纤维素酶的非特异性结合。
3. 利用蛋白Zea 1酶解纯纤维素酶解在醋酸缓冲液(100 mM, pH 4.5)中， 40-50。C下进行；在酶解体系中，每克底物加入100-200微克蛋白Zea 1和10-30 FPU木霉纤维素酶。其中以滤纸为底物时的酶解曲线如图5所示，。
4. 利用细胞壁总蛋白酶解纯纤维素酶解在醋酸缓冲液(IOO mM, pH 4.5)中， 40-50°C下进行;在酶解体系中，每克底物加入1-2毫克粗细胞壁蛋白和10-30 FPU纤维素酶。
5. 利用蛋白Zeal、Zea2酶解木质纤维素酶解在醋酸缓冲液(IOO mM， pH 4.5) 中，50。C下进行；在酶解体系中，每克底物分别加入200-300微克Zea 1、 500-700微克Zea 2和10-30 FPU纤维素酶。以蒸汽爆破预处理的玉米秸秆为 底物时的酶解曲线如图6所示。
6. 利用粗细胞壁蛋白酶解木质纤维素酶解在醋酸缓冲液(100mM,pH4.5)中， 40-50°C下进行;在酶解体系中，每克底物加入3-5毫克粗细胞壁蛋白和10-30 FPU纤维素酶。
本发明具有以下优点
1) 秸秆细胞壁蛋白与纤维素酶具有协同作用，可以大幅度提高纤维 素的转化率，节约纤维素酶的用量。
2) 秸秆细胞壁蛋白来源丰富，这既保证了充足的原料供应，又实现 了秸秆资源的高效利用，达到了利用秸秆自身资源降解纤维素的 目的。
图1A为蛋白Zeal的DEAE-琼脂糖层析图；图1B为蛋白Zea2的葡聚糖 G-75层析图；图2A为蛋白Zea 2的Phenyl-Superose HR 5/5层析图；图2B为蛋白Zea 2的 葡聚糖G-75层析图3为蛋白Zeal的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图； 图4为蛋白Zea 2的SDS-PAGE图5为滤纸酶解曲线图6为蒸汽爆破预处理的玉米秸秆的酶解曲线具体实施例方式
实例l:利用秸秆细胞壁蛋白提高滤纸酶解效率
将玉米秸秆置于2倍体积的研磨缓冲液中研磨，过滤后滤渣置于提取缓冲液 中，然后过滤，得到粗细胞壁蛋白；将粗细胞壁蛋白进行硫酸铵沉淀，DEAE-琼 脂糖和葡聚糖G-75层析，得到蛋白Zea 1;滤纸酶解在醋酸缓冲液(100 mM, pH 4.5)中，50。C下进行；在酶解体系中，每克滤纸加入15FPU木霉纤维素酶、150 微克Zea 1或1.8毫克粗细胞壁蛋白。
实例2:利用秸秆细胞壁蛋白提高废弃纸张酶解效率
将玉米秸秆置于2倍体积的研磨缓冲液中研磨，过滤后滤渣置于提取缓冲液 中，然后过滤，得到粗细胞壁蛋白；将粗细胞壁蛋白进行硫酸铵沉淀，DEAE-琼 脂糖和葡聚糖G-75层析，得到蛋白Zeal;废弃纸张酶解在醋酸缓冲液(IOO mM， pH4,5)中，5(TC下进行；在酶解体系中，每克滤纸加入20FPU木霉纤维素酶、 160微克Zea 1或2毫克粗细胞壁蛋白。
实例3:利用秸秆细胞壁蛋白提高玉米秸秆酶解效率
将玉米秸秆置于2倍体积的研磨缓冲液中研磨，过滤后滤渣置于提取缓冲液 中，然后过滤，得到粗细胞壁蛋白；将粗细胞壁蛋白进行硫酸铵沉淀，DEAE-琼 脂糖和葡聚糖G-75层析，得到蛋白Zea 1;将粗细胞壁蛋白进行硫酸铵沉淀， Phenyl-SuperoseHR5/5和葡聚糖G-75层析，得到蛋白Zea2;汽爆预处理玉米 秸秆的酶解在醋酸缓冲液(100mM，pH4.5)中，50。C下进行；在酶解体系中，每 克滤纸加入20 FPU木霉纤维素酶，220微克Zea 1和600微克Zea 2或3毫克粗细胞壁蛋白。
实例4:利用秸秆细胞壁蛋白提高小麦秸秆酶解效率
将玉米秸秆置于2倍体积的研磨缓冲液中研磨，过滤后滤渣置于提取缓冲液 中，然后过滤，得到粗细胞壁蛋白；将粗细胞壁蛋白进行硫酸铵沉淀，DEAE-琼 脂糖和葡聚糖G-75层析，得到蛋白Zeal;将粗细胞壁蛋白进行硫酸铵沉淀， Phenyl-Superose HR 5/5和葡聚糖G-75层析，得到蛋白Zea 2;汽爆预处理小麦 秸秆的酶解在醋酸缓冲液(100mM,pH4.5)中，50。C下进行；在酶解体系中，每 克滤纸加入25 FPU木霉纤维素酶，250微克Zea 1和700微克Zea 2或4毫克粗 细胞壁蛋白。
实例5:利用秸秆细胞壁蛋白提高稻草酶解效率
将玉米秸秆置于2倍体积的研磨缓冲液中研磨，过滤后滤渣置于提取缓冲液 中，然后过滤，得到粗细胞壁蛋白；将粗细胞壁蛋白进行硫酸铵沉淀，DEAE-琼 脂糖和葡聚糖G-75层析，得到蛋白Zea 1;将粗细胞壁蛋白进行硫酸铵沉淀， Phenyl-Superose HR 5/5和葡聚糖G-75层析，得到蛋白Zea 2;汽爆预处理稻草 的酶解在醋酸缓冲液(100mM,pH4.5)中，50°C下进行；在酶解体系中，每克滤 纸加入25 FPU木霉纤维素酶，240微克Zea 1和600微克Zea 2或4.5毫克粗细 胞壁蛋白。
权利要求
1. 一种利用秸秆细胞壁蛋白构建的高效纤维素酶解体系，其特征包括以下步骤1)秸秆细胞壁总蛋白的提取将秸秆置于1-2倍体积的研磨缓冲液中研磨，过滤后滤渣置于提取缓冲液中，然后过滤，液体即为细胞壁总蛋白，包括具有氢键断裂作用的蛋白Zea1、具有改变木质素结构的蛋白Zea2、(1，3)，(1，4)-β-葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖内切酶、木聚糖酶和果胶酶；2)蛋白Zea1、Zea2的分离、纯化将1)中得到的细胞壁总蛋白进行硫酸铵沉淀、DEAE-琼脂糖和葡聚糖G-75层析，得到蛋白Zea1，分子量为57.6kDa；将1)中得到的粗细胞壁蛋白进行硫酸铵沉淀、Phenyl-Superose HR5/5和葡聚糖G-75层析，得到蛋白Zea2，分子量为39.6kDa；3)利用细胞壁总蛋白酶解纯纤维素酶解在醋酸缓冲液(pH4.5)中，35-50℃下进行；在酶解体系中，每克底物加入1-2毫克粗细胞壁蛋白和10-30FPU木霉纤维素酶；4)利用蛋白Zea1酶解纯纤维素酶解在醋酸缓冲液(pH4.5)中，35-50℃下进行；在酶解体系中，每克底物加入100-200微克Zea1和10-30FPU纤维素酶；5)利用细胞壁总蛋白酶解木质纤维素酶解在醋酸缓冲液(pH4.5)中，35-50℃下进行；在酶解体系中，每克底物加入3-5毫克粗细胞壁蛋白和10-30FPU纤维素酶；6)利用蛋白Zea1、Zea2酶解木质纤维素酶解在醋酸缓冲液(pH4.5)中，50℃下进行；在酶解体系中，每克底物分别加入200-300微克Zea1、500-700微克Zea2和10-30FPU纤维素酶。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述秸秆细胞壁蛋白的来 源包括玉米秸、稻草、豆秸、高粱秸和麦秸。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的研磨缓冲液为醋酸缓冲液(pH 4.5-6.5), 0.5-1.5 mM EDTA。
4. 根据权利要求l所述的方法，其特征在于:所述的提取缓冲液为15-30 mM C8H18N204S， 1-3 mM EDTA, 2-4 mM Na2S205， 0.5-1.5 M NaCl,0.5-2 mM苯甲基磺酰氟，pH 4.5-7.0。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的纯纤维素包括滤 纸、微晶纤维素和废弃纸张;所述木质纤维素包括玉米秸秆、稻草、 麦秸、高粱秸、豆秸、龙须草以及茅草。
全文摘要
本发明提供了一种利用秸秆细胞壁蛋白构建高效纤维素酶系的方法及其在木质纤维素降解中的应用。以秸秆为原料，利用秸秆细胞壁中的植物内源性纤维素酶以及与纤维素酶具有协同作用的蛋白，构建了新型纤维素酶解体系。蛋白Zea 1能够通过打断底物中的氢键，提高纤维素酶的可及性；蛋白Zea 2能够改变木质素的结构，减少木质素对纤维素酶的无效吸附。木聚糖酶和果胶酶能够酶解非纤维素组分，提高纤维素的可及性。在木质纤维素的酶解中，添加秸秆细胞壁蛋白不仅能够大幅度提高纤维素的转化率，还能够降低纤维素酶添加量，达到了利用秸秆自身资源促进纤维素降解的目的。
文档编号C12P19/00GK101423853SQ200710176768
公开日2009年5月6日 申请日期2007年11月2日 优先权日2007年11月2日
发明者陈洪章, 韩业君 申请人:中国科学院过程工程研究所