专利名称：具有脱钙骨结构的多孔高分子生物支架材料的制备方法
技术领域：
本发明涉及具有脱钙骨结构的多孔高分子生物支架材料的制备方法，属生物材料领域。
背景技术：
多孔可降解高分子生物材料如聚α-羟基酸类的聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)，聚β-羟基烷酸酯(PHA)类的聚三羟基丁酯(poly3-hydroxybutyrate)(PHB)，聚三羟基戊酯(poly3-hydroxvalerate)(PHV)和聚三羟基丁酯-三羟基戊酯(PHBV)，以及聚己酸内酯(polycaprolactone)(PCL)，聚氨基甲酸酯类(polyurethanes)(PU)，聚丙烯酸-反式丁烯二酸(Polypropylene furmarate)(PPF)材料在组织损伤修复和作为组织工程细胞支架材料方面已经有许多研究和应用报道(Biomaterials，1998，19 1405-1412；J Biomed Mater Res，1996，30，475-84及J Biomed Mater Res 1993，27，1135-1148)。过去的研究显示，三维多孔细胞载体支架材料的三维结构、气孔率、孔径、孔的连通性及连通孔径都对细胞的植入、贴附、增殖、分化以及细胞外基质的构建有影响。而复杂多孔结构的材料的成型制备技术也是影响组织工程材料发展的关键之一。目前最常用的制备方法是溶剂浇铸/盐沥滤法是由Mikos等人(美国发明专利5514378)提出的。该技术使用氯化钠、糖类晶体等不溶于有机溶剂的颗粒作为致孔剂，可用于制备PLLA、PLGA等可溶于有机溶剂(如氯仿和二氯甲烷)的高分子聚合物多孔细胞支架。为了制备高孔隙率的支架，也有人采用近似立方形的粒子来制备(Biomaterials，2000，21，2443-2452)多孔支架，但此种方法严重影响支架的力学强度。
用溶剂浇铸/盐沥滤法可以制备出孔隙率高达95％的多孔膜和三维支架。其孔隙率可以通过控制致孔剂与聚合物溶液的比例调节，而孔隙的大小由致孔剂的几何尺寸控制。由于该技术具有这些优点，成为组织工程支架用多孔细胞支架的常用制备技术，广泛用于骨、软骨、神经、皮肤组织构建。但是，传统的溶液浇铸/粒子析出技术也存在一些不足之处，主要问题是孔的形态与所加致孔剂的形态相似，呈立方状体；孔隙间的相互连通程度不高、没有达到最适合细胞生长的三维多孔连通结构(Biomaterials，1998，19，4105)。此外，由于孔的连通性差，致孔剂在支架中有残余，导致支架的力学稳定性差，力学强度低。
动物和人体的松质骨主要由无机磷酸钙矿物晶体与有机的胶原蛋白复合而成。通过化学方法如采用盐酸溶液浸泡可以将无机组分溶去，留下多孔的有机三维多孔支架。这种去矿物支架(脱钙骨)具有优良的三维多孔结构、高的气孔率和孔连通性。过去的研究显示，脱钙骨的结构非常适合用于骨组织缺损修复和作为骨组织工程细胞支架。但是，异体骨和自体骨的来源非常有限，而且由于脱钙骨的主要组成是胶原蛋白，异种骨和异体骨来源的脱钙骨直接植入人体内有可能会产生免疫排斥反应。这些缺点大大限制了脱钙骨作为直接植入体应用的推广。
发明内容
本发明的目的在于提供一种按权利要求1或4所述具有脱钙骨结构的多孔高分子生物支架材料的制备方法，它是以骨为模板，采用可降解合成高分子材料制备具有脱钙骨三维结构的支架材料。该多孔支架材料不仅可以弥补脱钙骨来源不足的限制，而且可以避免任何的免疫排斥反应，在组织损伤修复和组织工程的研究和应用中具有广泛的应用前景。目前，具有脱钙骨多孔三维结构的高分子生物支架材料的制备及其性能研究还未见报道。所述的多孔支架不仅具有自然骨的有机部分的孔结构，而且具有足够的力学强度，可作为组织缺损修复材料和骨组织工程细胞支架材料，以满足新一代生物材料发展的需要。
本发明提出的一种具有脱钙骨多孔三维结构的多孔高分子生物支架材料的制备方法，其特征在于该方法包括以下几个步骤(1)制备骨模板取动物或人尸体关节部位的松质骨后，一种方法是在去离子水中浸泡2～3天，去掉血水，然后在40～100℃烘箱中干燥。将干燥后的松质骨放在炉中经800～1300℃保温2～4小时煅烧，升温速率2～3℃/min制得煅烧骨，它只具有松质骨的无机组分。另外一种方法是使用化学方法如用乙二胺浸泡松质骨48～72h，然后用流动的水和去离子水反复冲洗24～96h，冷冻干燥也可得上述同样的结果。
(2)所用的材料为高分子材料而且浇铸态为溶液状态。将高分子材料溶解在溶剂中，形成不同浓度的溶液。将方法1所得的骨模板浸泡在高分子材料溶液中，在室温下30～60分钟。浸泡结束后从溶液中取出浸泡物，置于通风橱中室温干燥24～72h，再在真空干燥箱中50～70℃干燥24～72h。
(3)干燥结束后，将骨模版与高分子的混合物浸泡在盐酸溶液中，室温48～72h，溶解掉骨模板后得到高分子支架，再将此支架用与盐酸浓度相当的浓度的NaOH溶液冲洗，然后用去离子水冲洗2～3次，最后在室温干燥即得本发明所述高分子支架。
本发明所用的高分子主要是生物降解型的，不过也可以用非生物降解型的高分子材料。生物降解型的主要由聚羟基羧酸酯(包括聚羟基乙酸、聚己乙酯等或其共聚物)、聚原酸酯、聚酸酐、或由它们组成的共聚物、共混物等。常用的非降解型的高分子主要包括聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚砜等具有一定生物相容性的材料。
本发明所用得制备骨模板的方法包括高温煅烧法和化学方法。
本发明所用的高分子的溶剂首先应对所用高分子不溶解，且不会改变高分子的性质。通常采用具有挥发性的有机溶剂，一般为氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基乙酰胺、1，4-而氧环六烷等。最佳溶剂为氯仿。
本发明所用的高分子溶液的浓度为2-30％(W/V)。
本发明所用的盐酸溶液的浓度为0.5-4mol/L。
本发明主要采用生物相容性高分子作为支架材料，从而可以减少或避免毒副反应的发生，能更好的符合医学应用要求。
利用本发明制备的多孔高分子支架材料具有与脱钙骨完全相同的三维多孔结构和气孔率，孔与孔之间完全连通。而且，由于其独特的三维结构使得本发明制备的材料与采用传统溶剂浇铸/盐沥滤法制备的具有相同气孔率的多孔支架材料相比具有更高的力学强度，材料的抗压强度达到100～500KPa，抗压摸量为0.5-5MPa。
通过下面的结合附图对本发明所做的详细说明，可以更好地理解本发明所述的技术方法。其中，图1为脱钙骨的光学显微镜照片；图2为采用10％聚乳酸(PDLLA)制备的具有脱钙骨结构的多孔支架光学显微镜照片。
具体实施例方式
本发明优异的特点和效果可从下列实施例来描述，但它们并不是对本发明作任何限制。
实施例1取动物或人尸体关节部位的松质骨，在去离子水中浸泡三天，去掉血水，然后在60℃烘箱中干燥。将干燥后的松质骨放在炉中经1100℃保温两小时煅烧，升温速率2℃/min制得煅烧骨。将分子量为七万的聚(D，L-乳酸)(PDLLA)溶解在三氯甲烷中制备出10％的聚乳酸溶液。在室温下将煅烧骨在聚乳酸溶液中浸泡30分钟。浸泡结束后从溶液中取出煅烧骨，置于通风橱中室温干燥24h，再在50℃真空干燥箱中干燥24h。干燥结束后，在室温下将此煅烧骨与聚乳酸的混合物在100ml 1mol/L的盐酸溶液中浸泡48h，溶解掉煅烧骨模板得到多孔支架，再将此支架用1mol/L的NaOH溶液冲洗，然后用去离子水冲洗三次，最后在室温干燥得到具有脱钙骨三维结构的聚(D，L-乳酸)支架。该支架的抗压强度可达210KPa，该支架材料适用于作为组织工程细胞支架材料，通过在该支架上植入成骨细胞或骨髓基质干细胞在体外或体内构建骨组织。
实施例2采用按实施例1描述的方法制备的煅烧骨。将分子量为五万的聚乙醇酸(PGA)溶解在三氯甲烷中制备出15％的聚乙醇酸溶液。在室温下将煅烧骨在聚乙醇酸溶液中浸泡30分钟。浸泡结束后从溶液中取出煅烧骨，置于通风橱中室温干燥24h，再在50℃真空干燥箱中干燥24h。干燥结束后，在室温下将此煅烧骨与聚乙醇酸的混合物在100ml 4mol/L的盐酸溶液中浸泡48h，溶解掉煅烧骨模板得到多孔支架，再将此支架用4mol/L的NaOH溶液冲洗，然后用去离子水冲洗三次，最后在室温干燥得到具有脱钙骨三维结构的聚乙醇酸支架。该支架的抗压强度可达180KPa，该支架材料适用于作为组织工程细胞支架材料，通过在该支架上植入成骨细胞或软骨细胞在体外或体内构建骨或软骨组织。
权利要求
1.一种具有脱钙骨结构的多孔高分子生物支架材料的制备方法，其特征在于具体步骤是(1)采用天然骨除去松质骨的有机成分制成骨模板；(2)高分子材料溶于有机溶剂，骨模板浸泡在高分子溶液中，浸泡结束后从溶液中取出浸泡物，干燥；(3)干燥后用盐酸溶液除去骨模板，得到高分子支架。
2.按权利要求1所述具有脱钙骨结构的多孔高分子生物支架材料的制备方法，其特征在于可采用下面二种方法中任意一种除去松质骨的有机成分制备骨模板(1)高温煅烧方法是取动物或人尸体关节部位的松质骨，在去离子水中浸泡2-3天，去掉血水，然后在40-100℃烘箱中烘干，再在800-1300℃经2-4小时煅烧；(2)化学方法是用乙二胺浸泡松质骨48-72h，然后用水和去离子水反复冲洗24-96h，冷冻干燥。
3.按权利要求1所述具有脱钙骨结构的多孔高分子生物支架材料的制备方法，其特征在于高温煅烧的升温速率为2-3℃/min。
4.按权利要求1所述具有脱钙骨结构的多孔高分子生物支架材料的制备方法，其特征在于所述的生物降解性的高分子为聚羟基羧酸酯、聚原酸酯、聚酸酐、或由它们所组成的共聚物、共混物中的任一种；所述的非生物降解性的高分子为聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇或聚砜材料中一种所述的溶剂为氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基乙酰胺或1，4-而氧环六烷中的任何一种；高分子溶液的浓度为2-30％(W/V)。
5.按权利要求1或4所述具有脱钙骨结构的多孔高分子生物支架材料的制备方法，其特征在于骨模板浸泡在高分子材料溶液中是室温下30-60分钟。
6.按权利要求1或4所述具有脱钙骨结构的多孔高分子生物支架材料的制备方法，其特征在于骨模板浸泡在高分子溶液结束后，先室温干燥24-72小时，再在50-70℃干燥24-72小时。
7.按权利要求1或4所述具有脱钙骨结构的多孔高分子生物支架材料的制备方法，其特征在于所述的盐酸溶液的浓度为0.5-4mol/L。
8.按权利要求1或4所述具有脱钙骨结构的多孔高分子生物支架材料的制备方法，其特征在于干燥后骨模板和高分子的混合物浸泡在盐酸溶液中的时间为48-72小时，浸泡结束后再将此支架用相应浓度的NaOH溶液冲洗和去离子水冲洗2-3次，室温干燥。
9.按权利要求1所述具有脱钙骨结构的多孔高分子生物支架材料的制备方法，其特征在于所制备的多孔高分子生物支架材料是用作组织缺陷修复材料或组织细胞支架材料。
全文摘要
本发明涉及具有脱钙骨结构的多孔高分子生物支架材料的制备方法，属生物材料领域。本发明以除掉有机成分的松质骨为骨模板，将高分子材料溶于有机溶剂，然后浇注到骨模板内。干燥后再采用盐酸溶液将骨模板溶去，可以得到与天然松质骨有机组分三维多孔结构相同的高分子支架材料。采用此法制备的多孔支架材料具有比常规的盐沥滤法更高的力学强度、孔隙率和更多的连通孔。采用本发明制备的多孔支架材料适用作组织缺损修复材料和组织工程细胞支架材料。本发明工艺简单易行且便于推广。
文档编号C08J9/26GK1546179SQ20031010937
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月12日 优先权日2003年12月12日
发明者常江, 李海燕, 常 江 申请人:中国科学院上海硅酸盐研究所