专利名称：阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的制备方法
技术领域：
本发明是关于阿拉伯半乳聚糖硫酸酯(Arabinogalactan Sulfate，简写AGS)的一种制备及纯化方法。
背景技术：
a.阿拉伯半乳聚糖免疫活性技术的背景阿拉伯半乳聚糖(Arabinogalactan，简写AG)是从树木和植物中获得的一种重要的生物活性多糖，具有水溶性和生物可利用性。阿拉伯半乳聚糖有明显提高肌体免疫抗原中单核细胞、巨噬细胞、T细胞和自然杀伤细胞的免疫反应活性，激发免疫抗原产生非特异性的细胞杀伤作用，并诱导体内产生内源性干扰素IFN和肿瘤坏死因子TNF。阿拉伯半乳聚糖和特异性凝集素受体结合作为具有潜在疗效的免疫促进剂，可用于控制各种肿瘤引起的胸水、腹水，也可用于肺癌、肝癌、食道癌、膀胱癌、恶性淋巴瘤、晚期胃癌和黑色素瘤的治疗。阿拉伯半乳聚糖已经通过美国药品和食品监督委员会(FDA)的批准，广泛应用在医药、食品、化妆品等多个行业。
b.阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的研发背景兴安落叶松(Larix gmelinii Rupr.)木材中含有大量的阿拉伯半乳聚糖(10-25％)，落叶松是东北林区的主要树种，木材及加工剩余物不仅污染环境，且浪费资源，因此阿拉伯半乳聚糖衍生物是一类制备原料来源丰富、产品成本低的高科技含量、高价值的天然生物制品。此外，在自然界中一些天然的多糖硫酸酯有抗艾滋病病毒(HIV)、抗肿瘤、抗凝血等生物活性功能，据报道有些不具生物活性的天然多糖采用化学方法合成其硫酸酯的衍生物后表现出抗病毒活性，目前人工合成多糖硫酸酯获得抗病毒、抗肿瘤的新型药物的研究，已受到人们的广泛关注。采用氯磺酸-吡啶法、氯磺酸-N，N-二甲基甲酰胺法、三氧化硫—吡啶法等可制备人工合成的多糖硫酸酯衍生物。本研究通过磺化反应得到一定酯化度的阿拉伯半乳聚糖硫酸酯，目的是通过引入硫酸基团形成多糖硫酸酯结构，以强化阿拉伯半乳聚糖的免疫功效。
发明内容
本发明以由兴安落叶松提取的阿拉伯半乳聚糖为原料，其主链的基本结构单元是1，3连接的β-D半乳糖且其6位连接着以L-阿拉伯糖为主的侧链。本发明采用三氧化硫—吡啶复合物与阿拉伯半乳聚糖主要在半乳糖单元中C2和C4位的醇羟基以及阿拉伯糖单元中C2和C5位醇羟基发生磺化反应。在阿拉伯半乳聚糖母体上引入了水溶性的硫酸根基团，制备了阿拉伯半乳聚糖硫酸酯，其结构示意式为AG-SO4R；其合成路径见附图1。本发明提供了阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的制备法，其特征在于在三口瓶中加入自制的磺化试剂和溶剂，搅拌形成清液，加入自制阿拉伯半乳聚糖，恒温搅拌，直至形成悬浊液。设置反应温度及时间，然后加入预冷的蒸馏水冷却至室温，用碱中和至pH＝6.0～7.5，中和用的碱性试剂可以用NaOH、KOH、K2CO3和KHCO3等。经透析、冷冻干燥的纯化过程，得到淡黄色粉末，形成阿拉伯半乳聚糖硫酸酯。
本发明制备方法中所述多糖硫酸酯的磺化方法可以采用氯磺酸-N，N-二甲基甲酰胺法、浓硫酸法、三氧化硫-吡啶法和氯磺酸吡啶法等。磺化试剂可以是浓硫酸、哌啶-N-磺酸、氯磺酸、三氧化硫-吡啶的配合物等。除上述磺化试剂外，本制备方法使用氯磺酸-N，N-二甲基甲酰胺法，并加入吡啶改良磺化试剂，该磺化试剂于-20℃下封存，可以保存一周。
本发明首次合成了阿拉伯半乳聚糖硫酸酯，以硫酸根平均取代度表示阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的酯化程度。上述硫酸根平均取代度是指每克阿拉伯半乳聚糖硫酸酯中含有硫酸根基团的质量百分含量。硫酸根基团的质量是使用1mol/L的盐酸水解阿拉伯半乳聚糖硫酸酯，采用外标法建立浊度-硫酸根浓度的工作曲线，对阿拉伯半乳聚糖硫酸酯所含硫酸根进行定量。产率是指阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的质量占原料阿拉伯半乳聚糖的质量百分数。
本发明纯化过程阿拉伯半乳聚糖原料主要成份分子量在6,000Da-200,000Da的特点，将透析技术应用于阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的纯化过程，将反应体系中的小分子一次性去处，缩短阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的分离流程，简单易行。发明纯化过程中所述透析技术采用的是截流分子量为6,000Da-14,000Da的透析袋。
本发明制备的阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的特征在于1)本方法制备阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的原料是由兴安落叶松提取的水溶性阿拉伯半乳聚糖。2)阿拉伯半乳聚糖硫酸酯是通过磺化反应机理在阿拉伯半乳聚糖中引入了水溶性的硫酸根基团。3)阿拉伯半乳聚糖硫酸酯是人工合成的一种多糖硫酸酯衍生物。4)阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的结构示意式为AG-SO4-R，R1-Na；R2-K；R3-H。5)采用硫酸根平均取代度表示阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的酯化程度。
本发明的优点1)首次合成了阿拉伯半乳聚糖硫酸酯。2)采用透析技术将产物阿拉伯半乳聚糖硫酸酯与氯磺酸、N，N-二甲基甲酰胺、吡啶等小分子一次性分离，简化了分离步骤。3)引入水溶性硫酸根基团，形成多糖硫酸酯结构，强化阿拉伯半乳聚糖的免疫功效。
附图1 阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的合成路径附图2 阿拉伯半乳聚糖硫酸酯与阿拉伯半乳聚糖的红外对照图附图3 阿拉定伯半乳聚糖硫酸酯的GPC图具体实施方式
实例1在带有搅拌装置和冷凝装置的三口烧瓶中加入预冷的0.25ml无水吡啶，将烧瓶置于冰水浴中，逐滴加入0.25ml氯磺酸，剧烈搅拌，生成淡黄色固体。此时在三口瓶中加入30ml的无水N，N-二甲基甲酰胺，搅拌形成淡黄色清液，再加入阿拉伯半乳聚糖0.5g，室温下搅拌30min，形成悬浊液。设定反应温度为65℃，时间为60min，然后加入预冷的50ml蒸馏水冷却至室温，用NaOH中和至pH＝7.5。经透析、冷冻干燥的纯化过程，得到乳白色粉末即为阿拉伯半乳聚糖硫酸酯，其硫酸根平均取代度14.92％，产率85.38％。
实例2在带有搅拌装置和冷凝装置的三口烧瓶中加入预冷的0.5ml无水吡啶，将烧瓶置于冰水浴中，逐滴加入0.5ml氯磺酸，剧烈搅拌，生成淡黄色固体。此时在三口瓶中加入30ml的无水N，N-二甲基甲酰胺，搅拌形成淡黄色清液，再加入阿拉伯半乳聚糖0.5g，室温下搅拌30min，形成悬浊液。设定反应温度为95℃，时间为60min，其余操作同实例1，得到黄色粉末即为阿拉伯半乳聚糖硫酸酯，其硫酸根平均取代度59.78％，产率85.34％。
实例3在带有搅拌装置和冷凝装置的三口烧瓶中加入预冷的5ml无水吡啶，将烧瓶置于冰水浴中，逐滴加入5ml氯磺酸，剧烈搅拌，生成淡黄色固体。此时在三口瓶中加入30ml的无水N，N-二甲基甲酰胺，搅拌形成淡黄色清液，再加入阿拉伯半乳聚糖0.5g，室温下搅拌30min，形成悬浊液。设定反应温度为85℃，时间为30min，其余操作同实例1，得到黄色粉末即为阿拉伯半乳聚糖硫酸酯，其硫酸根平均取代度21.66％，产率53.68％。
实例4在带有搅拌装置和冷凝装置的三口烧瓶中加入预冷的5ml无水吡啶，将烧瓶置于冰水浴中，逐滴加入5ml氯磺酸，剧烈搅拌，生成淡黄色固体。此时在三口瓶中加入30ml的无水N，N-二甲基甲酰胺，搅拌形成淡黄色清液，再加入阿拉伯半乳聚糖0.5g，室温下搅拌30min，形成悬浊液。设定反应温度为85℃，时间为75min。其余操作同实例1，得到黄色粉末即为阿拉伯半乳聚糖硫酸酯，其硫酸根平均取代度28.22％，产率88.1％。
实例5对实例1中阿拉伯半乳聚糖进行部分理化性质测定。阿拉伯半乳聚糖硫酸酯各元素含量C31.97％，H5.35％，S4.05％，O58.64％。阿拉伯半乳聚糖原料各元素含量C42.074％，H6.332％，S0％O，53.594％。与阿拉伯半乳聚糖红外谱图对比，其唯一显著差异是在1255.24cm-1处有强S＝O键的伸缩振动特征峰，见附图2。阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的分子量分布范围为6,000Da-200,000Da，其重均分子量为6.45×104Da，数均分子量为1.02×104Da，分散系数为6.36，详见附图3。
实例6在带有搅拌装置和冷凝装置的三口烧瓶中加入预冷的0.5ml无水吡啶，将烧瓶置于冰水浴中，逐滴加入0.5ml氯磺酸，剧烈搅拌，生成淡黄色固体。此时在三口瓶中加入30ml的无水N，N-二甲基甲酰胺，搅拌形成淡黄色清液，再加入阿拉伯半乳聚糖0.5g，室温下搅拌30min，形成悬浊液。设定反应温度为85℃，时间为60min，然后加入预冷的50ml蒸馏水冷却至室温，用KOH中和至pH＝7.5。得到黄色粉末即为阿拉伯半乳聚糖硫酸钾盐酯，其硫酸根平均取代度15.46％，产率82.44％。
权利要求
1.本发明制备的阿拉伯半乳聚糖硫酸酯，其特征是在阿拉伯半乳聚糖分子中引入了硫酸根基团。其结构示意式为AG-SO4-R，R1-Na；R2-K；R3-H。
2.权力要求1所述阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的制备方案，其过程的特征包括如下步骤在三口瓶中加入自制的磺化试剂和溶剂，搅拌形成清液，加入自制阿拉伯半乳聚糖，恒温搅拌，直至形成悬浊液。设置反应温度及时间，然后加入预冷的50ml的蒸馏水冷却至室温，用碱中和至pH＝6.0～7.5。经透析、冷冻干燥的纯化，得到淡黄色粉末即为阿拉伯半乳聚糖硫酸酯。
3.权力要求1所述阿拉伯半乳聚糖硫酸酯，以硫酸根平均取代度表示阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的酯化程度。上述硫酸根平均取代度是指每克阿拉伯半乳聚糖硫酸酯中含有硫酸根的质量百分含量。
4.权力要求2所述透析过程目的是将阿拉伯半乳聚糖硫酸酯与反应体系中小分子的溶剂及磺化试剂分离，将反应体系中的小分子一次性除去，减少阿拉伯半乳聚糖硫酸酯的纯化步骤。发明纯化过程中所述透析技术采用的是截流分子量为6,000Da左右的透析袋。
5.权力要求2所述多糖硫酸酯的磺化方法可以采用氯磺酸-N，N-二甲基甲酰胺法、浓硫酸法、三氧化硫-吡啶法和氯磺酸吡啶法等。中和用的碱性试剂可以用NaOH、KOH、K2CO3和KHCO3等。
6.权力要求3所述磺化试剂可以是浓硫酸、哌啶-N-磺酸、氯磺酸、三氧化硫-吡啶的配合物等。除上述磺化试剂外，本制备方案使用氯磺酸-N，N-二甲基甲酰胺法，并加入吡啶改良磺化试剂，该磺化试剂于-20℃下封存，可以保存一周。
全文摘要
本发明公开阿拉伯半乳聚糖硫酸酯(Arabinogalactan Sulfate，简写AGS)的一种制备方法。本发明的原料是由兴安落叶松提取的具有免疫作用的阿拉伯半乳聚糖，其主链的基本结构单元是1，3连接的β－D半乳糖且其6位连接着以L－阿拉伯糖为主的侧链。采用作用较为缓和的三氧化硫－吡啶复合物，主要与原料半乳糖单元中C
文档编号C08B37/00GK101054420SQ200610010479
公开日2007年10月17日 申请日期2006年9月1日 优先权日2006年9月1日
发明者方桂珍, 马艳丽 申请人:东北林业大学, 方桂珍, 马艳丽