专利名称：：高抑菌活性ε-聚-L-赖氨酸组分的制备方法
技术领域：
：本发明属于生物化工
技术领域：
，尤其是一种高抑菌活性e-聚-L-赖氨酸组分的制备方法。
背景技术：
：e-聚-L-赖氨酸(e-poly-L-lysine，简称e-PL)是由白色链霉菌等菌种生物合成的一种氨基酸同型聚和物，是由单体L-赖氨酸的e-氨基和另一单体L-赖氨酸的a-羧基形成的酰胺键连接而成。e-PL水溶性好，微溶于乙醇，热稳定性高，抑菌谱广，能够抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、耐热芽孢杆菌及病毒的活性，在人体内分解为L-赖氨酸。L-赖氨酸是人体必须的八种氨基酸之一，因此是一种安全高效的天然生物防腐剂。此外，"PL还可用做基因运输载体、药物包被材料、电子材料，环保材料等，具有十分广泛的应用前景。近年来，随着菌种性能的改造和发酵调控手段的改进，e-PL的发酵生产效率不断的提高。目前，我国公布的有关e-PL生产的主要专利有1.2000年7月12日，国家知识产权局公布了日本国岩田敏志等人在中国申请的名称为"大量产生e-聚-L-赖氨酸的菌株和生产方法"的发明专利，专利号为971S2253.0。此专利提供一种较常规的提高菌株e-PL的生成能力以及大规模生产e-PL的方法。2.2005年11月16日，国家知识产权局公布了由南京工业大学申请的"利用北里孢菌PL6-3制备e-PL及其盐的方法"发明专利，申请号为200510037774.2。该专利提出了一种通过筛选获得的北里孢菌PL-3发酵生产e-PL的方法。3.2007年11月28日，国家知识产权局公布了由申请人自己申请的"回流工艺生产e-聚-L-赖氨酸的方法"发明专利，申请号为200610013800.2。该专利提出了一种回流工艺生产e-PL的方法，即在e-PL的发酵过程中，将提取过程的后期穿透液作为流加液，进行流加发酵生产e-PL。后期穿透液作为流加液使用，提高了e-PL的产率，减少了发酵废液和洗脱用盐酸废液的排放，减轻了环境兀然。2007年4月9日，申请人在已有专利的基础上继续申请了"一种大量产生e-1^的诱变菌株白色链霉菌1!^丁2及利用该诱变菌株11;8丁2采用发酵法生产"PL及其盐的方法"的发明专利，申请号200710057098.4。该专利利用从我国海南省土壤中筛选、诱变并鉴定的e-PL的生产菌株白色链霉3菌TUST2(CGMCCNo.1986)发酵生产s-PL，产量在1030g/L。已有研究表明，微生物发酵生产的e-PL分子量分布范围较广，不同聚合度的e-PL有着不同的理化性质和用途；另外，e-PL分子量不同，它的抑菌效果有很大差别。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高抑菌活性e-聚-L-赖氨酸组分的制备方法，该方法将现有工艺生产的e-PL按照不同分子量(不同聚和度)进行分级处理，并收集具有高抑菌活性的e-PL组分。本发明的技术方案是一种高抑菌活性e-聚-L-赖氨酸组分的制备方法，其制备方法的步骤是(1).将e-PL发酵液经离心去除菌体和蛋白后，通过脱色得到e-PL滤液；(2).将e-PL滤液加入到事先组装好的各种截留分子量的微滤、超滤和纳滤膜组合分离装置中，进行分离并分别获得各种分子量分布的e-PL组分滤液；(3).验证e-PL滤液分子量范围在2KDa5KDa内，并通过浓缩、低温冷冻干燥或喷雾干燥得到高抑菌活性的e-PL产品。而且，所述滤膜的材质为聚砜、聚酰胺、细菌纤维素、再生纤维素或者其他适宜pH值在214的滤膜，其微滤膜的孔径为0.2Pm，超滤和纳滤膜的截留分子量分别为25KDa、10kDa、5kDa、2kDa、lkDa，采用微滤、超滤和纳滤膜组合分离装置进行分离纯化。而且，所述过滤分级处理的工作压力可在0.051.0MPa，发酵液过滤的pH为中性，温度为2040。C。本发明的优点和积极效果是本发明对e-聚-L-赖氨酸按分子量大小进行膜组合技术分级处理，通过抑菌实验来确定具有高抑菌活性的分子量部分，从而制备具有高抑菌活性的合适分子量分布的s-聚-L-赖氨酸产品。应用本发明的方法可以获得不同分子量范围的高纯度的e-PL滤液，由于采用的是膜分离技术，不会对e-PL的活性产生任何影响，而且有利于各种不同分子量的e-PL的研究。具体实施例方式下面结合实施例对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。需要说明的是，本发明发酵液是按照"回流工艺生产e-聚-L-赖氨酸的"专利中的方法制备的，所用菌种为"一种大量产生"PL的诱变菌株链霉菌TUST2及利用该诱变菌株TUST2采用发酵法生产e-PL及其盐法"专利中的菌种。法色方方白的本发明所用滤膜的材质可以为聚砜、聚酰胺、细菌纤维素、再生纤维素或者其他适宜pH值在214的滤膜，微滤膜的孔径为0.2um，超滤和纳滤膜的截留分子量分别为25KDa、10kDa、5kDa、2kDa、lkDa，采用微滤、超滤和纳滤膜组合分离装置进行分离纯化。本发明过滤分级处理的工作压力可在0.051.0MPa，发酵液过滤的pH为中性，温度为25'C。本发明收集抑菌活性最高的分子量段为2KDa5KDa的e-PL溶液，经喷雾干燥或冷冻干燥制成e-PL产品，用做食品防腐剂。下面给出具体实施例方式实施例1-含量20g/Le-PL发酵液离心分离菌体，经脱色后所得溶液即可进行膜组合分离装置分离。取2000mle-PL滤液，逐级经过0.2ym微滤膜、25KDa、lOKDa、5KDa、2KDa，lKDa超滤膜和纳滤膜。其中微滤的操作压力为0.05MPa，截留分子量为25KDa、lOKDa、5KDa的超滤膜的操作压力为0.15MPa，截留分子量为2KDa的超滤膜的操作压力为0.2MPa，lKDa的纳滤膜的操作压力为0.7旨a。微滤膜对e-PL滤液的截留率为O，透过液体积约为2000ml;通过25KDa超滤膜之后，透过液与浓縮液的体积比约为10:1;通过10KDa超滤膜之后，透过液与截留液的体积比约为7:1;通过5KDa超滤膜之后，透过液与截留液的体积比约为7:1;通过2KDa超滤膜之后，透过液与截留液的体积比约为2:1;最后通过lKDa纳滤膜之后，透过液与浓缩液的体积比约为1:1。然后针对各个不同组分做抑菌实验。通过抑菌实验验证的结果(见附表l)，得出抑菌效果最好的分子量段为2KDa5KDa,收集这一部分的溶液，进行浓縮经冷冻干燥制成高抑菌活性e-PL产品。实施例2:e-PL产品粉末配置成20g/L溶液2L(pH为中性，温度为25°C)，再依次通过微滤、超滤和纳滤组合膜分离装置进行膜过滤分离。其中微滤的操作压力为0.1MPa，截留分子量为25KDa、lOKDa、5KDa的超滤膜的操作压力为0.2MPa，截留分子量为2KDa的超滤膜的操作压力为0.25MPa，lKDa的纳滤膜的操作压力为lMPa。上述2000ml的e-PL溶液完全透过微滤膜；之后，通过25KDa超滤膜,透过液与截留液的体积比约为10:1;再通过10KDa超滤膜，透过液与截留液的体积比约为8:1;然后通过5KDa超滤膜之后，透过液与截留液的体积比约5为7:1;接着通过2KDa超滤膜，透过液与截留液的体积比约为2:1;最后通过lKDa纳滤膜之后，透过液与截留液的体积比约为1:1。然后针对各个不同组分做抑菌实验。通过抑菌实验结果，即可得出抑菌效果最好的分子量段为2KDa5KDa，收集这一部分的溶液，进行浓縮后经冷冻干燥制成高抑菌活性e-PL产品。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求1.一种高抑菌活性ε-聚-L-赖氨酸组分的制备方法，其特征在于制备方法的步骤是(1).将ε-PL发酵液经离心去除菌体和蛋白后，通过脱色得到ε-PL滤液；(2).将ε-PL滤液加入到事先组装好的各种截留分子量的微滤、超滤和纳滤膜组合分离装置中，进行分离并分别获得各种分子量分布的ε-PL组分滤液；(3).验证ε-PL滤液分子量范围在2KDa～5KDa内，并通过浓缩、低温冷冻干燥或喷雾干燥得到高抑菌活性的ε-PL产品。2.根据权利要求1所述的高抑菌活性e-聚-L-赖氨酸组分的制备方法，其特征在于所述滤膜的材质为聚砜、聚酰胺、细菌纤维素、再生纤维素或者其他适宜pH值在214的滤膜，其微滤膜的孔径为0.2ym，超滤和纳滤膜的截留分子量分别为25KDa、10kDa、5kDa、2kDa、lkDa，采用微滤、超滤和纳滤膜组合分离装置进行分离纯化。3.根据权利要求1所述的高抑菌活性e-聚-L-赖氨酸组分的制备方法，其特征在于所述过滤分级处理的工作压力可在0.051.0Mpa，发酵液过滤的pH为中性，温度为204(TC。全文摘要本发明涉及一种高抑菌活性ε-聚-L-赖氨酸(ε-PL)组分的制备方法，是采用微虑、超滤和纳滤组合多级分离技术获取不同分子量分布的ε-PL，经抑菌实验确定最佳抑菌活性组分分子量范围，进而收集干燥获得高抑菌活性组分ε-PL产品。应用本发明的方法可以获得不同分子量范围的高纯度的ε-PL，由于采用的是膜分离技术，不会对ε-PL的活性产生任何影响，而且有利于各种不同分子量的ε-PL的研究。文档编号C08G69/00GK101486794SQ200810153709公开日2009年7月22日申请日期2008年12月3日优先权日2008年12月3日发明者斌周,沈颜新,范宝庆,谭之磊,贾原媛,贾士儒申请人:天津科技大学;浙江银象生物工程有限公司