专利名称：羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料及其制备方法，属于生物医学材料领域。
背景技术：
骨缺损的修复一直是几个世纪以来人们不断深入研究的重点课题，随着生物医学和组织工程研究的不断进步，组织工程支架材料的研究备受科研人员的关注。目前，羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HAP)，作为人体和动物骨骼、牙齿的主要无机成分，具有良好的生物活性和生物相容性，被认为是一种最具潜力的人体硬组织替换材料。但其本身力学性能差、强度低、脆性大，限制了它在医学临床上的应用。为了更接近人体骨骼的力学要求，人们试图通过各种途径引入其他物质，制备更为理想的羟基磷灰石复合生物材料，以模拟人体自然骨结构和功能，以期达到更好的医学应用价值。人们已经利用纤维复合法、电化学沉积法等方法制备出聚乳酸、聚集内酯、聚乙交酯、聚乙烯、细菌纤维素、壳聚糖、明胶、胶原等众多的羟基磷灰石复合的高分子组织工程支架。与上述生物高分子相比，透明质酸(Haluronic acid, HA)是构成细胞外基质、细胞间质和细胞周基质的主要成分。对于维持细胞和组织的结构完整，为细胞提供良好内环境有着重要的作用，从而影响着细胞的生理功能。同时它参与构成蛋白糖聚糖聚合体，在生理状态下，HA与其他糖胺聚糖(如硫酸软骨素、硫酸角质素等)协同连接到核心蛋白上，构成蛋白聚糖聚合体。由于透明质酸易分解，故商品化的透明质酸一般为其钠盐，即透明质酸钠 (Sodium Hyaluronate，SH) Pilloni等发现，低分子SH在体外可促进间质细胞的转移和分化，对骨的生成有促进作用。尽管高分子SH在体外对骨的形成没有明显的促进作用， 但Msaki等认为，高分子SH在体内可通过降解成低分子SH而发生作用，且高分子SH具有易于在用药局部存留的优点。Lisignoli等用非织物性透明质酸苯甲酯聚合物HYAFF-Il支架承载预先受碱性成生长因子(bFGF)刺激的BMSCs，并植入大部分绕骨缺损的大鼠体内， 发现其可以显著促进骨的再生和加速骨的矿化。透明质酸钠的分子中含有大量的羟基、羧基和乙酰氨基，具有强的吸水性，良好的生物相容性和生物降解性。以上这些性质决定了透明质酸钠具有较好的生物学特性，其在组织工程材料领域具有独特的应用价值。魔芋葡甘聚糖(Konjac glucomarman，KGM)是一种pH敏感性多糖，可以通过调节系统的PH值来控制KGM的凝胶产生时间和凝胶度，这种特性对控制KGM的机械性能、生物降解性能及其与其他材料的复合性能非常有利。此外，由于KGM是支链高分子，比直链高分子(如纤维素、壳聚糖)可获得更高的交联度，因此相同条件下KGM的力学强度更高。除上述特点外，如同其他在生物材料领域广泛应用的生物多糖(如纤维素、壳聚糖、明胶和丝蛋白等)，KGM可获得孔结构丰富且孔径可调的三维网状结构，具有良好的持水能力、生物相容性和降解性。因此KGM具有优良的成型性能和力学性能。通过和HAP的复合可以改善 HAP成型性和力学强度差的缺点。此外，KGM与透明质酸钠的微观结构、理化性质十分相似，故能与透明质酸钠很好地复合，并且由于KGM来源广，成本低廉。鉴于此，本发明首次制备了羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料。相比于其他羟基磷灰石复合材料，该材料不仅具有仿生的特点，而且具有良好的力学性能和生物活性。这种在聚集态结构和性能上均与自然骨接近的支架材料将在骨修复领域具有很高的临床应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供了以羟基磷灰石(HAP)、透明质酸钠(SH)、魔芋葡甘聚糖(KGM)三种生物材料的多孔支架材料及其制备方法。本发明的技术方案是羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料，是由羟基磷灰石、透明质酸钠、魔芋葡甘聚糖三种材料组成的多孔支架复合材料，羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖的质量比为1 170 :1 20 :160 200。本发明提供的羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料制备方法，是将透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖复合，用交联剂先制得透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖支架材料， 进而利用仿生矿化的方法制备羟基磷灰石/透明质酸钠/魔芋葡甘聚糖支架材料。具体制备步骤为
(1)按透明质酸钠与水的质量比为1:2000 1:400，将透明质酸钠溶于水中，搅拌使其充分溶解，然后将碱性溶液加入溶液中；
(2)交联按透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖的质量比1:200 8，将魔芋葡甘聚糖加入步骤(1)得到的产物中，搅拌至凝胶状态；
(3)将步骤(2)得到的产物密封后在温度为50°C 90°C的水浴中熟化12 48h，将产物取出，然后将水浴温度降至15°C 50°C，再将产物放入水浴中脱碱直至产物溶液pH值为 7 ；取出材料，在温度为-10°C _40°C条件下低温冷冻和干燥Ih 48h，制得SH/KGM多孔支架材料；
(4)预钙化将SH/KGM多孔支架材料浸入温度为36.5 37. 5°C的钙离子溶液中1 4天，每24h更换一次钙离子溶液；
(5)将(4)步骤得到的产物取出，浸入温度为36.5 37. 5°C的模拟体液(SBF)溶液中 1 16天，每24h更新一次SBF ；然后将产物取出，水浴12 36h，洗去支架上残留的SBF溶液中的离子；最后将材料取出，在温度为-10°C -40°C条件下低温冷冻和干燥Ih 48h， 制得HAP/SH/KGM多孔支架材料。所述步骤(1)中，碱性溶液为浓度为0. 1 lvol%的ΝΗ3·Η20或浓度为0. 1 lvol% 的NaOH溶液，加入量按碱性溶液与水的体积比为1:800 1:80。所述步骤(3)中制得的SH/KGM多孔支架材料，在103. 4kPa (1. 05kg/cm2)蒸汽压下，温度达到121. 3°C，高压灭菌进行消毒后备用。所述步骤(4)的钙离子溶液为浓度为0. 05 0. 2摩尔/升的Ca(OH)2或Ca(NO3)2 或CaCl2溶液。所述步骤(5)中的水浴温度为15°C 90°C。所述步骤(5)中的SBF溶液中各离子的浓度为Na+ 213mmol/L、K+ 7. 5mmol/L、Mg2+ 2. 25mmol/L、Ca2+ 3. 75mmol/L、C1- 221. 7mmol/L、HCO3- 6. 3mmol/L、HP0[ 1. 5mmol/L、SO:0.75mmol/L。本发明的优点与积极效果
(1)本发明使用透明质酸钠作为原料，透明质酸钠对骨生长具有促进作用；
(2)本发明具有独特结构的羟基磷灰石沉积层，且羟基磷灰石沉积层提高了支架材料的力学性能，透明质酸钠的引入，有利于细胞的生长和繁殖，满足骨组织工程支架的要求；
(3)本发明的未使用任何有毒药品，安全无毒性；
(4)本发明在常压下即可完成材料的制备，工艺简单。
图1为本发明HAP/HA/KGM多孔支架材料的制备流程图。
具体实施例方式以下结合附图和实施例，对本发明做进一步阐述，但本发明的保护范围不限于所述内容。实施例1 参见图1，本羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料的制备方法是
(1)按透明质酸钠与水的质量比为1:2000，将透明质酸钠溶于水中，搅拌使其充分溶解，然后将碱性溶液加入溶液中；碱性溶液为浓度为0. lvol%的NH3 · H2O溶液，加入量按碱性溶液与水的体积比为1:800。(2)交联按透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖的质量比1:8，将魔芋葡甘聚糖加入步骤 (1)得到的产物中，搅拌至凝胶状态。(3)将步骤(2)得到的产物密封后在温度为90°C的水浴中熟化12h，将产物取出， 然后将水浴温度降至15°C时，再将产物放入水浴中脱碱直至产物溶液PH值为7;取出材料， 在温度为_30°C条件下低温冷冻和干燥Mh，制得SH/KGM多孔支架材料。(4)预钙化将SH/KGM多孔支架材料浸入温度为37°C的钙离子溶液中4天，每24h 更换一次钙离子溶液。(钙离子溶液为浓度为0. 1摩尔/升的Ca(OH)2溶液)
(5)将(4)步骤得到的产物取出，浸入温度为37°C的模拟体液(SBF)溶液中8天，每 24h更新一次SBF ；然后将产物取出，在温度为90°C的条件下，水浴12h，洗去支架上残留的 SBF溶液中的离子；最后将材料取出，在温度为-10°C条件下低温冷冻和干燥lh，制得HAP/ SH/KGM 多孔支架材料。(SBF 溶液Na+ 213mmol/L、K+ 7. 5mmol/L、Mg2+ 2. 25mmol/L、Ca2+ 3. 75mmol/L、C1- 221. 7mmol/L、HCO3- 6. 3mmol/L、HPO4- 1. 5mmol/L、SO广 0. 75mmol/L。)
经上述过程所得羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料的组分是羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖的质量比为110 20 :160。实施例2 参见图1，本羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料的制备方法是
(1)按透明质酸钠与水的质量比为1:667，将透明质酸钠溶于水中，搅拌使其充分溶解， 然后将碱性溶液加入溶液中；碱性溶液为浓度为0. Svo 1%的NH3 ·H2O,加入量按碱性溶液与水的体积比为1:500。(2)交联按透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖的质量比1:25，将魔芋葡甘聚糖加入步骤(1)得到的产物中，搅拌至凝胶状态。(3)将步骤(2)得到的产物密封后在温度为70°C的水浴中熟化Mh，将产物取出， 然后将水浴温度降至30°C时，再将产物放入水浴中脱碱直至产物溶液PH值为7;取出材料， 在温度为-10°C条件下低温冷冻和干燥lh，制得SH/KGM多孔支架材料。(4)预钙化将SH/KGM多孔支架材料浸入温度为36. 5°C的钙离子溶液中1天，每 24h更换一次钙离子溶液。(钙离子溶液为浓度为0. 1摩尔/升的Ca(NO3)2溶液)
(5)将(4)步骤得到的产物取出，浸入温度为36. 5°C的模拟体液(SBF)溶液中7天，每 24h更新一次SBF ；然后将产物取出，在温度为15°C的条件下，水浴30他，洗去支架上残留的 SBF溶液中的离子；最后将材料取出，在温度为-10°C条件下低温冷冻和干燥lh，制得HAP/ SH/KGM 多孔支架材料。(SBF 溶液=Na+ 213mmol/L、K+ 7. 5mmol/L、Mg2+ 2. 25mmol/L、Ca2+ 3. 75mmol/L、C1- 221. 7mmol/L、HCO3- 6. 3mmol/L、HPO4- 1. 5mmol/L、SO广 0. 75mmol/L。)。经上述过程所得羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料的组分是羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖的质量比为80 8 :200。实施例3 参见图1，本羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料的制备方法是
(1)按透明质酸钠与水的质量比为1:400，将透明质酸钠溶于水中，搅拌使其充分溶解， 然后将碱性溶液加入溶液中；碱性溶液为浓度为lvol%的NaOH溶液，加入量按碱性溶液与水的体积比为1:80。(2)交联按透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖的质量比1:200，将魔芋葡甘聚糖加入步骤(1)得到的产物中，搅拌至凝胶状态。(3)将步骤(2)得到的产物密封后在温度为50°C的水浴中熟化48h，将产物取出， 然后将水浴温度降至50°C后，再将产物放入水浴中脱碱直至产物溶液PH值为7;取出材料， 在温度为_20°C条件下低温冷冻和干燥48h，制得SH/KGM多孔支架材料。(4)预钙化将SH/KGM多孔支架材料浸入温度为37. 5°C的钙离子溶液中3天，每 24h更换一次钙离子溶液。(钙离子溶液为浓度为0. 2摩尔/升的CaCl2溶液)
(5)将(4)步骤得到的产物取出，浸入温度为37. 5°C的模拟体液(SBF)溶液中16天，每 24h更新一次SBF ；然后将产物取出，在温度为80°C的条件下，水浴36h，洗去支架上残留的 SBF溶液中的离子；最后将材料取出，在温度为-20°C条件下低温冷冻干燥48h，制得HAP/ SH/KGM 多孔支架材料。(SBF 溶液=Na+ 213mmol/L、K+ 7. 5mmol/L、Mg2+ 2. 25mmol/L、Ca2+ 3. 75mmol/L、C1- 221. 7mmol/L、HCO3- 6. 3mmol/L、HPO4- 1. 5mmol/L、SO广 0. 75mmol/L。)
经上述过程所得羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料的组分是羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖的质量比为170 1 :200。实施例4
(1)按透明质酸钠与水的质量比为1:1000，将透明质酸钠溶于水中，搅拌使其充分溶解，然后将碱性溶液加入溶液中；碱性溶液为浓度为0. 2vol%的NaOH溶液，加入量按碱性溶液与水的体积比为1:700。(2)交联按透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖的质量比1:10，将魔芋葡甘聚糖加入步骤(1)得到的产物中，搅拌至凝胶状态。(3)将步骤(2)得到的产物密封后在温度为80°C的水浴中熟化10h，将产物取出，然后将水浴温度降至45°C，再将产物放入水浴中脱碱直至产物溶液PH值为7 ；取出材料，在温度为_15°C条件下低温冷冻30h和干燥，制得SH/KGM多孔支架材料。
(4)预钙化将SH/KGM多孔支架材料浸入温度为37°C的钙离子溶液中2天，每24h 更换一次钙离子溶液。(钙离子溶液为浓度为0. 05摩尔/升的Ca(OH)2溶液)
(5)将(4)步骤得到的产物取出，浸入温度为37°C的模拟体液(SBF)溶液中1天；然后将产物取出，在温度为70°C的条件下，水浴20h，洗去支架上残留的SBF溶液中的离子； 最后将材料取出，在温度为_15°C条件下低温冷冻和干燥20h，制得HAP/SH/KGM多孔支架材料。(SBF 溶液=Na+ 213mmol/L、K+ 7. 5mmol/L、Mg2+ 2. 25mmol/L、Ca2+ 3. 75mmol/L、C1-221. 7mmol/L、HC03- 6. 3mmol/L、HP0[ 1. 5mmol/L、SO广 0. 75mmol/L。)
经上述过程所得羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料的组分是羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖的质量比为1 16 :160。
权利要求
1.一种羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料，其特征在于是由羟基磷灰石、透明质酸钠、魔芋葡甘聚糖三种材料组成的多孔支架复合材料。
2.根据权利要求书1所述的羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料，其特征在于羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖的质量比为1 170 1 20 160 200。
3.一种羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料的制备方法，其特征在于 包括如下步骤(1)按透明质酸钠与水的质量比为1:2000 1:400，将透明质酸钠溶于水中，搅拌使其充分溶解，然后将碱性溶液加入溶液中；(2)按透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖的质量比为1:200 8，将魔芋葡甘聚糖加入步骤 (1)得到的产物中，搅拌至凝胶状态；(3)将步骤(2)得到的产物密封水浴熟化，然后将产物取出，待温度下降后，再将产物放入水浴中脱碱直至产物溶液PH值为7 ；最后取出产物，低温冷冻和干燥后，制得SH/KGM多孔支架材料；(4)将SH/KGM多孔支架材料浸入温度为36.5 37. 5°C的钙离子溶液中1 4天，每 24h更换一次钙离子溶液；(5)将步骤(4)得到的产物取出，浸入温度为36.5 37. 5°C的模拟体液溶液中1 16 天，每24h更新一次人体模拟液；然后将产物取出，水浴12 36h ；最后将材料取出，低温冷冻和干燥后，制得HAP/SH/KGM多孔支架材料。
4.根据权利要求书3所述的羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料的制备方法，其特征在于所述HAP/SH/KGM多孔支架材料中羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖的质量比为1 170 1 20 160 200。
5.根据权利要求书3所述的羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料的制备方法，其特征在于碱性溶液为浓度为0. 1 lvol%的NH3 · H2O或浓度为0. 1 1 的 NaOH溶液，加入量按碱性溶液与水的体积比为1:800 1:80。
6.根据权利要求书3所述的羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中水浴熟化温度为50°C 90°C，时间为12 48h ；水浴脱碱温度为15°C 50°C。
7.根据权利要求书3所述的羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料的制备方法，其特征在于所述步骤(3)和(5)中低温冷冻的温度为-10°C -40°C，时间为Ih 48h。
8.根据权利要求书3所述的羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料的制备方法，其特征在于所述步骤(5)中水浴温度为15°C 90°C。
9.根据权利要求书3所述的羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料的制备方法，其特征在于所述步骤(4)的钙离子溶液为浓度为0. 05 0. 2摩尔/升的Ca(0H)2、 Ca(NO3)2 或 CaCl2 溶液。
10.根据权利要求书3所述的羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖复合材料的制备方法，其特征在于所述步骤(5)中 Na+ 213mmol/L、K+ 7. 5mmol/L、Mg2+ 2. 25mmol/L、Ca2+ 3. 75mmol/L、C1— 221. 7mmol/L、HCO3— 6. 3mmol/L、HPO4— 1. 5mmol/L、S042— 0. 75mmol/L。
全文摘要
本发明涉及用于骨缺损修复的一种羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖多孔支架复合材料及其制备方法，属于生物医学材料领域。本发明以透明质酸钠、魔芋葡甘聚糖为原料，交联后制得透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖的多孔支架材料后，通过预钙化及SBF溶液浸泡的仿生矿化法制得羟基磷灰石、透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖多孔支架材料。本发明反应条件温和，采用材料均安全无毒性，成本低廉，制备工艺简单；同时此支架材料具有良好的力学性能和独特的三维结构，满足骨组织工程材料的要求。
文档编号C08J9/40GK102380128SQ20111033716
公开日2012年3月21日 申请日期2011年10月31日 优先权日2011年10月31日
发明者王静, 陈佳, 陈庆华, 黄明华 申请人:昆明理工大学