专利名称：一种乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖及其在提高iec抗菌肽表达水平中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞壁完整肽聚糖及其应用，特别涉及一种提取自鼠李糖乳杆菌MLGa(Lactobacillus rhamnosus MLGa)中的细胞壁完整肽聚糖及其在提高IEC抗菌肽表达水平中的应用。本发明属于生物技术领域。
背景技术：
鸡小肠上皮细胞(IEC)的主要功能IEC是哺乳动物消化吸收的主要功能细胞，也是体内更新最快的一类细胞，参与肠道食物的消化、吸收，并与肠道的内外分泌功能有密切关系。其黏膜上皮内含有大量的免疫细胞及免疫分子，通过对黏膜免疫细胞的不同刺激信号来调节黏膜的各种免疫反应，构成 体内的免疫屏障，并阻止微生物及毒素对肠道的侵袭。IEC培养的研究现状以往对上皮细胞在体试验多侧重临床、病理及超微结构等方面的研究，离体培养多用于研究肠道微生态营养、细胞增殖、分化机制、药物筛选及肿瘤治疗等。肠上皮细胞生长在复杂的环境中，是一个高度组织化的动态系统，受到各种细胞因子的调节，而且体内细胞间相互作用、细胞间及与细胞外基质间都存在复杂的细胞信号网络，其分离、纯化、生长及增殖都受到很多因素的影响。体外培养IEC对于研究肠上皮干细胞的增殖分化机理、肠上皮细胞间信号传导以及小肠功能、营养代谢、病理等方面有重要的意义。细胞离体后，失去了神经和体液的调节作用和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，分化现象减弱，形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡。因此，体外培养IEC存在很多困难，很难维持IEC体外增殖，且存活时间短。国外学者对肠上皮细胞研究较多，相继建成大鼠肠上皮细胞系IRD98，大鼠肠隐窝细胞系IEC-6、IEC-18、IEC-17，人肠腺癌细胞系Caco-2、HT-29、Lovo, Sff-480,人结肠上皮细胞T84等，已被广泛地应用于生理、病理、药理等方面的研究。长期以来，在研究IEC的生物学功能、细胞增殖和分化的调控因素、物质吸收与代谢等，大多采用肠道肿瘤细胞系或小肠上皮细胞株(主要以IEC-6为主)作为试验模型。上世纪80年代，Quaroni和May已经成功建立永生化小肠上皮细胞系，肠上皮细胞株是经过数周体外培养，从混合细胞中挑选，最后形成单细胞克隆的，其与肿瘤细胞系都是已发生转化的细胞，具有永久生长的特性。无论是肿瘤细胞系还是细胞株与正常细胞是有着本质区别的，很多方面都存在着局限性，因此研究IEC的分离方法和培养条件就显得很重要。抗菌肽分类及抗菌作用动物内源性抗菌肽(endogenous antimicrobial peptides)是生物体内产生的基因编码的阳离子多肽，具有广谱抗菌能力，在机体组织中分布广泛，尤其在那些与微生物密切接触的上皮组织如消化道、呼吸道、生殖道黏膜上皮和皮肤上，抗菌肽在机体局部抗感染与免疫方面发挥着重要作用。最近研究发现，抗菌肽是肠道黏膜天然免疫的重要成分，是先天抗微生物免疫的直接效应分子。抗菌肽具有分子质量小、热稳定(100°c加热IOmin仍能保持一定的活力)、水溶性好、对PH值较高或较低的环境都有较强的抵抗性和抗菌作用机制独特等特点。肠道抗菌肽主要由肠道黏膜上皮细胞和免疫细胞产生和分泌，而肠道上皮细胞作为机体防御的第一道防线，其产生的抗菌肽对保护整个肠道黏膜完整和调节微生物区系平衡尤为重要。肠道上皮细胞产生的抗菌肽除了具有较强的直接杀灭有害微生物的作用外，它们还可作为细胞间的信号分子而发挥多重免疫调节活性，在连接天然免疫和获得性免疫(特异性免疫)反应之间起着重要的桥梁作用，进而启动获得性免疫系统以提高机体的特异性免疫水平。瑞典科学家Boman等(1972)在果蚬中发现抗菌肽,迄今为止，已发现800余种类似的抗菌肽，且广泛分布在病毒、细菌、动物、植物、昆虫及人类中。根据抗菌肽的结构，将其大致分为4类cecropin(杀菌肽)类、富含pro残基的magainin(娃皮素)、富含gly残基的melittin (毒素)和富含cys残基的defensin (防御素)。目前，已从脊椎动物体内分离出许多防御素，参与机体最初防御活动，能有效杀灭细菌、真菌、螺旋菌和囊膜病毒等，是一 类极为重要的内源性抗菌肽。根据空间结构的不同，防御素分为三大类a -防御素、P -防御素、e-防御素。禽防御素在禽类的先天性免疫及获得性免疫中发挥重要作用，它是防御素的一个亚类。至今，关于禽￠-防御素的抗菌机制尚未完全清楚，阳离子性和两亲性的两种观点被大多数研究学者所认可。目前，从鸡肠道组织中发现的抗菌肽主要有鸡￠-防御素、cathelicidins、组蛋白Hl和H2、溶菌酶等，其中P -防御素家族是鸡肠道上皮细胞表达的一类最重要的抗菌肽。Bar-Shired等最近研究证实，家禽在孵化期间肠道就开始表达P -防御素，以适应出雏后I周内肠道获得性免疫功能发育不完善的特点，P-防御素在促进鸡肠道获得性免疫功能的成熟中发挥重要作用。鸡P -防御素的研究始于1994年，Harwig等和Evans等在鸡白细胞发现4种抗菌肽，并命名为Gallinacins (Gal)，分别为Gal_l、Gal-2, Gal-3和Gal-I a。随后 Lynn 等报道，已发现 13 种鸡 & -防御素(Gallinacinl_Gallinacinl3),简称为(Gal-l-Gal-13)。国内外学者对这些￠-防御素在健康鸡各种组织及消化道的分布表达进行了许多研究，不同的￠-防御素在机体内的表达具有组织特异性。然而，对于鸡肠道抗菌肽的表达调控机制及功能研究则很少。P-防御素基因的表达有两种形式固有表达和诱导表达。鸡￠-防御素基因在机体中表达量的分布是不同的，Gal-l-Gal-7主要在骨髓和呼吸道上皮组织中表达，Gal-8-Gal-12主要在肝脏和泌尿生殖系统中表达。^ -防御素AvBD9是鸡胃肠道上皮细胞表达的重要抗菌肽，在肠道黏膜抗感染免疫中发挥重要作用。马得莹等研究表明，AvBD9基因在鸡体内各组织器官中广泛表达，在鸡皮肤、舌、心脏、小肠、肝脏、肾脏、法氏囊、脾脏和胰腺中表达量都较高；然而，Van Dijk等(2007)研究发现，AvBD9高表达于健康鸡的食管和嗉囊，在腺胃呈中等程度表达，而在整个肠道表达量则很低；Lynn则未发现消化近端部位有明显的AvBD9表达。这些学者研究差异的存在可能是由于鸡的品种、个体等差异，也有可能是外界环境对其影响或刺激产生的应激差异。这是否提示着AvBD9基因表达具有诱导性，同时，相关研究报道还发现，AvBD9基因启动子区域存在 I 个 NF_kB (nuclear factor kappa beta)、3 个 AP-1 (activator proteinI)、和4个NF-IL-6 (nuclear factor interleukin 6)等转录因子的结合位点。已研究表明，人和哺乳动物肠道某些抗菌肽的诱导表达正是通过NF-kB等介导的，这些也都说明AvBD9在鸡肠道具有诱导表达的特点。关于￠-防御素，不同学者报道的文章中出现不同的命名，即使是氨基酸序列相同的￠-防御素。￠-防御素的命名的不一致性在学术界引起很大的混淆。为此，在2007年Lynn等(2007)与其他发现鸡P -防御素的学者们提议，采用Xiao等的命名系统(因为此命名系统被 NCBI RefSeq 数据库采用 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/RefSeq)统一鸡
防御素的命名，并可推广到其他家禽￠-防御素。同时，为使家禽￠-防御素与其它脊椎动物(如鼠、猪)￠-防御素的常用术语保持一致，学者们建议不再使用gallinacin而统一使用家禽防御素(avian beta_defensin,简写为AvBD)术语。在此提议中，Lynn等和Van Dijk等所提及的家禽抗菌肽AvBD9命名为P -防御素9 (AvBD9)。本研究中的鸡肠上皮细胞抗菌肽AvBD9将采用新的命名，即P -防御素9 (AvBD9)。
益生菌的作用益生菌又称微生态调节剂、活菌制剂，能够调节肠道微生态平衡；并作为一种添加齐U，添加到食品或药品中。我国对益生菌的研究起源于20世纪70年代，当时为克服抗生素的抗药性及二重感染，防治疾病。何明清等率先报道了从猪肠分离的安全大肠埃氏菌SY-30株，经口服预防初生仔猪黄痢354例，保护率78%，对照组保护率16%。陈惠等在1994年进行类似的实验，得到相同的结果。近年来，益生菌还广泛用作畜禽饲料添加剂，用以改善宿主肠道环境，提高动物健康和生长性能。生理条件下动物胃肠道的微生物群处于动态平衡状况，益生菌作为优势菌群依靠其在数量上的优势，从许多方面抑制病原微生物的生长，达到防病、治病的目的。益生菌的防治机理主要有以下几种生物夺氧、生物屏障、产生有益的代谢产物等。生物夺氧在胃肠道的微生物环境中，由于其特殊的环境，有益的优势菌群多为厌氧菌，占据了优势的地位；同时肠道内一些益生菌如芽孢杆菌是需氧型的，通过代谢降低局部胃肠道中的氧气浓度，抑制需氧的致病菌生长，确保优势菌群的增殖。何明清等给下痢仔猪连续3天服用芽孢杆菌后，肠内的需氧菌与厌氧菌的比例由下痢时的I : I恢复到健康时的I : 1000，即绝大部分为厌氧菌，厌氧菌中的双歧杆菌及乳酸杆菌显著增加，而大肠杆菌及沙门氏菌显著减少。生物屏障即益生菌通过黏附并定植胃肠道黏膜细胞而获得占位优势，形成生物屏障，阻止致病菌在黏膜中定植。产生有益的代谢产物某些益生菌能产生挥发性脂肪酸如乙酸、丙酸、丁酸等，降低肠道PH值，从而有效地抑制致病菌生长。关于益生菌对肠道致病菌的黏附抑制作用的机制，目前公认的观点是乳酸杆菌、双歧杆菌等益生菌定植于肠黏膜上皮细胞后，在肠黏膜表面形成一层形成生物屏障，从而阻止或抑制致病菌的黏附及感染。Coconnier等研究认为，具有黏附性的乳酸杆菌是通过竞争空间位阻作用来抑制致病性大肠杆菌对Coca-2细胞的黏附。有学者认为益生菌黏附于肠黏膜上皮细胞后可上调细胞表面黏蛋白表达，使宿主细胞产生黏附拮抗物质，由此抑制病原菌的黏附。黏附是益生菌发挥作用的首要条件，黏附并定植与肠上皮细胞，上皮细胞在益生菌作用机制中扮演中重要的角色。目前，对于肠道内占绝大多数的益生菌与肠道抗菌肽表达之间的关系研究甚少，两者之间的关系尚不清楚。在众多益生菌制剂中，双歧杆菌及乳酸杆菌是人类和动物使用及研究较多的菌种。乳酸菌是家禽肠道正常菌群中的主要优势菌群，尤其在小肠中占据绝对优势。在乳酸菌的众多益生作用中，乳酸菌对肠道黏膜免疫(包括天然免疫和获得性免疫)的调节作用尤其引人关注，但其主要的作用机制目前仍不十分清楚。国内外把乳酸菌用作功能食品、药品、动物的饲料添加剂及植物的生物肥料等广泛应用。长期以来，抗生素被广泛用于饲料添加剂中，用来维持畜禽健康和降低发病率。但是，抗生素的长期使用，会造成畜禽肠道微生物菌群平衡失调、动物体对各种疾病的抵抗力降低；细菌产生耐药性，影响畜禽产品的品质，最终影响人类的健康。因而引发了人们对饲料、食品和环境安全的极大关注，迫使人们开始寻找新型抗菌剂。抗菌肽是生物体内产生的一种阳离子短肽，主要是通过与带负电荷的细菌细胞膜相互作用，并改变其通透性，而导致细胞死亡，是离子的物理作用，没有特定的受体，因而不产生耐药性，具有重要临床应用价值。正是鉴于抗菌肽的广谱抗菌活性，无毒害，无免疫原性，对环境无污染等，抗菌肽有望成为新的饲料添加剂服务于畜牧养殖业，同时许多学者对抗菌肽的作用机制等也进行更加深入的研究。益生菌是肠道常驻菌，直接与肠道黏膜上皮细胞接触并与之发生相互作用，上皮细胞是益生菌发挥益生作用的重要扮演者。根据乳酸杆菌的作用特点、作用模式及抗菌肽AvBD9基因结构特点，从理论上推导，鸡小肠内的优势菌乳酸杆菌在与上皮细胞的相互作用 过程中，乳酸杆菌诱导或促进肠道抗菌肽尤其是AvBD9基因表达的可能性是存在的。而目前，对于益生菌与抗菌肽表达之间的关系研究还处于空白，两者之间的关系及益生菌的作用机理尚不清楚。
发明内容
本发明目的之一是提供一种可以增强鸡小肠上皮细胞(IEC)抗菌肽表达量的乳酸杆菌活性组分；本发明目的之二是提供所述的乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖在提高鸡小肠上皮细胞抗菌肽AvBD9表达水平中的应用；本发明目的之三是提供一种可以识别乳酸杆菌及其相关组分的IEC表面受体；本发明目的之四是提供一种检测TLR2介导乳酸杆菌或乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖增强鸡小肠上皮细胞抗菌肽AvBD9基因表达相关性的方法。本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的原代培养小肠上皮细胞，接种于6孔培养板，用DMEM完全培养基培养，隔天更换I次培养液，当细胞培养至70% -80%融合时，进行细胞刺激实验弃细胞培养液，以PBS洗涤3次，每孔加入用无血清无抗生素的DMEM细胞培养液悬浮的不同浓度的8种活菌，分别刺激3h，进行剂量依赖性实验。所述的8种活菌分别为嗜酸乳杆菌La标准株(Lactobacillusacidophilus ATCC 4356,来源于人肠道)、猪源唾液乳杆菌X7 (Lactobacillus salivariusX7)、德氏乳杆菌C21 (Lactobacillus delbrueckii C21)、发酵乳酸杆菌F6 (Lactobacillusfermentum F6)、鼠李糖乳杆菌 MLGa(Lactobacillus rhamnosus MLGa)、鼠李糖乳杆菌MB12 (Lactobacillus rhamnosus MB12)、植物乳杆菌SJ (Lactobacillus pi ant arum SJ)和屎肠球菌DM5 (Enterococcus faecium DM5);取同一浓度不同时间点，进行时间依赖性实验；同时设立对照孔，对照孔只加入无血清无抗生素的DMEM细胞培养液，提取细胞总RNA用于RT-PCR测定AvBD9 mRNA表达。一次选出最佳的刺激菌株及最佳的刺激条件。根据剂量、时间依赖性AvBD9mRNA表达结果，用一定浓度的乳酸杆菌刺激上皮细胞，对照组只加入无血清无抗生素的DMEM细胞培养液。收集细胞培养上清和提取细胞胞浆总蛋白，利用Western blotting和ELISA方法检测AvBD9蛋白表达。按照常规的免疫组化操作步骤，利用免疫细胞化学检测AvBD9蛋白的表达和分布。所用抗体一抗为兔抗鸡AvBD9多克隆抗体，二抗为羊抗兔IgG。根据剂量、时间依赖性实验结果，选取相同浓度的细菌在65°C水浴中加热30min，用此热灭活益生菌进行细胞刺激实验，对照组只加入无血清无抗生素的DMEM细胞培养液。提取细胞总RNA用于RT-PCR测定AvBD9基因表达，比较活菌和热灭活全菌影响抗菌肽基因表达的差异性，从而明确益生菌的黏附和细菌分泌产物对上皮细胞AvBD9表达的影响，并进一步分析不同细菌对上皮细胞的黏附能力与促进AvBD9表达能力的相关性。选取活性最高的乳酸杆菌，分离乳酸杆菌不同细胞组分用于细胞刺激实验。这些细胞组分包括全细胞壁组分(bacterial cell wall, BCW)、细胞壁完整肽聚糖(wholepeptidoglycan,WPG)、细胞壁脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)、细胞壁蛋白和乳酸杆菌培养上清等。用无血清细胞培养液稀释制备的不同组分，进行剂量依赖性细胞刺激实验，提取细胞总RNA。细胞培养及基因表达的检测同上。通过该部分实验获得最有效细胞组分。选取促进AvBD9表达能力最强的乳酸杆菌及其活性组分刺激上皮细胞，对照组只加入无血清无抗生素的DMEM细胞培养液，提取细胞总RNA用于RT-PCR检测TLR2 mRNA表达变化。为进一步验证TLR2介导乳酸杆菌及其活性组分调控AvBD9基因表达的可能性；采用抗体封闭技术特异性阻断TLR2的表达，观察干预前后AvBD9的表达变化TLR2的特异性抗体封闭的上皮细胞，分别提取未刺激对照组、乳酸杆菌刺激组以及乳酸杆菌最有效细胞组分组的上皮细胞总RNA，用于RT-PCR检测AvBD9 mRNA的表达。通过以上技术手段本发明筛选得到了一株具有促进AvBD9表达能力最强的乳酸杆菌，所述的乳酸杆菌命名为鼠李糖乳杆菌MLGa，分类命名为鼠李糖乳杆菌，拉丁名为Lactobacillus rhamnosus,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为=CGMCCNo. 5957，保藏日期为2012年4月6日。进一步的，本发明从所述的鼠李糖乳杆菌MLGa提取得到了一种乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖，实验证明该完整肽聚糖较乳杆菌MLGa具有更好的促进AvBD9表达的效果。因此，本发明提出了以上所述的乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖在制备提高鸡小肠上皮细胞抗菌肽AvBD9表达水平制剂中的应用。更进一步的，本发明还提供了一种提高鸡小肠上皮细胞抗菌肽AvBD9表达水平的方法，其特征在于包含以下步骤将以上所述的乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖与鸡小肠上皮细胞共培养，以提高抗菌肽AvBD9基因的表达水平。在本发明中，优选的，乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖的浓度为50y g/ml。在本发明中，优选的，乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖与鸡小肠上皮细胞共培养的时间为4小时。本发明还提供了鸡小肠上皮细胞表面受体TLR2在介导乳酸杆菌或乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖增强鸡小肠上皮细胞抗菌肽AvBD9基因表达中的应用。—种检测TLR2介导乳酸杆菌或乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖增强鸡小肠上皮细胞抗菌肽AvBD9基因表达相关性的方法，其特征在于包括以下步骤以乳酸杆菌、热灭活乳酸、杆菌和乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖WPG刺激鸡小肠上皮细胞，用荧光定量PCR方法检测其TLR2 mRNA的表达变化；采用特异性抗体封闭鸡小肠上皮细胞的TLR2,吸去封闭液，加入乳酸杆菌、热灭活乳酸杆菌和乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖WPG刺激细胞，用荧光定量PCR方法检测抗菌肽AvBD9 mRNA的变化。。其中，优选的，抗体稀释倍比为100倍。其中，优选的，采用特异性抗体和IEC于37°C共同孵育40分钟封闭鸡小肠上皮细胞的TLR2。
图I为IEC形态特征鸡胚肠上皮细胞呈铺路石样生长(A :200X ；B :400X)；
图2为不同浓度乳酸菌对鸡小肠上皮细胞AvBD9 mRNA表达的影响；图3为鼠李糖乳杆菌MLGa刺激不同时间与AvBD9 mRNA表达水平的关系；图4为鼠李糖乳杆菌MLGa活菌及热灭活菌与对AvBD9 mRNA表达的影响；图5为Western blot检测培养上清中AvBD9蛋白的表达；图6为不同浓度乳酸菌活性组分对鸡小肠上皮细胞AvBD9 mRNA表达的影响；图7为WPG刺激不同时间与AvBD9 mRNA表达水平的关系；图8为乳酸杆菌、热灭活乳酸杆菌和WPG刺激后TLR2 mRNA的表达变化；图9为先用特异性抗体封闭TLR2,乳酸杆菌、热灭活乳酸杆菌和WPG刺激后AvBD9mRNA的表达变化。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例I小肠上皮细胞的分离与培养将孵育18日龄SPF鸡胚用酒精棉擦拭，并将大头朝上放置在蛋座上，用已消毒的金属器具轻轻将鸡蛋大头击破，用镊子夹去破碎的蛋壳，弯头镊子撕去气室膜，用镊子轻轻夹住鸡胚颈部，将其拖出放入干净无菌的培养皿中，备用。在无菌条件下取出整条小肠，小心去除肠系膜，用D-Hank’s液清洗3次，将小肠剪成小于Imm3的组织块，加入D_Hank’s液清洗，清洗液中加入浓度为200U/ml左右的双抗(青霉素-链霉素)，静置lmin，反复洗3次至上清液澄清。加入5倍体积胶原酶I (lmg/ml)，移入三角瓶中37°C慢速振荡消化50分钟。实施例2乳酸杆菌对鸡小肠上皮细胞抗菌肽AvBD9基因表达的影响2. I试验材料乳酸杆菌共8株,分别为嗜酸乳杆菌La标准株(Lactobacillusacidophilus ATCC 4356,来源于人肠道,购自美国标准菌种收藏所)、猪源唾液乳杆菌X7 (Lactobacillus salivarius X7,分离自健康仔猪十二指肠黏膜，由江西农业大学预防兽医教研室张锦华副教授馈赠)、德氏乳杆菌C21 (Lactobacillus delbrueckii C21,分离自健康仔猪消化道，由南京农业大学朱伟云教授馈赠)、发酵乳酸杆菌F6 (Lactobacillusfermentum F6，分离自内蒙古传统乳制品，由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室张和平教授馈赠)、鼠李糖乳杆菌MLGa (Lactobacillus rhamnosus MLGa,分离自健康鸡消化道，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为=CGMCC No. 5957，保藏日期为2012年4月6日。)、鼠李糖乳杆菌MB12 (Lactobacillusrhamnosus MB12,分离自健康鸡消化道)、植物乳杆菌SJ (Lactobacillus pi ant arum SJ,分离自健康鸡消化道)和屎肠球菌DM5 (Enterococcus faecium DM5,分离自健康鸡消化道)。鼠李糖乳杆菌MLGa、鼠李糖乳杆菌MB12、植物乳杆菌SJ和屎肠球菌DM5由江西农业大学动物营养教研室朱年华副教授馈赠。2. 2细菌培养基:MRS培养基培养，I升蒸馏水中溶解15g琼脂的培养基，加入下列成分蛋白胨log、牛肉膏10g、柠檬酸二铵2g、酵母膏5g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温80 ImUK2HPO4 2g、MgS04 7H20 0. 58g、MnSO4 4H20 0. 25g，调节 pH 为 6. 2-6. 4，121°C 灭菌15min。2. 3乳酸杆菌的培养与鉴定 2. 3. I乳酸杆菌的培养乳酸杆菌接种于MRS液体培养基，37°C厌氧恒温箱中静置培养，紫外分光光度计测定600nm光密度(OD6J，当细菌处于指数生长期时，4°C，8000g离心lOmin，弃液体，PBS洗涤2次，按照公式cfu/ml = 2. 5X IO8XOD6tltl调整细菌数，使其浓度为IX 109cfu/ml，用于细胞刺激实验。2. 3. 2乳酸杆菌鉴定革兰氏染色，光学显微镜下观察菌体形态，如大小、长短、分叉情况及染色性等，进一步生化反应鉴定。由于馈赠人对分离自健康鸡消化道的鼠李糖乳杆菌MLGa、鼠李糖乳杆菌MB12、植物乳杆菌SJ和屎肠球菌DM5仅进行了形态特征、生理特征和生化反应鉴定。因此，本试验还对这四株菌进行16S rDNA分子鉴定。16S rDNA菌种鉴定由北京三博远志生物技术有限责任公司完成。2. 4抗菌肽AvBD9 mRNA表达水平的检测
2. 4. I细胞与乳酸杆菌共培养取相同数目的鸡小肠上皮细胞接种于六孔板中，37°C、5% CO2培养箱中静置培养，至细胞铺满底层80%时用于细菌刺激实验，图I为IEC在显微镜下的形态，观察到鸡胚肠上皮细胞呈铺路石样生长(A :200X ；B 400X)o吸弃培养液，PBS洗2_3次，加入不同浓度的乳酸杆菌进行刺激实验，每孔加入2ml DMEM培养液悬浮的细菌悬液，对照组加入2mlDMEM培养液。每I株菌分别用3个浓度梯度进行刺激试验2X 105cfu/ml、2X 106cfu/ml、2X107cfu/mlo刺激4个小时后，吸弃培养基，PBS洗3次，用细胞刮刷将贴壁细胞刮下，2500g离心5min，弃上清放入_80°C冰箱保存，备用。2. 4. 2乳酸杆菌刺激后细胞总RNA的提取根据Axygen公司试剂盒操作说明书进行，主要步骤为(I)将收集的细胞离心，去除上清，每孔加300 ill Buffer R_I，用移液枪上下吹打8-10 次；(2)将上述悬液移至I. 5ml离心管，用注射器反复抽吸数次；(3)加入 IlOu I Buffer R-II 旋涡振荡 15-30 秒，12000g，4°C离心 5min ；
(4)取上清至新I. 5ml离心管中，加入200 U I异丙酮混匀；(5)将制备管置于2ml离心管(试剂盒内提供)中，转移(4)中的混合液到制备管中，6000g，4°C离心 Imin ；(6)弃废液，往制备管中加 500 V- I Buffer WlA, 12000g, 4°C离心 lmin ；(7)弃废液，往制备管中加 700 u I Buffer W2，12000g，4°C离心 lmin ；(8)重复步骤(7)；(9)弃废液，将制备管放置回2ml离心管中，12000g，4°C离心lmin ；(10)将制备管放入干净I. 5ml离心管中，在制备膜中央加入50 ii I Buffer TE，静置 lmin, 12000g,4°C离心 lmin,洗脱得 RNA。 提取的样品用I %琼脂糖电泳观察所提RNA的质量，同时用紫外分光光度计测吸光度A260和A280，以测定RNA纯度和浓度。2. 4. 3 总 RNA 反转录将经各种乳酸杆菌刺激后以及无细菌刺激组(对照组)提取的总RNA，根据TaKaRa公司试剂盒采用两步法进行反转录,得到cDNA。以提取的总RNA为模板，Oligo (dT) 15为随机引物，反转录合成cDNA的体系为
5 X Prime S cript Buffer2 jxl
Prime ScriptRT Enzyme Mix I0.5[xl
Oligo dT Primer (5OmM)0.5 jxl
Random 6 mers (100 jxM)2 jxl
RNase Free dH202[xl
样品RNA3^1
TotallOjxl根据TakaRa反转录试剂盒(DRR037)操作说明，反应条件37 °C 15min，85°C 5秒，_20°C保存。 2. 4. 4实时荧光定量PCR (FQ-PCR)检测AvBD9基因mRNA表达水平用LightCycler 480PCR仪检测抗菌肽AvBD9在不同浓度不同菌株刺激后其mRNA表达水平，并用LightCycler I. 5分析软件对数据进行统计学分析。(I)引物和探针的合成参照GenBank中所提供的基因序列设计特异性引物(目的基因抗菌肽AvBD9基因GenBank登入号NM_001001611，内参P -actin基因登入号L08165. I)。目的基因引物及探针由上海超世生物公司设计合成，内参基因引物及探针由南京金斯瑞公司设计合成。目的基因 AvBD9 上游引物序列CCACGGCTCCTGCTCTITT，下游引物序列ACCACGGCAGGTCCCAAT，探针FAM-TTGCATGCCGTGCTCCTTCAGTTG-BHQ,扩增长度 69bp ;内参 3 -actin 上游引物序列ITGTGATGGACTCTGGTGATGG，下游引物TGTCAGGATCTTCATGAGGTAGTC，探针FAM-TCACGGCCAGCCAGATCCAGACGG-BHQ，扩增长度131bp。
(2)实时荧光定量PCR反应体系根据TakaRa试剂盒优化反应体系，对每个样品cDNA进行目的基因和内参基因突光定量PCR反应。20 ii I反应体系如下
Premix Ex Taq ( 2x )IOjxl
PCR Forward Primer (10 jxM)0 4 jxl
PCR Reverse Primer (IOfxM)0.4[xl Probe0.6[xl
RNase Free dH206.6[xl
样品 cDNA2^1
Total20 [xl反应条件两步法进行PCR扩增，95°C预变性30s，Cycle :1 ；95°C 5s，60°C 20s，Cycle :40。PCR扩增反应结束，根据扩增曲线的CT值计算定量结果，并对数据进行统计学分析。目的基因及内参基因在同一条件下不同管内扩增，每个样品设3个重复。结果如图2所示。2. 5鼠李糖乳杆菌MLGa刺激时间与AvBD9 mRNA表达水平的关系不同菌株浓度依赖性试验结果表明，在细菌浓度为2X 106Cfu/ml时，鼠李糖乳杆菌MLGa促进鸡小肠上皮细胞AvBD9表达能力最强。因此，用此浓度的鼠李糖乳杆菌MLGa刺激上皮细胞2h、4h、6h、8h、12h、20h后分别提取各样品的总RNA，FQ-PCR检测AvBD9 mRNA的表达水平。结果发现，与对照组相比，鸡小肠上皮细胞受鼠李糖乳杆菌MLGa刺激后，AvBD9mRNA的表达水平在20h内均上调，且存在时间依赖性，12h达到峰值，此后AvBD9 mRNA的表达开始下降(图3所示。)。2. 6乳酸杆菌MLGa活菌及其灭活菌与AvBD9 mRNA表达水平的关系取对数生长期的鼠李糖乳杆菌MLGa，调节浓度为2X 106cfu/ml，另取相同数量的此菌在65°C水浴中灭活30min ;刺激肠上皮细胞，对照组只加入DMEM培养液，刺激4h后，活菌与热灭活菌均上调AvBD9mRNA表达水平，但热灭活菌上调值显著高于活菌(P < 0. 05，图4所示)。2. 7Tricine-SDS-PAGE 蛋白质电泳由于AvBD9分子量较小，只有8KD左右，按常规蛋白胶配方配制，蛋白容易丢失，因此采用适合小分子蛋白分离的Tricine-SDS-PAGE。2. 8ffestern blot检测培养上清中AvBD9的表达收集乳酸杆菌刺激上皮细胞12h后的培养上清，冻干后用PBS重溶，测定蛋白浓度，Western blot检测AvBD9蛋白的表达,结果如图5所示。试验结果使用浓度为2X 106cfu/ml的乳酸杆菌MLGa刺激细胞4小时后，IEC抗菌肽增加为对照组的I. 5倍；灭活后的乳酸杆菌MLGa刺激后，IEC抗菌肽增加为对照组的2. 5 倍。实施例3鼠李糖乳杆菌MLGa (Lactobacillus rhamnosus MLGa)活性组分的提取
3. I肽聚糖的提取按Kazunori Sekine等人的方法提取。具体步骤如下；将15g热处理过的细菌加入到50ml 0. 5% Trilon x_100溶液中，80_85°C水浴lh，同时不断连续搅拌溶液。然后，立即冷却溶液，并用重蒸水彻底洗涤。再用甲醇水(2 1V/V)、甲醇、丙酮连续洗涤，去除不可溶残渣中的去垢剂。在残渣中加入40ml内含10mmol MgCl2 的膜酶(lmg/ml)，DNase (100 u g/ml)，RNase (150 u g/ml)，pH7. 2TrisHcl 缓冲液，37°C孵育14h，2000Xg 4°C离心40min分离不可溶残渣，并用含胰蛋白酶(0. 5mg/ml)、a-糜蛋白酶(0.5mg/ml)、Tris Hcl缓冲液40ml，37°C消化14h。残渣用胃蛋白酶(lmg/ml)0. OlN HCl 20ml 处理，然后用含蛋白酶 E(lmg/ml)pH7.4Tris Hcl 缓冲液 20ml 37。。消化14h。蛋白酶消化过的残渣经甲醇、甲醇氯仿(I 1V/V)及氯仿40ml洗涤脱脂。脱脂的提取物用含蛋白酶E (lmg/ml)，pH7. 4Tris Hcl缓冲液20ml37°C 14h，消化3次，然后用蒸 馏水连续透析3天。最后不可溶的提取物经0. OlNH2SO4 IOml 85_95°C处理5min，立即冷却15000 Xg 4°C离心30min。沉洛用水透析7天冻干保存。3.2LTA 的提取采用的是Hakan Miorner等人的方法进行。取0. 2g菌体放入45%的苯酚溶液中，65°C处理5分钟，12，OOOxg离心30分钟，取
上清置去离子水中透析3天。3. 3全细胞壁组分和全细胞壁蛋白的提取按王国兴等人的方法进行。全细胞壁组分刺激物制备取冻干乳酸杆菌500mg，溶于5ml裂解液(0. 02mol/LPBS pH7. 4,0. 025 % PMSF)中，冰浴条件下，20KZ超声处理2min，15次，每次间隔Imin2000xg离心5min,取上清，然后55000xg离心30min,取沉淀，溶于0. 02mol/L的PBS中。乳酸杆菌细胞壁总蛋白组分刺激物制备细胞壁组分溶于含2% SDS的PBS缓冲液，室温下孵育30min,以萃取胞壁蛋白，55000xg离心30min,取上清，透析3天，按SDS-OutTM Sodium Dodecyl Sulfate Precipitation Kit 的操作程序除去 SDS,过程如下将I体积的SDS沉淀缓冲液与20体积的蛋白样品漩涡振荡充分混合后，冰上孵育20分钟，IOOOOxg离心lOmin，上清转移至滤过管的上端，并和收集管组合，10，OOOxg离心Imin收集滤过液。可溶性蛋白经真空冷冻干燥后，-20°C保存。3. 4乳酸杆菌培养上清的提取将含有乳酸杆菌的培养液12000Xg离心5分钟，取上清过滤后冻干保存。实施例4乳酸杆菌活性组分对鸡小肠上皮细胞抗菌肽AvBD9基因表达的影响4. I细胞与乳酸杆菌活性组分共培养取相同数目细胞接种于六孔板中，37°C、5% CO2培养箱中静置培养，至细胞铺满底层80%时用于活性组分刺激实验，吸弃培养液，PBS洗2-3次，加入不同浓度的乳酸杆菌活性组分进行刺激实验，每孔加入2ml DMEM培养液悬浮的活性组分悬液，对照组加入2mlDMEM培养液。每一种活性组分分别用4个浓度梯度进行刺激试验5ii g/ml、IOii g/ml、50 u g/ml、100 u g/ml。刺激4个小时后，吸去培养基，PBS洗3次，用细胞刮刷将贴壁细胞刮下，2500g离心5min，弃上清放入-80°C冰箱保存，备用。4.2乳酸杆菌活性组分刺激后细胞总RNA的提取
同2. 4. 24. 3总RNA反转录同2. 4. 34. 4实时荧光定量PCR (FQ-PCR)检测AvBD9基因mRNA表达水平同2. 4. 4试验结果如图6所示，其中使用50 u g/ml WPG刺激后，IEC抗菌肽AvBD9表达量最闻。4. 5WPG刺激不同时间与AvBD9 mRNA表达水平的关系不同组分浓度依赖性试验结果表明，在浓度为50 u g/ml时，鼠李糖乳杆菌MLGa的WPG促进鸡小肠上皮细胞AvBD9表达能力最强。因此，用此浓度的鼠李糖乳杆菌MLGa的WPG刺激上皮细胞2h、4h、6h、8h、12h、20h后分别提取各样品的总RNA，FQ-PCR检测AvBD9 mRNA的表达水平。结果发现，与对照组相比，鸡小肠上皮细胞受鼠李糖乳杆菌MLGa的WPG刺激后，AvBD9 mRNA的表达水平在作用4h时达到峰值，结果如图I所示。实施例5乳酸杆菌及其活性细胞组分调控抗菌肽AvBD9基因表达的信号转导途径5. I乳酸杆菌及其活性细胞组分对鸡IEC TLR2受体mRNA表达水平的影响取相同数目细胞接种于六孔板中，37°C、5% CO2培养箱中静置培养，至细胞铺满底层80%时用于刺激实验，吸弃培养液，PBS洗2-3次，然后分别加入2ml 2X106cfu/ml乳酸杆菌、2X106cfu/ml热灭活的乳酸杆菌和50y g/ml乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖WPG，对照组加入2ml DMEM培养液，刺激4个小时后，吸去培养基，PBS洗3次，用细胞刮刷将贴壁细胞刮下，2500g离心5min，弃上清放入-80°C冰箱保存，备用。然后按上述荧光定量方法检测TLR2受体mRNA的表达变化。结果如图8所示。5. 2抗体封闭检测乳酸杆菌及其相关组分与TLR2受体的相关性试验材料鸡IEC TLR2特异抗体购自北京博奥森生物技术有限公司取相同数目细胞接种于六孔板中，37°C、5% C02培养箱中静置培养，至细胞铺满底层80%时用于刺激实验，吸弃培养液，PBS洗2-3次，加入用DMEM 100倍稀释的抗TLR2的抗体，37°C、5% CO2封闭40分钟，吸去封闭液。然后分别加入2ml 2X 106cfu/ml乳酸杆菌、2 X 106CfU/ml热灭活的乳酸杆菌和50 y g/ml乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖WPG，对照组加入2ml DMEM培养液，刺激4个小时后，吸去培养基，PBS洗3次，用细胞刮刷将贴壁细胞刮下，2500g离心5min，弃上清放入-80°C冰箱保存，备用。然后按上述荧光定量方法检测抗体封闭前后AvBD9的表达变化。试验结果加入刺激物后，TLR2的表达量都有所升闻，最闻升闻为对照组的10倍；特异性抗体封闭以后，抗菌肽AvBD9的表达量最高下降为对照组的百分之一，结果如图9所
/Jn o权利要求
1.一种乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖，其特征在于所述的完整肽聚糖是从鼠李糖乳杆菌MLGa(Lactobacillus rhamnosus MLGa)中提取得到的，所述的鼠李糖乳杆菌MLGa保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为=CGMCC No. 5957。
2.权利要求I所述的乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖在制备提高鸡小肠上皮细胞抗菌肽AvBD9表达水平制剂中的应用。
3.一种提高鸡小肠上皮细胞抗菌肽AvBD9表达水平的方法，其特征在于包含以下步骤将权利要求I所述的乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖与鸡小肠上皮细胞共培养，以提高抗菌肽AvBD9基因的表达水平。
4.根据权利3要求所述的方法，其特征在于乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖的浓度为50u g/mlo
5.根据权利3所要求所述的方法，其特征在于乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖与鸡小肠上皮细胞共培养的时间为4小时。
6.鸡小肠上皮细胞表面受体TLR2在介导乳酸杆菌或乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖增强鸡小肠上皮细胞抗菌肽AvBD9基因表达中的应用。
7.—种检测TLR2介导乳酸杆菌或乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖增强鸡小肠上皮细胞抗菌肽AvBD9基因表达相关性的方法，其特征在于包括以下步骤以乳酸杆菌、热灭活乳酸杆菌和乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖WPG刺激鸡小肠上皮细胞，用荧光定量PCR方法检测其TLR2mRNA的表达变化；采用特异性抗体封闭鸡小肠上皮细胞的TLR2，吸去封闭液，加入乳酸杆菌、热灭活乳酸杆菌和乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖WPG刺激细胞，用荧光定量PCR方法检测抗菌肽AvBD9mRNA的变化。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于抗体稀释倍比为100倍。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于采用特异性抗体和鸡小肠上皮细胞于37°C共同孵育40分钟封闭鸡小肠上皮细胞的TLR2。
全文摘要
本发明公开了一种乳酸杆菌细胞壁完整肽聚糖及其在提高IEC抗菌肽表达水平中的应用。本发明通过分子生物学方法检测了8株乳酸杆菌对IEC的抗菌肽AvBD9的表达的促进作用，筛选出了刺激效果最好的鼠李糖乳杆菌MLGa，同时提取了MLGa的细胞壁完整肽聚糖(WPG)、磷壁酸(LTA)等相关组分，筛选出了刺激效果最好的组分细胞壁完整肽聚糖(WPG)。本发明筛选出的刺激效果最好的乳酸杆菌MLGa及其组分细胞壁完整肽聚糖与空白对照组相比，能显著增强IEC的抗菌肽的表达，两者效果差别达34倍以上。鼠李糖乳杆菌MLGa及其组分细胞壁完整肽聚糖在增强机体天然免疫方面具有重要作用。
文档编号C08B37/00GK102702373SQ20121012203
公开日2012年10月3日 申请日期2012年4月24日 优先权日2012年4月24日
发明者于申业, 刘思国, 司微, 洪智敏, 贾永杰, 黎观红 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所, 江西农业大学