专利名称：一种从虎杖中分离反式白藜芦醇的方法
技术领域：
本发明涉及化合物反式白藜芦醇，具体涉及从中药虎杖中分离反式白藜芦醇的方法。
背景技术：
虎杖是一种传统的中药，系寥科属多年生草本植物的干燥根茎和根。主要含有蒽醌类和芪类化合物，其中芪类成分反式白藜芦醇具有重要的生理活性。白藜芦醇是植物体内天然的二苯乙烯多酚物质，是植物受到真菌感染，紫外光照射等外界恶劣环境的影响而产生的一种植物抗毒素。它具有明显的抗菌、抗炎、抗癌、抗血栓、抗高血脂等作用，特别是 对心血管病有明显的效果。是很有希望的抗癌活性物之一。反式白藜芦醇作为天然活性物质，它所具有的对心血管疾病和肿瘤的预防和保健作用在国际上已引起了广泛的关注，是一种目前世界上最新的药用保健活性物质，是继紫杉醇之后又一极有期望发展成为抗癌新药和新型保健品药用成份，被认为是当代人类最有开发前途的抗癌防癌新药之一，随着人们对反式白藜芦醇的抗脂质过氧化、降血脂和抗癌功能的认识和肯定，国际市场上对反式白藜芦醇的需求不断增加。其市场前景十分看好。反式白藜芦醇在中药虎杖中含量丰富，达千分之二以上。目前，对虎杖中反式白藜芦醇的提取分离主要采用液-液萃取，硅胶柱层析方法来实现，存在效率不高，试剂消耗大，对环境污染严重、产品附加值不高等不足。因此，开发高效、绿色的提取分离方法将有利于虎杖资源的深度开发与利用。分子印迹技术是近年来迅速发展起来的一种制备对目标分子具有特异选择性结合力的分子印迹聚合物的技术，分子印迹聚合物对目标分子的特异吸附性与选择性，非常适合从复杂体系中分离纯化目标物质，是一种高效的中药活性成分分离技术[l、Huang DD，LiL，Yin Y G, Zhu Q H. Sci. Sin. (Chim.)(黄丹丹，李莉，殷勇冠，朱全红·中国科学化学)，2010，40 (6) :794-800 ;2、Li X Y, Tong H J, Lei F H, Pang J, FengJ, LiM.China Tradit. Herb Drugs.(李小燕,全海娟,雷福厚,庞洁,俸吉,李梅.中草药)，2012, 43:795— 798 ;3、Cirillo G,Curcio M, Parisi O I,Puoci F，Iemma F，SpizzirriU G, RestucciaD,Picci N. Food Chem. 2011，125(3):1058-1063 ;4、Lopez C，ClaudeB, Morin Ph, Max J P, PenaR, Ribet J P. Anal. Chim. Acta, 2011，683 (2) : 198-205]。在分子印迹技术的研究中，基于分子印迹技术制备的分子印迹膜由于兼具分子印迹技术与膜分离技术的优点，为分子印迹技术走向规模化和商业化提供了很好的示范，近年来已成为分子印迹技术领域研究的热点之一 [5、Runrun Chen, Lei Qin, Man Jia, XiwenHe, Wenyou Li. Novel surface-modified molecularly imprinted membrane preparedwith iniferter for permselective separation of lysozyme. Journal of MembraneScience. 2010. 363:212-220 ;6、向海艳，张艳芳，祁超，梅芳，李伟国.白藜芦醇分子印迹复合膜的制备及其选择性能.应用化学.2009. 26(7):786-790.]。但目前印迹膜分离存在通量尚不够理想，且缺乏相应的传质机理研究，应用研究工作多体现于传感与分析领域[7、Xiang H Y, Li W G. Electroanalysis, 2009, 21 (10) : 1207-1210]。中空纤维膜具有较高的比表面积和传质单元数，从而可以增大传质接触面积，提高分离效率。目前，将分子印迹技术和中空纤维膜分离技术相结合的研究报道不多。许振良等开发了一种手性分子印迹纤维复合膜的制备方法并将其应用于手性药物、茶碱等物质的分离[8、JingyuWangj Zhenliang Xuj PingWuj Shenjun Yin. Binding constant and transportproperty of S-Naproxen molecularly imprinted composite membrane. Journal ofMembrane Science. 2009. 331:84-90 ;9、杨座国，许振良，陈桂娥，谢以琼，D 一色氨酸印迹中空纤维复合膜制备及其性能，化工学报，2007，58 (I) 125 一 129 ;10、王靖宇，许振良，张颖。荼碱分子印迹膜色谱的性能，膜科学与技术，2010，30 (5)，37 — 42]，但尚未见分子印迹中空纤维膜分离天然产物活性成分分离的报道。因此，研究开发反式白藜芦醇分子印迹中空纤维膜的的制备方法及用于虎杖中反式白藜芦醇的分离，将为天然产物分离纯化开辟新方向。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种从虎杖中分离反式白藜芦醇的方法，该方法不仅选择性好，而且分离效率高。本发明解决上述技术问题的技术方案是一种从虎杖中分离反式白藜芦醇的方法，该方法由以下步骤组成(I)取虎杖粉碎加入20 50倍(质量体积倍)甲醇或体积浓度为80 95%的乙醇提取和大孔树脂纯化后经减压浓缩、干燥得虎杖醇提物；(2)将虎杖醇提物溶于水、甲醇或乙腈中，使虎杖醇提物在溶液中的浓度为10 lOOOyg/ml，得样品溶液；(3)将样品溶液和萃取剂泵入膜分离器，并使得，样品溶液在膜管内以每分钟
0.3 I. Oml的速度流动，萃取剂在膜管外以每分钟0. 3 I. Oml的速度反向流动；当膜管的内外两相平衡后，按pH调节剂萃取剂=0. I 99.9 I : 99的体积比往膜管外萃取剂中加入PH调节剂，然后收集膜管外流出的萃取液，减压浓缩，得到反式白藜芦醇；其中，所述的膜管由表面涂覆有反式白藜芦醇分子印迹聚合物的中空纤维复合膜制成；所述的有机溶剂为甲醇、乙醇或乙腈；所述的pH值调节剂为乙酸。本发明上述方案中所述的中空纤维复合膜通常都是采用热引发自由基聚合的方法将分子印迹聚合物涂覆到高分子纤维膜上制成的，但针对具体的被分离对象(化合物)来说，都要面临三大难题，一是分子印迹聚合物的制备，二是基膜材料的选择，三是复合条件的确定。本发明上述中空纤维复合膜由以下方法制备得到(I)将反式白藜芦醇与功能单体溶解于溶剂中，于4°C下过夜，再分别加入交联剂和引发剂，通入氮气除氧，得单体溶液；其中，所述的功能单体为丙烯酸、丙烯酰胺或4-乙烯基吡啶；所述的功能单体的用量为反式白藜芦醇功能单体=1 : 6摩尔比；所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯或三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯；当交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯时，所述交联剂的用量为功能单体交联剂=1 5摩尔比；当交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯时，所述交联剂的用量为功能单体交联剂=1 I摩尔比；所述的引发剂为偶氮二异丁腈，且在单体溶液中的浓度为I. 00% ；所述的溶剂为乙腈或甲醇，或者乙腈和甲醇的混合物；所述的溶剂的用量为反式白藜芦 醇溶剂=38mg lml ；(2)将中空纤维膜放入单体溶液中浸泡lh，然后，取出置于两块玻璃片之间，于真空干燥箱中聚合反应24h 72h，得白藜芦醇分子印迹聚合物膜前躯体；其中，所述的中空纤维膜为聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)或聚砜(PSF);所述的中空纤维膜具有如下的性能参数膜孔径为O. 2 — O. 45 μ m,外径为1000 1400 μ m，壁厚为200 300 μ m，孔隙率为80-90%，纯水通量为200_300L/m2. h ;所述聚合反应的条件是真空度为-O. 09 -O. 005MPa，温度为 45。。 60°C ；(3)将白藜芦醇分子印迹聚合物膜前躯体在索氏提取器中洗涤至检测不到白藜芦醇，然后再用甲醇洗去残留的乙酸，晾干，即得白藜芦醇分子印迹聚合物膜；其中，在索氏提取器中洗涤的洗脱剂为乙酸与甲醇的混合溶液，二者的体积比为乙酸甲醇=1 : 9。本发明所述方法的工作原理为样品溶液在中空纤维管内流动，萃取剂在管外逆流流动，两相在膜壁传质萃取。萃取相的有机溶剂泵入膜分离器后，中空纤维全部浸泡在有机溶剂中，由于中空纤维膜表面及孔壁有一层薄薄的印迹层，对模板分子有选择性的优先识别作用，因此当膜内含有目标物质的样品溶液流动时，模板分子便吸附到膜孔和孔壁内，此时含有PH调节剂的萃取剂在膜的另一侧流动就会从膜孔中把模板分子带走。这样，模板分子反式白藜芦醇不断被膜吸附又不断被萃取剂萃取，从而使样品溶液中的反式白藜芦醇不断减少，而膜另一侧的萃取相中的反式白藜芦醇不断增加，最终达到选择性分离的效果。本发明所述的从虎杖中分离反式白藜芦醇的方法具有以下有益效果在进行分子印迹膜分离时，印迹层存在与模板分子结构及形状相匹配的孔穴，模板分子虽然很容易被选择性地优先吸附在印迹膜内，但由于受膜通量的制约，有机物质扩散到膜另一侧(过程)的动力不足，因此透过膜的模板分子的量很少。本发明通过在膜的另一侧(管程)的溶剂中加入含有PH调节剂的萃取剂，借助萃取的动力使模板分子可以透过膜。此外，本发明所述的pH调节剂可破坏模板分子与印迹层的结合，使模板分子发生吸附一解吸附的过程，进而在浓差扩散的驱动下，使得目标产物经模板分子从膜管程向壳程的萃取相一侧扩散，实现选择性透过性的分离。再者，在进行萃取分离时，流速的控制也很重要，流速太快，模板分子来不及吸附一解吸附的过程，使分离效果下降，但流速太慢，也会使分离效率低。本发明所述方法的控制两相的流速为O. 3 — I. Oml/min较好地解决了上述矛盾。
图I为采用本发明所述的反式白藜芦醇分子印迹聚合物膜的膜分离器的原理图。图2为下述实施例2的样品溶液、加pH值调节剂膜萃取分离萃取液和不加pH值调节剂膜萃取分离萃取液的反相高效液相色谱图，其中，a图为样品溶液反相高效液相色谱图；b图为加pH值调节剂膜萃取分离萃取液的反相高效液相色谱图；c图为加pH值调节剂膜萃取分离萃取液的反相高效液相色谱图。图3为下述实施例3的样品溶液、加pH值调节剂膜萃取分离萃取液和不加pH值调节剂膜萃取分离萃取液的反相高效液相色谱图，其中，a图为样品溶液反相高效液相色谱图；b图为加pH值调节剂膜萃取分离萃取液的反相高效液相色谱图；c图为加pH值调节剂膜萃取分离萃取液的反相高效液相色谱图。图4为下述实施例5的样品溶液、加pH值调节剂膜萃取分离萃取液和不加pH值调节剂膜萃取分离萃取液的反相高效液相色谱图，其中，a图为样品溶液反相高效液相色谱图；b图为加pH值调节剂膜萃取分离萃取液的反相高效液相色谱图；c图为加pH值调节剂膜萃取分离萃取液的反相高效液相色谱图。
具体实施例方式例I (反式白藜芦醇分子印迹聚合物膜的制备)(I)将0.038g反式白藜芦醇与0.071g丙烯酰胺溶解于Iml乙腈中，于4°C下过夜，再分别加入Ig乙二醇二甲基丙烯酸酯和O. Olg偶氮二异丁腈，通入氮气除氧，得单体溶液；(2)将聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜放入单体溶液中浸泡Ih,然后，取出置于两块玻璃片之间，于真空干燥箱中在真空度为-O. 09 -O. 005MPa和温度为52°C的条件下聚合反应48h，得白藜芦醇分子印迹聚合物膜前躯体；所述的聚偏氟乙烯膜具有如下的性能参数膜孔径为O. 2-0. 45 μ m,外径为1000 1400 μ m,壁厚为200 300 μ m,孔隙率为80-90%，纯水通量为200_300L/m2· h ；(3)将反式白藜芦醇分子印迹聚合物膜前躯体在索氏提取器中洗涤至检测不到反式白藜芦醇，然后再用甲醇洗去残留的乙酸，晾干，即得反式白藜芦醇分子印迹聚合物膜；其中，在索氏提取器中洗涤的洗脱剂为乙酸与甲醇的混合溶液，二者的体积比为乙酸甲醇=1 9。(4)用反式白藜芦醇分子印迹聚合物膜按常规的方法制得6根膜管，然后将膜管分别装入50x300mm的不锈钢管中，两端用环氧树脂胶密封，最后组装成膜组件并组成如图I所示的膜分离器。例2 (反式白藜芦醇的分离)一、提取反式白藜芦醇(I)取虎杖粉碎Ig加入50ml95%乙醇回流提取2h，过滤，滤液减压浓缩至浸膏，于水液中分散，上AB-8大孔吸附树脂，依次用水、30%乙醇一水洗脱，收集30%乙醇一水洗脱液，减压浓缩、干燥得虎杖醇提物；(2)将虎杖醇提物溶于甲醇中，使虎杖提取物在溶液中的浓度为50μ g/ml，得样品溶液；(3)将样品溶液和甲醇泵入图I所示的膜分离器，并使得，样品溶液在膜管内以每分钟O. 5ml的速度流动，萃取剂在膜管外以每分钟O. 5ml的速度反向流动；当膜管的内外两相平衡后，按乙酸甲醇=0.3 99. 7的体积比往膜管外萃取剂中加入乙酸，然后收集膜管外流出的萃取液，减压浓缩，并经冷冻干燥，得到反式白藜芦醇。二、提取物的鉴定
I、定性分析ESI-MS分析在电喷雾质谱(ESI-MS)负离子谱图中，白藜芦醇的ESI_ —级全扫描质谱产生的准分子离子峰[Μ-ΗΓ为M/Z为227. 0，与反式白藜芦醇分子量228. 2相符。NMR 分析IHNMR (400MHz, DMS0-d6) δ 6. 12 (1Η, t, H_4)，6. 39 (2H, d, J=2Hz, H_2, 6)，6. 749 (2H, d, J=8. 4Hz, H_3'，5'),6.81 (1H, d, J=16. 3Hz, a -H)，6. 92 (1H, d, J=16. 3Hz, β _H)，7. 41 (2H, d, J=8. 4Hz,H-2'，6')，9. 20 (2H, s, 3，5-0H)，9. 56 (1H, s, 4' -OH)在化学位移为 6· 81 和 6. 92 处的双键偶合常数都为16. 3Hz，说明该双键为反式双键；13C-NMR (DMS0-d6，75MHz) δ 126. 71 (C- a )，128. 82 (C_ β )，140. 13 (C-I)，105. 24 (C_2, C_6)，159. 35 (C_3, C_5)
，102.51(C-4), 128. 52 (C-I'), 128. 81 (C_2'，C_6')，116. 17 (C_3'，C_5')，157. 98(C_4')。以上数据与文献[刘晓秋，于黎明，吴立军.虎杖化学成分研究(I)，中国中药杂志，2003，28(1):47-49]报道的数据基本一致，证明其为反式白藜芦醇。2、定量分析采用反相高效液相色谱法对白藜芦醇进行测定，并以保留时间定性，峰面积定量。a.色谱条件。色谱柱为Agilent C18柱(250 X 4. 6mm, 5 μ m)，流动相为乙腈-水(23:77 (V/V)，进样量为IOyL,流速为I. OmL/min,检测波长为303nm，柱温为室温。b.标准曲线的绘制。称取2. 5mg反式白藜芦醇置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得反式白藜芦醇O. 10g/L的对照品储备液，备用。精密吸取标准品储备液I. 5，2. 0，2. 5，3. O和3. 5mL,分别置于25mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成不同浓度的标准品溶液。依次取10 μ L混合标准品溶液进样，对每种浓度重复实验3次。按上述色谱条件测定，绘制出标准曲线，并计算回归方程。结果表明，反式白藜芦醇在O. 036-0. 360 μ g范围内呈良好的线性关系。其线性回归方程及相关系数r为Y=3 618 260 Χ-83 481. 6，r=0. 999 8，式中Y为峰面积积分值；Χ为标准品进样量(μ g)。样品溶液采用标准品溶液相同的色谱条件进样，每次进样10μ L，重复3次，根据峰面积计算样品溶液中反式白藜芦醇的含量。采用上述方法进行定量检测，所得到的反式白藜芦醇的纯度为90%。对进行膜萃取分离前的样品进行定量检测，其结果表明样品中白藜芦醇的含量仅为52%。例3 (反式白藜芦醇的分离)(I)取虎杖粉碎Ig加入40ml80%乙醇回流提取2. 5h，过滤，滤液减压浓缩至浸膏，于水液中分散，上AB-8大孔吸附树脂依次用水、30%乙醇一水洗脱，收集30%乙醇一水洗脱液，减压浓缩、干燥得虎杖醇提物；(2)将虎杖醇提物溶于水中，使虎杖提取物在溶液中的浓度为20μ g/ml，得样品溶液；(3)将样品溶液和乙醇泵入图2所示的膜分离器，并使得，样品溶液在膜管内以每分钟O. 8ml的速度流动，萃取剂在膜管外以每分钟O. 8ml的速度反向流动；当膜管的内外两相平衡后，按乙酸乙醇=0.5 99. 5的体积比往膜管外萃取剂中加入乙酸，然后收集膜管外流出的萃取液，减压浓缩，并经冷冻干燥，得到反式白藜芦醇。·
二、提取物的鉴定
I、定性分析ESI-MS分析在电喷雾质谱(ESI-MS)负离子谱图中，白藜芦醇的ESI_ —级全扫描质谱产生的准分子离子峰[Μ-ΗΓ为M/Z为227. 0，与反式白藜芦醇分子量228. 2相符。NMR 分析IHNMR (400MHz, DMS0-d6) δ 6. 10 (1Η, t, H-4)，6. 32 (2H, d, J=2Hz, H_2, 6)，6. 71 (2H, d, J=8. 4Hz, H_3'，5'),6. 78 (1H, d, J=16. 3Hz, a -H)，6. 90 (1H, d, J=16. 3Hz, β _H)，7. 38 (2H, d, J=8. 4Hz,H-2' ,6'),9. 16 (2H, s, 3，5-0H) ,9.61 (1H, s, 4' -OH)在化学位移为 6. 78 和 6. 90 处的双键偶合常数都为16. 3Hz，说明该双键为反式双键；13C-NMR (DMS0-d6，75MHz) δ 125. 98 (C_ a )，129. 12 (C_ β )，140. 33 (C-I)，105. 82 (C_2, C_6)，159. 85 (C_3, C_5)
，103. 14(C-4), 129. 12(C-I'), 129. 22(C_2'，C_6')，116. 32(C_3'，C_5')，157. 59(C_4')以上数据与文献[刘晓秋，于黎明，吴立军.虎杖化学成分研究(I)，中国中药杂志，2003，28(1): 47-49]报道的数据基本一致，证明其为反式白藜芦醇。2、定量检测采用例2同样的方法进行定量检测，所得到的反式白藜芦醇的纯度为95%。对进行膜萃取分离前的样品进行定量检测，其结果表明样品中白藜芦醇的含量仅为50%。例4 (反式白藜芦醇的分离)(I)取虎杖粉碎Ig加入30ml80%乙醇回流提取I. 5h，过滤，滤液减压浓缩至浸膏，于水液中分散，上DlOl大孔吸附树脂，依次用水、30%乙醇一水洗脱，收集30%乙醇一水洗脱液，减压浓缩、干燥得虎杖醇提物；(2)将虎杖醇提物溶于乙腈中，使虎杖提取物在溶液中的浓度为100 μ g/ml，得样品溶液；(3)将样品溶液和乙腈泵入图2所示的膜分离器，并使得，样品溶液在膜管内以每分钟I. Oml的速度流动，萃取剂在膜管外以每分钟I. Oml的速度反向流动；当膜管的内外两相平衡后，按乙酸乙腈=0.8 99. 2的体积比往膜管外萃取剂中加入乙酸，然后收集膜管外流出的萃取液，减压浓缩，得到反式白藜芦醇。二、提取物的鉴定I、定性分析ESI-MS分析在电喷雾质谱(E SI-MS)负离子谱图中，白藜芦醇的ESI_ —级全扫描质谱产生的准分子离子峰[Μ-ΗΓ为M/Z为227. 0，与反式白藜芦醇分子量228. 2相符。NMR 分析IHNMR (400MHz, DMS0-d6) δ 6. 35 (1Η, t, H-4)，6. 54 (2H, d, J=2Hz, H-2, 6)，6. 65 (2H, d, J=8. 4Hz, H_3'，5'),6. 85 (1H, d, J=16. 3Hz, a -H)，6. 97 (1H, d, J=16. 3Hz, β _H)，7. 48 (2H, d, J=8. 4Hz,H-2' ,6'), 9. 27 (2H, s, 3，5-0H)，9. 68 (1H, s, 4' -OH)在化学位移为 6. 85 和 6. 97 处的双键偶合常数都为16. 3Hz，说明该双键为反式双键；13C-NMR (DMS0-d6，75MHz) δ 126. 13 (C_ a )，128. 45 (C_ β )，140. 82 (C-I)，106. 10 (C_2, C_6)，160. 15 (C_3, C_5)
，103. 12(C-4), 128. 31 (C-I'), 128. 14(C_2'，C_6')，116. 59(C_3'，C_5')，157. 13(C_4')以上数据与文献[刘晓秋，于黎明，吴立军.虎杖化学成分研究(I)，中国中药杂志，2003，28(1):47-49]报道的数据基本一致，证明其为反式白藜芦醇。2、定量检测采用例2同样的方法进行定量检测，所得到的反式白藜芦醇的纯度为91%。对进行膜萃取分离前的样品进行定量检测，其结果表明样品中白藜芦醇的含量仅为48%。例5 (反式白藜芦醇的分离)(I)取虎杖粉碎Ig加入50M195%乙醇回流提取2h，过滤，滤液减压浓缩至浸膏，于水液中分散，上DlOl大孔吸附树脂，依次用水、30%乙醇一水洗脱，收集30%乙醇一水洗脱液，减压浓缩、干燥得虎杖醇提物；(2)将虎杖醇提物溶于甲醇中，使虎杖提取物在溶液中的浓度为500 μ g/ml，得样 品溶液；(3)将样品溶液和甲醇泵入图2所示的膜分离器，并使得，样品溶液在膜管内以每分钟O. 6ml的速度流动，萃取剂在膜管外以每分钟O. 6ml的速度反向流动；当膜管的内外两相平衡后，按乙酸甲醇=1 : 99的体积比往膜管外萃取剂中加入乙酸，然后收集膜管外流出的萃取液，减压浓缩，并经冷冻干燥，得到反式白藜芦醇。二、提取物的鉴定I、定性分析ESI-MS分析在电喷雾质谱(ESI-MS)负离子谱图中，白藜芦醇的ESI_ —级全扫描质谱产生的准分子离子峰[Μ-ΗΓ为M/Z为227. 0，与反式白藜芦醇分子量228. 2相符。NMR 分析=1HNMR (400MHz, DMS0_d6) δ 6. 04 (1Η, t, H-4), 6. 31 (2H, d, J=2Hz, H-2, 6)，6. 71 (2H, d, J=8. 4Hz, H_3'，5'),6. 78 (1H, d, J=16. 3Hz, a -H)，6. 95 (1H, d, J=16. 3Hz, β _H)，7. 45 (2H, d, J=8. 4Hz,H-2'，6')，9. 26 (2H, s, 3，5-0H)，9. 48 (1H, s, 4' -OH)在化学位移为 6. 78 和 6. 95 处的双键偶合常数都为16. 3Hz，说明该双键为反式双键；13C-NMR (DMS0-d6，75MHz) δ 127. 11 (C- a )，128. 22 (C_ β )，139. 93 (C-I)，105. 74 (C_2, C_6)，159. 77 (C_3, C_5)
，102. 85(C-4), 128. 81(C-I'), 128. 92(C_2'，C_6')，116. 74(C_3'，C_5')，157. 82(C_4')以上数据与文献[刘晓秋，于黎明，吴立军.虎杖化学成分研究(I)，中国中药杂志，2003，28(1):47-49]报道的数据基本一致，证明其为反式白藜芦醇。2、定量检测采用例2同样的方法进行定量检测，所得到的反式白藜芦醇的纯度为88%。对进行膜萃取分离前的样品进行定量检测，其结果表明样品中白藜芦醇的含量仅为45%。例6 [pH调节剂(乙酸)对分离效果的影响]I、分别将上述实施例2、3和5所得到的样品溶液以不加pH值调节剂(乙酸)方式并采用与对应实施例相同的设备和条件进行膜分离，然后收集膜管外流出的萃取液；2、分别取上述步骤I的3种萃取液、实施例2、3和5所得到的样品溶液以及实施例2、3和5所收集的萃取液RP-HPLC分析，得到如图2 4所示的反相高效液相色谱图。图2 4中，a图为实施例2、3和5所得到的样品溶液的反相高效液相色谱图；b图为实施例
2、3和5所收集的萃取液的反相高效液相色谱图；c图为上述步骤I所得到的3种萃取液的反相高效液相色谱图。
3、实验结果。由图2 4中的a图可见，没有经过膜萃取分离的样品溶液中含有大量的杂质；由图2 4中的b图可见，当膜管的内外两相平衡后，加入pH值调节剂，然后 收集的膜管外流出的萃取液中杂质大大减少，而且透过中空纤维复合膜的反式白藜芦醇的量较大；由图2 4中的c图可见，，当膜管的内外两相平衡后，不加入pH值调节剂，所收集的膜管外流出的萃取液中杂质虽然大大减少，但是透过中空纤维复合膜的反式白藜芦醇的量明显减少甚至检测不到。
权利要求
1.一种从虎杖中分离反式白藜芦醇的方法，该方法由以下步骤组成 (1)取虎杖粉碎加入20 50倍(质量体积倍)甲醇或体积浓度为80 95%的乙醇提取和大孔树脂纯化后经减压浓缩、干燥得虎杖醇提物； (2)将虎杖醇提物溶于水、甲醇或乙腈中，使虎杖醇提物在溶液中的浓度为10 lOOOyg/ml，得样品溶液； (3)将样品溶液和萃取剂泵入膜分离器，并使得，样品溶液在膜管内以每分钟O.3 I.Oml的速度流动，萃取剂在膜管外以每分钟O. 3 I. Oml的速度反向流动；当膜管的内外两相平衡后，按PH调节剂萃取剂=0. I 99. 9 I : 99的体积比往膜管外萃取剂中加入PH调节剂，然后收集膜管外流出的萃取液，减压浓缩，得到反式白藜芦醇；其中， 所述的膜管由表面涂覆有反式白藜芦醇分子印迹聚合物的中空纤维复合膜制成； 所述的有机溶剂为甲醇、乙醇或乙腈； 所述的PH值调节剂为乙酸。
2.根据权利要求I所述的一种从虎杖中分离反式白藜芦醇的方法，其特征在于，所述的中空纤维复合膜由以下方法制备得到 (1)将反式白藜芦醇与功能单体溶解于溶剂中，于4°C下过夜，再分别加入交联剂和引发剂，通入氮气除氧，得单体溶液；其中， 所述的功能单体为丙烯酸、丙烯酰胺或4-乙烯基吡啶；所述的功能单体的用量为反式白藜芦醇功能单体=1 6摩尔比； 所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯或三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯；当交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯时，所述交联剂的用量为功能单体交联剂=1 5摩尔比；当交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯时，所述交联剂的用量为功能单体交联剂=1 I摩尔比； 所述的引发剂为偶氮二异丁腈，且在单体溶液中的浓度为I. 00% ； 所述的溶剂为乙腈或甲醇，或者乙腈和甲醇的混合物；所述的溶剂的用量为反式白藜芦醇溶剂=38mg lml ； (2)将中空纤维膜放入单体溶液中浸泡lh，然后，取出置于两块玻璃片之间，于真空干燥箱中聚合反应24h 72h，得白藜芦醇分子印迹聚合物膜前躯体；其中，所述的中空纤维膜为聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)或聚砜(PSF);所述的中空纤维膜具有如下的性能参数膜孔径为O. 2 — O. 45 μ m,外径为1000 1400μπι，壁厚为200 .300 μ m，孔隙率为80-90%，纯水通量为200_300L/m2. h ;所述聚合反应的条件是真空度为-O. 09 -O. 005MPa，温度为 45。。 60°C ； (3)将白藜芦醇分子印迹聚合物膜前躯体在索氏提取器中洗涤至检测不到白藜芦醇，然后再用甲醇洗去残留的乙酸，晾干，即得白藜芦醇分子印迹聚合物膜；其中，在索氏提取器中洗涤的洗脱剂为乙酸与甲醇的混合溶液，二者的体积比为乙酸甲醇=1 : 9。
全文摘要
本发明涉及一种从虎杖中分离反式白藜芦醇的方法，该方法由以下步骤组成(1)取虎杖粉碎加入20～50倍(质量体积倍)甲醇或体积浓度为80～95%的乙醇提取和大孔树脂纯化后经减压浓缩、干燥得虎杖醇提物；(2)将虎杖醇提物溶于水、甲醇或乙腈中，使虎杖醇提物在溶液中的浓度为10～1000μg/ml，得样品溶液；(3)将样品溶液和萃取剂泵入膜分离器，并使得，样品溶液在膜管内以每分钟0.3～1.0ml的速度流动，萃取剂在膜管外以每分钟0.3～1.0ml的速度反向流动；当膜管的内外两相平衡后，按pH调节剂︰萃取剂=0.1︰99.9～1︰99的体积比往膜管外萃取剂中加入pH调节剂，然后收集膜管外流出的萃取液，减压浓缩，得到反式白藜芦醇。本方法不仅选择性好，而且分离效率高。
文档编号C08F220/56GK102924239SQ20121040898
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者向海艳, 谢扬, 罗奇志, 戴开金 申请人:南方医科大学