专利名称：C/y/w135群脑膜炎球菌多糖精制工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有抗原的医药制品领域，特别是涉及C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖精制工艺。
背景技术：
流行性脑脊髓膜炎(meningococcal meningitis)简称为流脑,是由脑膜炎奈瑟菌引起的急性化脓性脑膜炎。其主要临床表现为突发高热、剧烈头痛、频繁呕吐、皮肤黏膜瘀点、瘀斑及脑膜刺激征，严重者可有败血症休克和脑实质损害，常可危及生命。部分病人暴发起病，可迅速致死。A+C+Y+W135四价疫苗能对该病的预防起积极的作用。疫苗接种后，可使机体产生体液免疫应答，用于预防A、C、Y、W135群脑膜炎球菌引起的流行性脑脊髓膜炎。 细菌荚膜多糖是制备流脑疫苗的有效成分。A、C、Y、W135脑膜炎奈瑟菌培养液，经提纯获取A、C、Y、W135群荚膜多糖抗原，纯化后加入乳糖冻干，再经无菌、安全、毒力试验和分子量测定合格后，即成为合格疫苗。对于以荚膜多糖为抗原制备的疫苗，制备中要求将粗制多糖中的蛋白尽可能完全去除。如发明专利ZL03131108.3 (公告日2005. 7. 6)所述，现行脑膜炎球菌多糖精制工艺通常使用醋酸钠溶液溶解粗多糖，并经预冷的苯酚抽提蛋白达到使其去除的目的，虽然多糖中的蛋白含量去除指标满足2010版中国药典规定要求(< 10mg/g)，但苯酚的使用不但污染环境，其残留也影响制品质量，损害人体健康，还具有潜在的致癌毒性。申请中的发明专利201110245718. 3 (
公开日2012. I. 25)记载了不使用苯酚精制A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖的工艺，但是该工艺目前仅处于实验室阶段，技术参数无法在大规模生产中推广。本发明C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖精制工艺的原理在于，从细菌荚膜多糖可以与阳离子表面活性剂CTAB结合形成沉淀的现象推断，荚膜多糖带有负电荷，因此可与阴离子交换柱结合。填料筛选的结果证实，C/Y/W135群多糖能够非常牢靠地结合到阴离子填料上，很难洗脱，而在阳离子交换填料上则全流穿。因而本发明在层析柱中添加表面活性剂，使多糖流穿的同时蛋白吸附，达到多糖精制的目的。本发明C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖精制工艺相较于传统的冷酚法提取，其有益效果在于I.能将蛋白含量有效的控制，使多糖蛋白含量远远低于冷酚法；2.能将多糖收率提高；3.能降低内毒素含量。而且，本发明C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖精制工艺经试生产，证明回收率可达到80%左右，适用于批次100克粗糖产量的规模生产。
发明内容
为克服现有技术采用冷酚提取粗制多糖中的蛋白，残留冷酚对人体造成伤害，以及其他实验室方法无法量产的缺陷，本发明提供了一种新型的层析技术，蛋白含量远远低于药典规定范围，残留毒性低于冷酚法，并适于量产。本发明提供了一种C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖精制工艺，包括如下步骤I.用溶解液分别溶解粗制的C、Y或W135群脑膜炎球菌多糖之一；2.将多糖置换到平衡缓冲液中；3.将收集的多糖溶液上阴离子交换柱，上样量为2(T50mg/ml gel ；4.采用洗脱液从阴离子交换柱上洗脱吸附物质；5.按不同的洗脱峰分段收集206波长下的吸收峰；
6.采用超滤膜超滤脱盐法去除小分子物质。所述溶解液为IOmM Tris-HCl, pH9. O ;所述洗脱液为 20mM Tris-HCl, pH8. 0，其中含 IM NaCl.优选地，所述阴离子交换柱包括Capto adhere串联柱。其中，C群脑膜炎球菌多糖精制工艺中，步骤3中的阴离子交换柱为DEAE-4FF与Capto adhere串联柱。选用DEAE-4FF与Capto adhere串联柱能够更好的将多糖与蛋白分离开来，由于蛋白在DEAE-4FF柱上吸附而多糖在DEAE-4FF柱上流穿在Capto adhere柱上吸附，从而将多糖与蛋白分离开来。优选地，C群脑膜炎球菌多糖精制工艺中，平衡缓冲液为20mM Tris-HCl, pH8. 0，含1%D0C (D0C，脱氧胆酸钠)。加入1%D0C是为了使C群脑膜炎球菌多糖在层析柱中流穿，如果不加入D0C，蛋白和多糖的区分不明显，不利于C群脑膜炎球菌多糖收集。优选地，Y群或W135群脑膜炎球菌多糖精制工艺中，平衡缓冲液为20mMTris-HCl, pH8. O。选用上述平衡缓冲液是因为它近似洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl, pH8. 0，其中含IM NaCl )，更有利于多糖的洗脱优选地，步骤6中采用脱盐柱或超滤脱盐法去除小分子物质。选用超滤膜脱盐法易操作简便；选用脱盐柱可以实现联动操作。本发明的有益效果是无苯酚残留；能将蛋白含量有效的控制，使多糖蛋白含量远远低于国家药典规定的范围；能提高多糖回收率；能降低内毒素含量；适合于规模生产。
具体实施例方式下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。采用层析法替代传统的苯酚抽提的方法从流脑粗糖中提纯流脑荚膜多糖。根据现行的多糖生产工艺，细菌荚膜多糖可以与阳离子表面活性剂CTAB结合形成沉淀推断多糖带有负电荷，从填料筛选的结果也证实，多糖能够结合到阴离子填料上，而在阳离子交换填料上全流穿。实施例I C群脑膜炎球菌多糖精制原料采用粗制C群脑膜炎球菌多糖，溶解液为IOmM Tris-HCl, pH9. O ;平衡缓冲液为 20mM Tris-HCl, pH8.0，其中含 1%D0C ;洗脱液为 20mM Tris-HCl，其中含 IM NaCl，pH8. O。I.用溶解液溶解粗制C群脑膜炎球菌多糖为5mg/ml ；2.采用S印HarOSe-G25(26/10 desalting)柱将溶解的多糖置换到平衡缓冲液中，收集外水第一峰为多糖峰，终浓度约为2. 5mg/ml ；
3.将收集的多糖溶液上DEAE-4FF与Capto adhere串联柱，上样量为2(T50mg/ml gel ；4.采用线性洗脱方式从DEAE-4FF与Capto adhere串联柱上洗脱吸附物质，所用洗脱液为20mM Tris-HCl, pH8. 0，其中含NaCl浓度从O mol/1 I mol/1的线性梯度变化；5.按不同的洗脱峰分段收集206波长下的吸收峰；6.采用脱盐柱或超滤脱盐法去除小分子物质。此处缓冲液中加入1%D0C目的是为了使C群脑膜炎球菌多糖在层析柱中流穿，如果不加入D0C，蛋白和多糖的区分不明显，不利于C群脑膜炎球菌多糖收集。实施例2 C群脑膜炎球菌多糖精制如实施例I所述方法，区别在于，前述步骤2改为使用100KD超滤膜，在超滤器上 将溶解的多糖置换到平衡缓冲液中，终浓度约为2. 5mg/ml。相较于实施例1，此法同样可以达到将多糖置换到平衡缓冲液的作用，同时可省略一步收集洗脱峰的操作，因此更适用于工业化生产。实施例3 Y群脑膜炎球菌多糖精制原料采用粗制Y群脑膜炎球菌多糖。溶解液为IOmM Tris-HCl，pH9. O ;平衡缓冲液为 IOmM Tris-HCl, ρΗ8· O ;洗脱液为 20mM Tris-HCl, I mol/lNaCl，ρΗ8· O。I.用溶解液溶解粗制Y群脑膜炎球菌多糖为5mg/ml ；2.采用S印HarOSe-G25 (26/lOdesalting)柱将多糖置换到平衡缓冲液中，收集外水第一峰为多糖峰，终浓度为2. 5mg/ml ；3.将收集的多糖溶液上Capto adhere阴离子交换柱，上样量为2(T50mg/mlgel ；4.采用梯度洗脱和线性洗脱配合的方式将多糖洗脱，具体地，以35% B洗脱液梯度洗脱2个柱体积，再以35%-100% B洗脱液线性洗脱5个柱体积。B洗脱液为20mMTris-HCl, I mol/lNaCl，ρΗ8· O ；(35%Β 或 35%-100%Β 中 % 表示盐浓度的变化5.收集206波长下的吸收峰；6.采用脱盐柱或超滤脱盐法去除小分子物质。或者，步骤2替换为使用100KD超滤膜，在超滤器上将溶解的多糖置换到平衡缓冲液中，终浓度约为2. 5mg/ml。对于实际生产中超滤置换缓冲液比脱盐柱使用更方便简洁。实施例4 W135群脑膜炎球菌多糖精制如实施例3所述方法，区别在于，前述粗制Y群脑膜炎球菌多糖替换为粗制W135群脑膜炎球菌多糖。实施例5 A群脑膜炎球菌多糖精制 如实施例3所述方法，区别在于，前述粗制Y群脑膜炎球菌多糖替换为粗制A群脑膜炎球菌多糖。实施例6纯度检定对杂蛋白含量比较高的同一批次C群粗制多糖，按实施例I所述方法精制C群多糖，通过生化检测我们可以得出以下数据，见表I。由表中数据可知，在使用DEAE-4FF和Capto adhere串联层析法去除蛋白时，不仅使蛋白含量远远低于国家规定要求，而且将核酸残留也一并去除干净，内毒素也比在冷酚法所检测到的内毒素还要低一倍。
表I. C群粗制多糖冷酚法与层析法生化检测结果对比
权利要求
1.一种C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖精制工艺，其特征在于包括如下步骤 1)用溶解液溶解粗制的C或Y或W135群脑膜炎球菌多糖中的一种； 2)将溶解的多糖置换到平衡缓冲液中； 3)将收集的多糖溶液上阴离子交换柱，上样量为2(T50mg/mlgel ； 4)采用洗脱液从阴离子交换柱上洗脱吸附物质； 5)按不同的洗脱峰分段收集206波长下的吸收峰； 6)采用脱盐法去除小分子物质； 其中，所述溶解液为IOmM Tris-HCl，pH9. O ;所述洗脱液为20mM Tris-HCl，pH8. 0，含IMNaCl。
2.根据权利要求I所述的C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖精制工艺，其特征在于所述阴离子交换柱包括Capto—adhere串联柱。
3.根据权利要求2所述的C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖精制工艺，其特征在于对于C群脑膜炎球菌多糖的精制，所述阴离子交换柱为DEAE-4FF与Capto adhere串联柱。
4.根据权利要求I所述的C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖精制工艺，其特征在于对于C群脑膜炎球菌多糖的精制，所述步骤2)中的平衡缓冲液为20mM Tris-HCl, pH8. 0，其中含1%D0C。
5.根据权利要求I所述的C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖精制工艺，其特征在于对于Y群脑膜炎球菌多糖的精制，所述步骤2)中的平衡缓冲液为20mM Tris-HCl, pH8. O。
6.根据权利要求I所述的C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖精制工艺，其特征在于对于W135群脑膜炎球菌多糖的精制，所述步骤2)中的平衡缓冲液为20mM Tris-HCl, pH8. O。
7.根据权利要求I所述的C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖精制工艺，其特征在于所述步骤6)中采用脱盐柱去除小分子物质。
8.根据权利要求I所述的C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖精制工艺，其特征在于所述步骤6)中采用超滤脱盐法去除小分子物质。
全文摘要
本发明公开了一种C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖精制工艺，包括溶解粗制的C、Y或W135群脑膜炎球菌多糖中的一种——将多糖置换到平衡缓冲液中——将收集的多糖溶液上阴离子交换柱——采用洗脱液从阴离子交换柱上洗脱吸附物质——按不同的洗脱峰分段收集206波长下的吸收峰——采用脱盐法去除小分子物质。本发明能将蛋白含量有效的控制，使多糖蛋白含量远远低于冷酚法，回收率可达到80%左右，适用于批次100克粗糖产量的规模生产。
文档编号C08B37/00GK102911285SQ201210465759
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月16日 优先权日2012年11月16日
发明者周家富, 陈宣洪, 周富昌, 任晓莉, 顾玉林 申请人:罗益(无锡)生物制药有限公司