专利名称：一种具有抗氧化活性的茶树菇子实体多糖的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种具有抗氧化活性的茶树菇子实体多糖的制备方法。属生物工程技术应用领域。
背景技术：
茶树菇属担子菌纲，粪锈伞科，田菇属，又名茶菇、油茶菇、神菇。是近年来发展起来的一种食用菌新品种。茶树菇营养丰富，蛋白质含量高，含有人体必需的氨基酸，并且有丰富的B族维生素和钾、钠、钙、镁、铁、锌等矿质元素。中医认为该菇性平、甘温、无毒，具有较高的药用价值，有清热、平肝、明目、健脾的功效。是一种集营养、保健、理疗于一身的绿色食品。通过热水浸提获得的多糖，具有一定的抗氧化活性，可应用于保健品行业。发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗氧化活性的茶树菇子实体多糖的制备方法
技术领域：
本发明的技术方案为将树菇子实体通过粉碎，脱脂，热水浸提，乙醇沉淀，脱蛋白，脱色、葡聚糖凝胶柱G-2 00层析、透析后冷冻干燥得到茶树菇子实体多糖，最后进行体外抗氧化实验。
本发明发明的一种具有抗氧化活性的茶树菇子实体多糖制备方法，提取得率为3.63g/100g子实体干重，测得多糖含量为97. 8%。经初步的研究确认，基本无毒，具有一定的抗氧化活性。可以作为原料应用于保健食品等领域。
具体来说，首先，我们用粉碎机将市售干燥的茶树菇子实体粉碎，然后用有机溶剂乙醚进行脱脂，80°C _95°C热水浸提，加水量为30倍体积脱脂后产物，总提取时间为12h，提取3次，提取液浓缩后加入4倍体积无水乙醇在4°C醇析，离心收集沉淀，乙醇，乙醚洗涤后用蒸馏水复溶，用木瓜蛋白酶和Sevage法联合去除游离蛋白，H2O2脱色、葡聚糖凝胶G-200 层析柱纯化，蒸馏水透析，冷冻干燥后得到茶树菇子实体多糖。抗氧化试验将总还原能力， 清除羟基自由基、超氧阴离子、DPPH的能力作为指标。
具体实施方式
下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
实例一
IOOg粉碎后的茶树菇子实体加入Soxhelt提取器，以乙醚作为溶剂，进行回流脱脂8h，收集固形物用热水浸提，提取温度80°C _95°C，加水量为30倍体积固形物，总提取时间为12h，提取3次，提取液浓缩后加入3倍体积95%乙醇在4°C醇析过夜，8000rpm离心得沉淀物，沉淀物用蒸馏水复溶后用木瓜蛋白酶和Sevage法联合去除游离蛋白，先在5%的糖溶液中加入1% (w/v)的木瓜蛋白酶于58±2°C，pH6.5条件下反应4h，然后按发酵液1/5 的体积加入氯仿，然后加入氯仿体积1/5的正丁醇，混合后振荡20min。蛋白质与氯仿-正丁醇生成凝胶，4000rpm离心20min，收集上清液，反复操作8次至氯仿-正丁醇层不浑浊为止。然后在上清液中加入95%乙醇置4°C冰箱过夜，次日离心收集沉淀。沉淀物用蒸馏水复溶后将5%的多糖溶液用NaOH调pH至9. 0，然后滴加20%的H2O2 (用量为多糖溶液体积的15% )，保持PH8. 0-9. OAh后终止反应，加入95%乙醇置4°C冰箱过夜，次日离心收集沉淀，用95%乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤数次。待有机溶剂挥发完毕，将沉淀物用蒸馏水完全溶解,用Sephadex G-200凝胶层析对多糖进行纯化,流动相为O. IM NaCl,流速O. 5mL/min,每管3mL。以苯酚-硫酸法在490nm处检测每管的糖浓度，测定该多糖的纯度。多糖复溶后装入透析袋中，扎紧袋口，悬浮于蒸馏水中，透析72h，中间每隔12小时换水一次。冷冻干燥后得到茶树菇子实体多糖3. 63g，用苯酚-硫酸法测得总糖含量为97. 8%。
实例二
将制备得到的茶树菇子实体多糖进行抗氧化活性实验，以蒸馏水为空白对照，以抗坏血酸为阳性对照，数据经SPSS13. O软件分析。
I.实验方法
(I)还原力测定
在具塞试管中加入适量不同浓度的茶树菇子实体多糖样品(O. 10-1. Omg/mL)、 O. 2mL PBS (2. OM, pH 6. 6)和O. 5mL I %铁氰化钾溶液。置50°C恒温水浴中反应20min，迅速冷却，再加入适量的10% (w/v)三氯乙酸溶液,3000*g离心IOmin,取上清液I. 5mL,加入 O. 2mLl%三氯化铁溶液和3. OmL去离子水，振荡均匀，静置5min，在λ 700处以蒸馏水为空白测定其吸光值。铁氰化钾[K3Fe(CN)6]可被还原试剂还原成亚铁氰化钾[K4Fe (CN)6]，亚铁氰化钾再和铁离子作用生成普鲁士蓝，在OD7tltol处有最大吸收值，以检测其还原力。吸光值越大，说明其还原力越高。
(2)对羟自由基的清除
在试管中依次加入O. 2mL不同浓度的茶树菇子实体多糖样品(O. 10-1. Omg/mL)，2.O mL 的 EDTA-Fe (O. 15mM)，O. 8mL 水杨酸钠(2. OmM)，2. OmLH2O2 (6. OmM)，O. 8mL 去离子水。 37°C反应60min，于λ 510处测得不同茶树菇多糖浓度下的吸光值A1，用水替代茶树菇多糖时的吸光值A1,用水代替多糖和H2O2时测得空白对照吸光值Atl.按下式计算羟自由基(·0Η) 的清除率· OH 清除率(% ) = [ (A1-Aj) / (A0-Aj) ] X 100
(3)对超氧阴离子的清除
ImL的不同浓度(O. 10-1. Omg/mL)的茶树菇子实体多糖样品以及2mL的 Tris-HCl (16mM, pH 8. O)溶解的 76 μ M 的 NBT 和 394 μ M 的 NADH，加 O. 4mL 的 56 μ M PMS, 振荡均匀，室温反应5min，用Tris-HCl代替样品反应作为空白对照，测定A560nm值。
(4)对DPPH ·自由基的清除
样品管中加入O. 5mL不同浓度的子实体多糖溶液(O. 10-1. Omg/mL)与3. OmL的O.004%溶于95%乙醇的DPPH溶液；对照管用95%乙醇代替DPPH溶液；空白管用蒸馏水代替多糖溶液。以上三组置于室温静置30min后，用O. 55mL蒸馏水和3. OmL 95%的乙醇调零，于517nm处测定吸光值。
结果显示
(I)还原力测定试验组和阴性对照组比较，P < O. 01，显示在还原力方面两者有高度显著性差异，表明其具有一定的还原力；试验组不同浓度的多糖之间进行比较时，P > O. 05，表明试验组不同浓度之间的还原力没有显著性差异；试验组与阳性对照组相比，P< O. 05,表明多糖的还原力不及抗坏血酸。
(2)对羟基自由基的清除试验组和阴性对照组比较，P < O. 05，显示两者在对羟基自由基的清除方面有显著性差异，表明茶树菇子实体多糖具有一定的清除羟基自由基能力；试验组不同浓度的多糖之间进行比较时，当浓度大于O. 2mg/mL时，P < O. 05，表明多糖从O. 2mg/mL开始随着浓度的升高，其清除羟基自由基的能力增强；试验组与阳性对照组相比，P < O. 05，表明多糖对羟基自由基的清除能力不及抗坏血酸。
(3)对超氧阴离子的清除能力试验组和阴性对照组比较，P < O. 05，显示两者对超氧阴离子的清除率有显著性差异，前者清除超氧阴离子的能力高于后者；试验组不同浓度的多糖之间进行比较时，P < O. 05，表明随着多糖浓度的增大，清除能力也相应增强，达到一定浓度时，趋于稳定；试验组与阳性对照组相比，P < O. 05，表明多糖对超氧阴离子的清除能力不及抗坏血酸。
(4)对DPPH的清除能力；试验组和阴性对照组比较，P < O. 01，显示两者在对DPPH 的清除能力方面有高度显著性差异，表明多糖具有一定的清除DPPH能力；试验组不同浓度的多糖之间进行比较时，P > O. 05，表明试验组不同浓度之间对DPPH的清除能力没有显著性差异；试验组与阳性对照组相比，P < O. 05，表明多糖对DPPH的清除能力不及抗坏血酸。
权利要求
1.一种具有抗氧化活性的茶树菇子实体多糖的制备方法，是茶树菇子实体通过粉碎， 脱脂，热水浸提，离心，上清液浓缩，乙醇沉淀，Sevage法脱蛋白，H2O2脱色，透析后冷冻干燥得到的。提取得率为3. 63g/100g子实体干重，测得多糖含量为97.8%。可应用于制备具有抗氧化，抗疲劳功能的保健品。
2.如权利要求I所述的脱脂，其特征在于将茶树菇子实体粉碎后加入Soxhelt提取器， 以乙醚作为溶剂，进行回流脱脂8h。
3.如权利要求I所述热水浸提，其特征在于提取温度80°C_95°C，加水量为30倍体积固形物，总提取时间为12h，提取3次。
4.如权利要求I所述的脱蛋白，其特征在于用木瓜蛋白酶和Sevage法联合去除游离蛋白，先在5%的糖溶液中加入1% (w/v)的木瓜蛋白酶于58±2°C，pH6. 5条件下反应4h，然后按发酵液1/5的体积加入氯仿，然后加入氯仿体积1/5的正丁醇，混合后振荡20min，蛋白质与氯仿_正丁醇生成凝胶，4000rpm离心20min,收集上清液,反复操作8次至氯仿-正丁醇层不浑浊为止。
5.如权利要求I所述透析，其特征在于4°C醇析过夜后的离心沉淀物用蒸馏水复溶后取IOOmL装入透析袋中，扎紧袋口，悬浮于蒸馏水中，透析72h，中间每隔12h换水一次。
6.如权利要求I所述的凝胶层析柱纯化，其特征在于用的是葡聚糖凝胶G-200填料。
全文摘要
本发明属生物工程技术应用领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的茶树菇子实体多糖的制备方法。该茶树菇子实体多糖为白色或淡黄色粉末，是茶树菇子实体通过粉碎，脱脂，热水浸提，乙醇沉淀，脱蛋白，脱色、葡聚糖凝胶柱G-200层析、透析后冷冻干燥得到的。提取得率为3.63g/100g子实体干重，用苯酚-硫酸法测得多糖含量为97.8％，可应用于制备具有抗氧化，防衰老功能的保健品。
文档编号C08B37/00GK102911284SQ201210464469
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者邓超, 陈敬华, 程咏梅, 陈荆晓, 付海田 申请人:江南大学