专利名称：一种从刺参中提取糖胺聚糖的方法
技术领域：
本发明属于生物技术天然活性物质提取领域，具体涉及一种从刺参中提取糖胺聚糖的方法。
背景技术：
慢性乙型肝炎是全球面临的一个严峻的健康问题，中国、东南亚及非洲是HBV感染的高发区，同时这些地区HBV相关性肝病如原发性肝癌的发生率也明显高于美洲中部和南部等HBV感染的低发区。慢性乙型肝炎治疗主要包括抗病毒、免疫调节、抗炎保肝、抗纤维化以及对症治疗，其中进行有效抗病毒治疗，持久抑制HBV DNA于PCR常规可检测范围以下是治疗的关键。硫酸多糖无论在体内还是在体外，都显示了不同程度的抗病毒、抗肿瘤和对免疫系统的调节作用。研究表明，硫酸多糖和其他聚阴离子物质可干扰反转录病毒及其他病毒的吸附和侵入，有些表现出对各种反转录病毒的逆转录酶的抑制活性。硫酸多糖的抗病毒活性首先源于其聚阴离子特性，聚阴离子特性则主要源于其分子中的硫酸基。海洋是一个巨大的天然产物宝库，丰富的海洋生物和海洋活性物质为我们提供一个巨大的海洋药物资源库。特殊的海洋生态环境与生物链之间的密切相关性使得海洋生物次生代谢产物具有与陆生生物所不同的化学结构和特异高效的生物活性，因此对海洋生物多糖的开发应用具有重大意义。从海洋活性多糖中寻找治疗慢性乙型肝炎的有效药物，已引起国内外医药界的密切关注。刺参糖胺聚糖(StichopusJapomicus selenka GlycosaminoGlycans, SJ-GAG),旧称刺参酸性粘多糖或刺参粘多糖，是从刺参体壁中提取的一种硫酸多糖，系由D-N-乙酰氨基半乳糖、D-葡萄糖醛酸、L-岩藻糖和硫酸基组成，相对分子质量在4至5万道尔顿左右，。刺参糖胺聚糖在溶液中以离子形式存在，具有与带正电的离子或成分相互作用的能力，属于聚阴离子。刺参唐胺聚糖聚阴离子性质以及在溶液终的不同构想构成了其多种生物学作用的基础。现在的刺参糖胺聚糖的提取方法主要包括碱裂解法、酶消化法以及乙醇沉淀法。但上述制备方法不能获得纯度高的刺参糖胺聚糖，其主要原因是唐胺聚糖的化学结构有着显著的重叠性，如分子量差异法、硫酸化程度不一致、构想复杂、显微结构不均匀以及残基数量变化等，尤其在一个特定蛋白质聚糖分子上，其含有的唐胺聚糖链的种类、数量存在差异，使得现有的刺参糖胺聚糖的制备方法很难获得纯度高的刺参糖胺聚糖。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种从刺参中提取糖胺聚糖的方法，将刺参糖胺聚糖用纤维素离子交换柱层析法纯化，得到纯度较高的刺参糖胺聚糖。本发明的技术方案为；一种从刺参中提取糖胺聚糖的方法，包括下列步骤步骤一鲜刺参欲处理；步骤二 碱解刺参体壁；步骤三双酶酶解刺参体壁；步骤四酶解完毕后，用三氯乙酸去除双酶酶解液中的蛋白质；步 骤五用乙醇沉淀刺参糖胺聚糖；步骤六干燥刺参糖胺聚糖粗糖；步骤七用纤维素离子交换柱层析法纯化刺参糖胺聚糖；步骤八干燥刺参糖胺聚糖精糖。优化的，所述步骤七的具体步骤为将50g 二乙氨基乙基纤维素用缓冲液浸泡过夜，脱气后装柱，用2倍柱床体积的缓冲液平衡；将30mg糖胺聚糖粗糖用IOmL缓冲液在40 60°C下溶解上柱，用缓冲液和1. 5mol/L的NaCl各150mL梯度洗脱，流速采用8mL/h，以3mL/管收集；用阿利新蓝比色法检测各管总糖胺聚糖的含量，收集有洗脱峰部分的样液，透析脱盐后，旋转蒸发器浓缩。优化的，所述缓冲液采用O. 5mol/L的NaAC，其pH为6. O 6. 5。本发明中所述DEAE-52纤维素为二乙氨基乙基纤维素，本发明对采用的试剂、材料和仪器没有特殊要求，其均为市售产品，可通过多种商业渠道购得。本发明的有益效果在于建立了一种有效地制备高纯度的刺参糖胺聚糖的方法，在碱法提取的同时，结合胰蛋白酶和胃蛋白酶的双酶消化处理，即首先采用碱处理刺参组 织，再用胰蛋白酶和胃蛋白酶水解，以增强刺参体壁组织汇总糖胺聚糖的释放。为提高糖胺聚糖的纯度，本发明采用纤维素离子交换柱层析法纯化刺参糖胺聚糖粗糖。本发明的方法能够平衡刺参糖胺聚糖的得率与纯度的关系，提高了刺参糖胺聚糖的纯度。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。实施例1
本实施例的从刺参中提取糖胺聚糖的方法，包括下列步骤步骤一鲜刺参欲处理；步骤二 碱解刺参体壁；步骤三双酶酶解刺参体壁；步骤四酶解完毕后，用三氯乙酸去除双酶酶解液中的蛋白质；步骤五用乙醇沉淀刺参糖胺聚糖；步骤六干燥刺参糖胺聚糖粗糖；步骤七用纤维素离子交换柱层析法纯化刺参糖胺聚糖；步骤八干燥刺参糖胺聚糖精糖。各步骤的具体方法为
步骤一鲜刺参欲处理；迅速用蒸馏水冲洗刺参，去除刺参体表粘附的异物，用长形小刀自腹部仅肛门向前解剖鲜参，立即剔除内脏，迅速用双蒸水洗去污物，称量后将刺参体壁置于洁净的大烧杯中，剪碎刺参体壁；
步骤二 碱解刺参体壁往刺参体壁中加2倍重量的双蒸水，然后加入2mol/L的NaOH,边加边搅拌，使NaOH溶液终浓度为O. 5mol/L, 4°C过夜消化；
步骤三刺参体壁的双酶酶解
胰蛋白酶酶解用冰醋酸调解PH值至8. 2，加入刺参体壁质量O. 45%的胰蛋白酶，52°C水浴5h，水浴过程中充分搅拌，并滴加5 mmol/L的NaOH溶液，维持pH在8. 2 ;然后将酶解液迅速冷却至30°C以下,保持30min后终止反应；
胃蛋白酶酶解用6mol/L HCl调解pH值至2之间，再添加刺参体壁质量O. 40%的胃蛋白酶，在50°C的水浴中继续酶解4h，水浴过程中充分搅拌；酶解终止前取酶解液5mL与玻璃试管中，滴加5%的三氯乙酸溶液进行检测，当溶液呈微混浊时，将酶解液迅速冷却至30°C以下，保持30min终止酶解反应；然后以5000r/min离心15min收集上清夜；
步骤四酶解完毕后，用三氯乙酸处理双酶酶解上清夜，三氯乙酸的添加量为酶解液的10%，逐步添加，边加边搅拌，使酶解液变混浊为止；将溶液保存在冷藏室中静置12h，然后以5000r/min离心25min收集上清夜；
步骤五乙醇沉淀刺参糖胺聚糖滴加5mmol/L的NaOH溶液调解上清液的pH值至
6.8，7000r/min离心lOmin，收集上清加入无水乙醇，边加边搅拌，使乙醇终浓度为55%，4°C过夜沉淀；
步骤六干燥刺参糖胺聚糖粗糖7000r/min离心IOmin,收集沉淀,用95%的乙醇洗漆3次，再依次用无水乙醇和丙酮分别洗涤和脱水I次；使沉淀物种的乙醇和丙酮自然挥发，沉淀物半干燥时，用低温真空干燥机进一步干燥，得到粗制刺参糖胺聚糖；
步骤七将50g DEAE-52纤维素用缓冲液浸泡过夜，脱气后装柱，用2倍柱床体积的缓冲液平衡；将30mg糖胺聚糖粗糖用IOmL缓冲液在40°C下溶解上柱，用缓冲液和1. 5mol/L的NaCl各150mL梯度洗脱，流速采用8mL/h，以3mL/管收集；用阿利新蓝比色法检测各管总糖胺聚糖的含量，收集有洗脱峰部分的样液，透析脱盐后，旋转蒸发器浓缩。所述缓冲液 采用 O. 5mol/L 的 NaAC，其 pH 为 6. O。步骤八干燥刺参糖胺聚糖精糖
将浓缩物分别用80%、95%、100%乙醇洗涤I次，再依次用无水乙醇和丙酮分别洗涤和脱水I次；然后使沉淀物中的乙醇和丙酮自然挥发，沉淀物半干燥时，用低温真空干燥机进一步干燥，得到的白色干燥无定型粉末即为精制多糖。实施例2
本实施例的从刺参中提取糖胺聚糖的方法，包括下列步骤步骤一鲜刺参欲处理；步骤二 碱解刺参体壁；步骤三双酶酶解刺参体壁；步骤四酶解完毕后，用三氯乙酸去除双酶酶解液中的蛋白质；步骤五用乙醇沉淀刺参糖胺聚糖；步骤六干燥刺参糖胺聚糖粗糖；步骤七用纤维素离子交换柱层析法纯化刺参糖胺聚糖；步骤八干燥刺参糖胺聚糖精糖。各步骤的具体方法为
步骤一鲜刺参欲处理；迅速用蒸馏水冲洗刺参，去除刺参体表粘附的异物，用长形小刀自腹部仅肛门向前解剖鲜参，立即剔除内脏，迅速用双蒸水洗去污物，称量后将刺参体壁置于洁净的大烧杯中，剪碎刺参体壁；
步骤二 碱解刺参体壁往刺参体壁中加2倍重量的双蒸水，然后加入2mol/L的NaOH,边加边搅拌，使NaOH溶液终浓度为O. 5mol/L, 4°C过夜消化；
步骤三刺参体壁的双酶酶解
胰蛋白酶酶解用冰醋酸调解PH值至9. O，加入刺参体壁质量O. 45%的胰蛋白酶，520C水浴5h，水浴过程中充分搅拌，并滴加5 mmol/L的NaOH溶液，维持pH在9. O ;然后将酶解液迅速冷却至30°C以下,保持30min后终止反应；
胃蛋白酶酶解用6mol/L HCl调解pH值至2. 5之间，再添加刺参体壁质量O. 40%的胃蛋白酶，在50°C的水浴中继续酶解4h，水浴过程中充分搅拌；酶解终止前取酶解液5mL与玻璃试管中，滴加5%的三氯乙酸溶液进行检测，当溶液呈微混浊时，将酶解液迅速冷却至300C以下，保持30min终止酶解反应；然后以5000r/min离心15min收集上清夜；
步骤四酶解完毕后，用三氯乙酸处理双酶酶解上清夜，三氯乙酸的添加量为酶解液的10%，逐步添加，边加边搅拌，使酶解液变混浊为止；将溶液保存在冷藏室中静置12h，然后以5000r/min离心25min收集上清夜；
步骤五乙醇沉淀刺参糖胺聚糖滴加5mmol/L的NaOH溶液调解上清液的pH值至7.2，7000r/min离心lOmin，收集上清加入无水乙醇，边加边搅拌，使乙醇终浓度为55%，4°C过夜沉淀；
步骤六干燥刺参糖胺聚糖粗糖7000r/min离心IOmin,收集沉淀,用95%的乙醇洗漆3次，再依次用无水乙醇和丙酮分别洗涤和脱水I次；使沉淀物种的乙醇和丙酮自然挥发，沉淀物半干燥时，用低温真空干燥机进一步干燥，得到粗制刺参糖胺聚糖；
步骤七将50g DEAE-52纤维素用缓冲液浸泡过夜，脱气后装柱，用2倍柱床体积的缓冲液平衡；将30mg糖胺聚糖粗糖用IOmL缓冲液在60°C下溶解上柱，用缓冲液和1. 5mol/L的NaCl各150mL梯度洗脱，流速采用8mL/h，以3mL/管收集；用阿利新蓝比色法检测各管总糖胺聚糖的含量，收集有洗脱峰部分的样液，透析脱盐后，旋转蒸发器浓缩。所述缓冲液·采用 O. 5mol/L 的 NaAC，其 pH 为 6. 5。步骤八干燥刺参糖胺聚糖精糖
将浓缩物分别用80%、95%、100%乙醇洗涤I次，再依次用无水乙醇和丙酮分别洗涤和脱水I次；然后使沉淀物中的乙醇和丙酮自然挥发，沉淀物半干燥时，用低温真空干燥机进一步干燥，得到的白色干燥无定型粉末即为精制多糖。本发明实施例中所实施的从刺参中提取糖胺聚糖的方法，均能够平衡刺参糖胺聚糖得率与纯度的关系，提高刺参糖胺聚糖的纯度。
权利要求
1.一种从刺参中提取糖胺聚糖的方法，其特征在于包括下列步骤步骤一鲜刺参欲处理；步骤二 碱解刺参体壁；步骤三双酶酶解刺参体壁；步骤四酶解完毕后，用三氯乙酸去除双酶酶解液中的蛋白质；步骤五用乙醇沉淀刺参糖胺聚糖；步骤六干燥刺参糖胺聚糖粗糖；步骤七用纤维素离子交换柱层析法纯化刺参糖胺聚糖；步骤八干燥刺参糖胺聚糖精糖。
2.根据权利要求1所述的一种从刺参中提取糖胺聚糖的方法，其特征在于所述步骤七的具体步骤为将50g 二乙氨基乙基纤维素用缓冲液浸泡过夜，脱气后装柱，用2倍柱床体积的缓冲液平衡；将30mg糖胺聚糖粗糖用IOmL缓冲液在40 60°C下溶解上柱，用缓冲液和1. 5mol/L的NaCl各150mL梯度洗脱，流速采用8mL/h，以3mL/管收集；用阿利新蓝比色法检测各管总糖胺聚糖的含量，收集有洗脱峰部分的样液，透析脱盐后，旋转蒸发器浓缩。
3.根据权利要求2所述的一种从刺参中提取糖胺聚糖的方法，其特征在于所述缓冲液采用 O. 5mol/L 的 NaAC，其 pH 为 6. O 6. 5。
全文摘要
本发明属于生物技术天然活性物质提取领域，具体涉及一种从刺参中提取糖胺聚糖的方法。其包括下列步骤步骤一鲜刺参欲处理；步骤二碱解刺参体壁；步骤三双酶酶解刺参体壁；步骤四酶解完毕后，用三氯乙酸去除双酶酶解液中的蛋白质；步骤五用乙醇沉淀刺参糖胺聚糖；步骤六干燥刺参糖胺聚糖粗糖；步骤七用纤维素离子交换柱层析法纯化刺参糖胺聚糖；步骤八干燥刺参糖胺聚糖精糖。本发明能够平衡刺参糖胺聚糖得率与纯度的关系，提高刺参糖胺聚糖的纯度。
文档编号C08B37/00GK102993325SQ20121058527
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月30日 优先权日2012年12月30日
发明者宣世英, 姜曼, 李雪洁, 林中华, 姜相君, 辛永宁 申请人:青岛市市立医院