专利名称：水溶性荧光树枝状大分子的合成方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于树枝状大分子合成、基因载体及生物细胞标记领域，特别涉及一类合成可生物降解的茈类荧光树枝状大分子应用于非病毒体系的基因载体。
背景技术：
伴随先进生物技术疗法的发展，基因导入体系变得更加重要。目前常用的基因载体主要有病毒型和非病毒型两大类，病毒型基因转染载体具有安全问题及低基因转染效率的局限性，限制了它们的应用范围。研发具有安全性的非病毒基因载体一直是生物材料领域的热点研究课题。目前研究较多的非病毒基因载体体系主要有阳离子多聚合物型载体、可生物降解的聚合物体系、多复合物脂质体体系、热敏型聚合物体系等。研究得比较多的阳离子型基因载体有聚乙烯亚胺(PEI)、聚赖氨酸(PLL)以及聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM ),其中树枝状高分子的应用研究尤其受到重视。茈及其衍生物具有很好的光、热、化学稳定性、几乎100%的荧光量子产率(FQY)、窄的荧光发射峰、能够与细胞背景荧光(395-479nm)分开以及优异的染色性能，已广泛应用于有机光电器件、激光染料以及生物荧光探针领域。近年来，此类化合物已经应用于生物领域，如蛋白质靶向标记和细胞特异性标记等，然而水溶性差直接影响了它在这一领域的应用，因此提高此类化合物的水溶性及在水溶液中保持高荧光量子产率具有重要意义。在茈的外围进行功能基团修饰可以使其最大吸收峰发生很大红移，能够更好的避开细胞背景荧光。树枝状大分子由于其精确的三维纳米分子结构，分子内部存在着大量空腔、携带大量的表面官能团，能够广泛应用于生物医药领域，如药物载体和基因载体等。目前所合成的以茈衍生物为荧光 核的树枝状大分子都具有良好的水溶性、生物相容性、较低的细胞毒性以及优异的细胞标记特性。然而，这些大分子合成步骤繁琐，需要对中间产物保护与解保护，而保护/去保护的过程往往会反应不完全且伴有副反应，从而导致树枝状大分子结构存在缺陷；同时，这些合成的茈衍生物树枝状大分子呈现电中性，还没有报道将它们应用于药物载体和基因载体等方面。因而，发明一种简单、高效的制备水溶性的茈类衍生物荧光树枝状大分子的方法，对于其在生物医药领域(如细胞标记、药物载体、基因载体等)具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一类光、热、化学稳定性好、水溶性好、可生物降解、结构可设计性的茈类荧光树枝状大分子，且其具有很好的生物相容性、细胞标记性。首先通过成熟的合成方法制备携带四个伯胺官能团的茈荧光核A0，然后通过不对称单体选择性“点击”化学反应，合成不同代数、携带不同官能团的荧光树枝状大分子。将携带不同氨基官能团的荧光阳离子树枝状大分子B1、B2和B3分别与活体细胞进行培养，研究其穿透细胞膜的能力；将B1、B2和B3分别与DNA复合，然后与细胞进行培养，研究其运载基因的能力。
合成一类以茈衍生物为荧光核的树枝状大分子，包括:(1)携带官能基团的茈类衍生物及其类似物(本发明选择多环芳香族烃的萘，芘，茈，terylene和它们的衍生物作为荧光发射团)与不对称单体AB (AB型不对称单体为甲基丙烯酰氧基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酰氧基丙烯酸丙酯或甲基丙烯酰氧基乙氧基乙氧基丙烯酸乙酯)反应后，重复依次加入不对称单体巯基乙胺和AB，通过AB与巯基乙胺之间选择性“点击”化学反应制备茈类荧光树枝状大分子。(2)茈荧光树枝状大分子端基的官能化修饰:将羟基、PEG链功能基团引入到荧光树枝状大分子的最外围末端。(3)水溶性阳离子荧光树枝状大分子应用于基因载体，研究B1、B2、B3穿透细胞膜及运载基因能力。其具体制备步骤为:1.树枝状大分子的设计合成1.1首先以商业荧光化合物四溴茈酐(4Br-PDA)为原料，经过酰胺化反应合成具有高荧光量子产率的茈类衍生物4Br-PBI ;然后利用取代反应将氨基引入到茈核的“海岛”位置，从而得到携带四个伯胺基团的茈类化合物AO (化合物AO属于茈类荧光发射团系列)，其结构式如下:
权利要求
1.水溶性荧光树枝状大分子的合成方法，其特征在于: 四个伯胺基团的茈类化合物，以下简称化合物A0，化合物AO的结构式如下:
2.根据权利要求1所述的水溶性荧光树枝状大分子的合成方法，其特征在于还包括: 将上述Al和巯基乙胺按照摩尔比在1:9-1:11之间溶解在二甲基亚砜DMSO中，在氮气氛围下室温搅拌30-45min后，得到氨基官能化的第一代荧光树枝状大分子BI。
3.根据权利要求2所述的水溶性荧光树枝状大分子的合成方法，其特征在于还包括: 将上述化合物BI和MAEA按照摩尔比在1:32-1:80之间混合加入反应管中，在氮气氛围下室温搅拌过夜，然后在48-53°C反应56-72h，得到端甲基丙烯酸酯的第二代荧光树枝状大分子A2。
4.根据权利要求3所述的水溶性荧光树枝状大分子的合成方法，其特征在于还包括: 将上述A2和巯基乙胺按照摩尔比在1:18-1:21之间溶解在二甲基亚砜DMSO中，在氮气氛围下室温搅拌30-45min后，得到氨基官能化的第二代荧光树枝状大分子B2。
5.根据权利要求4所述的水溶性荧光树枝状大分子的合成方法，其特征在于还包括: 将上述化合物B2和MAEA按照摩尔比在1:80-1:400之间混合加入反应管中，在氮气氛围下室温搅拌过夜，然后在48-53°C反应72-120h，得到端甲基丙烯酸酯的第三代荧光树枝状大分子A3 ； 将上述A3和巯基乙胺按照摩尔比在1:38-1:42之间溶解在二甲基亚砜DMSO中，在氮气氛围下室温搅拌30-45min后，得到氨基官能化的第三代荧光树枝状大分子B3。
6.根据权利要求1或3或5所述的水溶性突光树枝状大分子的合成方法,其特征在于还包括: 将上述Al和巯基甘油按照摩尔比在1:18-1:22之间溶解在DMSO中，并以三乙胺为催化剂，氮气氛围下室温搅拌22-26h后，得到羟基官能化的第一代荧光树枝状大分子Cl ；将上述A2和巯基甘油按照摩尔比在1:36-1:42之间溶解在DMSO中，并以三乙胺为催化剂，氮气氛围下室温搅拌35-38h后，得到羟基官能化的第二代荧光树枝状大分子C2 ；将上述A3和巯基甘油按照摩尔比在1:80-1:100之间溶解在DMSO中，并以三乙胺为催化剂，氮气氛围下室温搅拌38-48h后，得到羟基官能化的第三代荧光树枝状大分子C3。
7.根据权利要求2或4所述的水溶性荧光树枝状大分子的合成方法，其特征在于还包括:化合物AO与乙氧基乙氧基乙基丙烯酸酯在无溶剂、无催化剂、氮气氛围下室温搅拌过夜，然后在48-52°C反应48-56h，合成出了端PEG链的第一代茈类荧光树枝状大分子Dl ；化合物BI与乙氧基乙氧基乙基丙烯酸酯在无溶剂、无催化剂、氮气氛围下室温搅拌过夜，然后在48-55°C反应68-72h，合成出了端PEG链的第二代茈类荧光树枝状大分子D2 ；化合物B2与乙氧基乙氧基乙基丙烯酸酯在无溶剂、无催化剂、氮气氛围下室温搅拌过夜，然后在48-60°C反应78-100h，合成出了端PEG链的第三代茈类荧光树枝状大分子D3。
8.采用权利要求2或4或5所述方法合成的大分子的应用，其特征在于还包括: 将合成的树枝状大分子BI，B2, B3用1-4M的酸酸化处理后，按加入细胞培养液中，培养活体细胞I小时以上后，这些分子都能进入活体细胞；这些分子能和外源核酸物质DNA或RNA结合,充当载体, 携带外源核酸物质转染活体细胞。
全文摘要
本发明公开了水溶性荧光树枝状大分子的合成方法及其应用。该类树枝状大分子采用“发散法”或“收敛法”制备了不同代数、携带不同官能团的荧光树枝状大分子。其中外围携带铵盐阳离子的荧光树枝状大分子具有良好的水溶性和生物相容性，能够进入活细胞，并且能与负电性的DNA结合，可以作为基因载体将外源核酸构件DNA或RNA带入细胞。细胞摄取实验表明随着代数的增加，树枝状大分子穿透细胞膜及运载基因的能力增强。本发明具有合成简便、效率高、产品纯化简单等优点，且合成的树枝状大分子安全低毒、水溶性优异、光稳定性好，可作为多功能细胞荧光标记分子、基因载体，应用于生物医药领域的科学研究和基因诊断。
文档编号C08G83/00GK103204999SQ20131009519
公开日2013年7月17日 申请日期2013年3月22日 优先权日2013年3月22日
发明者尹梅贞, 许泽军, 何碧程, 沈杰 申请人:北京化工大学