序列表
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发明领域
本发明涉及新的经改造的蛋白质和蛋白质复合物，包括具有单或多特异性的异多聚体(例如单链抗体、多链抗体和免疫粘附素-抗体复合物)、其构建和生产方法。本发明也涉及用于获得单或多特异性异多聚体的技术的新应用。本文提供的方法产生的异多聚体可用作任何疾病或病理状态的治疗剂，以及其中使用抗体是有利的的任何其他用途。
发明背景
开发用于生产可用于商业和治疗目的并可扩展，具有不同的结合特征(例如单特异性或多特异性)的抗体或其他异多聚体的技术一直很困难。已经尝试了许多方法，但几乎所有方法都存在显著的缺点，例如在哺乳动物细胞中难以溶解或不能表达、表现出异二聚体形成的产量低、技术上难以制造或有免疫原性、在体内显示短半寿期、或不稳定等等(例如Hollinger等人,(1993)PNAS 90:6444-6448；US5,932,448；US6,833,441；US 5,591,828；US7,129,330；US7,507,796；Fischer等人,(2007)Pathobiology 74:3-14；Booy(2006)Arch.Immunol.Ther.Exp.54:85-101；Cao等人,(2003)55:171-197和Marvin等人,(2006)Current Opinion in Drug Discovery&Development 9(2):184-193)。因此，存在对生产具有不同结合特征的抗体或其他异多聚体的改进的技术和工艺的需求。
发明概述
本发明提供异多聚体(例如新单链抗体(scAb)、多链抗体(mcAb)和免疫粘附素-抗体复合物)以及创造、生产和使用该异多聚体的方法。一方面，本发明的特征为异多聚体单链抗体，包含连接第一重链可变(VH)结构域和第二VH结构域的异二聚化(HD)系链(tether)，其中异多聚体包含选自第一CH2结构域、第一CH3结构域、第二CH2结构域和第二CH3结构域的一个或多个重链恒定(CH)结构域。在一个实施方式中，异多聚体包含至少一对重链恒定结构域。在另一个实施方式中，异多聚体可包含位于一条或两条重链上的VH和CH2结构域之间的铰链结构域。在另一实施方式中，异多聚体包含第一和/或第二CH1结构域。所述一个或两个CH1结构域位于一个或两个VH结构域的C端和一个或两个铰链结构域的N端，或者在不存在铰链结构域的情况下，一个或两个CH2结构域的N端。在特别实施方式中，异多聚体也可包含一个或两个轻链可变(VL)结构域，由一个或两个CLH系链(同族LC-HC系链)连接到第一和/或第二VH结构域的N端。在一些实施方式中，异多聚体还包含一个或两个轻链恒定(CL)结构域，各位于一个或两个VL结构域的C端，并紧邻一个或两个CLH系链的N端。
另一方面，本发明的特征为异多聚体单链抗体，其包含单个多肽，如下具有在N端到C端方向相对彼此放置的以下结构域：VL1-CL1-CLH系链1-VH1-CH11-铰链1-CH21-CH31-HD系链-VL2-CL2-CLH系链2-VH2-CH12-铰链2-CH22-CH32。
另一方面，本发明的特征为多链抗体异多聚体，其包含3条多肽链，其中第一和第二多肽链相同，各形成轻链(LC)，并且第三条多肽链形成第一重链(HC)和第二HC。第一和第二多肽链各包含VL和CL结构域。第三多肽链包含两个VH结构域、HD系链、一个或两个铰链结构域，以及选自第一CH1结构域、第一CH2结构域、第一CH3结构域、第二CH1结构域、第二CH2结构域和第二CH3结构域的一个或多个重链恒定结构域，其中第二多肽链的组分在从N端到C端方向如下相对彼此放置：VH1-任选的CH11-任选的铰链1-任选的CH21-任选的CH31-HD系链-VH2-任选的CH12-任选的铰链2-任选的CH22-任选的CH32。
另一方面，本发明的特征为多链抗体异多聚体，其包含两个多肽链，其中第一多肽链形成第一轻链(LC)，第二多肽链形成第一重链(HC)、第二LC和第二HC。第一多肽链包含第一VL和CL结构域。第二多肽链包含两个VH结构域、HD系链、第二VL结构域、第二CL结构域、CLH系链、一个或两个铰链结构域，以及选自第一CH1结构域、第一CH2结构域、第一CH3结构域、第二CH1结构域、第二CH2结构域和第二CH3结构域的一个或多个重链恒定结构域，其中第二多肽链的组分在从N端到C端方向如下相对彼此放置：VH1-任选的CH11-任选的铰链1-任选的CH21-任选的CH31-HD系链-VL2-CL2-CLH系链-VH2-任选的CH12-任选的铰链2-任选的CH22-任选的CH32。
另一方面，本发明的特征为多链抗体异多聚体，其包含两个多肽链，其中第一多肽链形成第一LC、第一HC和第二HC，第二多肽链形成第二LC。第一多肽链包含两个VH结构域、HD系链、第一VL结构域、第一CL结构域、CLH系链、一个或两个铰链结构域，以及选自第一CH1结构域、第一CH2结构域、第一CH3结构域、第二CH1结构域、第二CH2结构域，和第二CH3结构域的一个或多个重链恒定结构域，其中第二多肽链的组分在从N端到C端方向如下相对彼此放置：VL1-CL1-CLH系链-VH1-任选的CH11-任选的铰链1-任选的CH21-任选的CH31-HD系链-VH2-任选的CH12-任选的铰链2-任选的CH22-任选的CH32。第二多肽链包含第二VL和CL结构域。
另一方面，本发明的特征为异多聚体，其包含两条多肽链，其中第一多肽链包含免疫粘附素，所述免疫粘附素包含粘附素和一个或多个重链恒定结构域(例如CH21和/或CH31)，第二多肽链形成包含VH结构域和一个或多个重链恒定结构域(例如CH1、CH22和/或CH32)的半抗体，并且第一和第二多肽链由HD系链彼此相连，以形成单个多肽链。异多聚体的组分在从N端到C端方向如下相对彼此放置：粘附素-任选的CH21-任选的CH31-HD系链-VH-任选的CH1-任选的CH22-任选的CH32。HD系链促进免疫粘附素和半抗体的一个或多个恒定结构域之间的相互作用。在一个实施方式中，CLH系链促进半抗体的轻链和重链组分之间的相互作用，以获得具有在从N端到C端方向如下相对彼此放置的组分的异多聚体：粘附素-任选的CH21-任选的CH31-HD系链-VH-CL-CLH系链-VH-任选的CH1-任选的CH22-任选的CH32。在另一个实施方式中，半抗体轻链的VL和CL结构域由第二多肽提供，所述第二多肽与第一多肽链的半抗体的重链缔合，以形成轻链-重链同族对。在另一个实施方式中，异多聚体的免疫粘附素部分可包含在其粘附素和重链恒定结构域组分之间的氨基酸间隔子。在一个实施方式中，间隔子包括甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基，例如GGS重复。在另一个实施方式中，间隔子长为10-80个氨基酸之间，例如20-40个残基之间。
本发明的异多聚体可包含长度为15-100氨基酸之间的HD系链。在特别的实施方式中，HD系链长度为30-39个氨基酸之间，例如长度为30、31、32、33、34、35、36、37、38或39个氨基酸。在一个实施方式中，系链包含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基。在另一个实施方式中，系链包含GGS重复。在优选的实施方式中，系链包含8至9个GGS重复(SEQ ID NO:19)。
本发明的异多聚体也可包含一个或多个CLH系链。在一个实施方式中，所述一个或多个CLH系链每者长度为10-80个氨基酸之间。在特别的实施方式中，所述一个或多个CLH系链每者长度为20-40个氨基酸之间。在一个实施方式中，系链包含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基。在另一个实施方式中，系链包含GGS重复。
在另一个实施方式中，本发明的HD和CLH系链的一个或多个可被以下内肽酶中的一种或多种切割：弗林蛋白酶、尿激酶、凝血酶、组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPa)、genenase、Lys-C、Arg-C、Asp-N、Glu-C、因子Xa,烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)、肠激酶、人鼻病毒C3蛋白酶(HRV C3)或激肽原酶。在优选的实施方式中，至少一个系链可被弗林蛋白酶切割。在另一个实施方式中，本发明的一个或多个系链中至少一个可在位于或靠近系链N端和C端的两个位点被切割。优选地，对于HD系链，两个切割位点之一是弗林蛋白酶切割位点，另一个切割位点是Lys-C切割位点。优选地对于CLH系链，一个或多个CLH系链的N端和C端的切割位点都可被弗林蛋白酶切割。在某些实施方式中，弗林蛋白酶切割位点包含氨基酸序列RKRKRR(SEQ ID NO:9)。在某些其他实施方式中，弗林蛋白酶切割位点包含氨基酸序列RHRQPR(SEQ ID NO:10)。在一个实施方式中，内肽酶切割在原位发生。在某些实施方式中，内肽酶在宿主细胞中重组表达。在另一个实施方式中，内肽酶切割在纯化后在加入内肽酶后发生。
本发明的异多聚体可具有一个或多个(例如两个)CLH系链，接头，各自包含以下一个或多个特异性内肽酶的一个或多个切割位点：羧肽酶A、羧肽酶B、血浆羧肽酶B(又名羧肽酶U或凝血激活性纤维蛋白溶解抑制剂(TAFI))、羧肽酶D、羧肽酶E(又名脑啡肽转化酶或羧肽酶H)、羧肽酶M、羧肽酶N或羧肽酶Z。在优选的实施方式中，本发明的异多聚体可被羧肽酶B外肽酶切割。在一个实施方式中，外肽酶切割在原位发生。在某些实施方式中，外肽酶在宿主细胞中重组表达。在另一个实施方式中，外肽酶切割在纯化后在加入外肽酶后发生。如本文所用，羧肽酶B可指该类羧肽酶或具体的羧肽酶。作为类，羧肽酶B包含除羧肽酶A外的所有具体羧肽酶。作为具体羧肽酶，羧肽酶B又名羧肽酶U或TAFI。本领域技术人员可根据术语使用的上下文，容易地区分作为类的羧肽酶B和作为具体外肽酶的羧肽酶B。
在另一个实施方式中，本发明的异多聚体可包含一个或多个铰链结构域，包括但不限于包含人IgG1的Glu216至Pro230的铰链结构域。在一些实施方式中，一个或两个铰链结构域都包含移去Lys-C内肽酶切割位点的突变。在一个实例中，移去Lys-C内肽酶切割位点的突变是K222A替换(EU编号系统)。
本发明的异多聚体可以是单特异性的。在一个实施方式中，本发明的单特异性异多聚体包含结合相同表位靶但可以不同亲和力结合的两个半抗体。在另一个实施方式中，本发明的单特异性异多聚体包含与免疫粘附素缔合的半抗体，各自对于相同的结合伙伴或表位是特异性的。
本发明的异多聚体可以是双特异性的或多特异性的。在一个实施方式中，异多聚体能够结合至少两个抗原。在另一个实施方式中，异多聚体能够结合相同抗原上的至少两个表位。在另一个实施方式中，本发明的双特异性或多特异性异多聚体包含与免疫粘附素缔合的半抗体，其各自对于不同的结合伙伴或表位是特异性的。
在另一个实施方式中，本发明的异多聚体包含与细胞毒性剂缀合的恒定区。
在另一个实施方式中，异多聚体可包含具有凸起或空腔的两个重链恒定结构域(例如两个CH3结构域)，其中一个重链恒定结构域(例如CH31结构域)的凸起或空腔可分别置入第二个重链恒定结构域(例如CH32结构域)的空腔或凸起中。优选地，两个恒定结构域在包含凸起和空腔的界面相遇。在另一个实施方式中，异多聚体可包含至少一个轻链恒定结构域和一个重链恒定结构域界面(例如CL/CH1界面)，其中轻链恒定结构域(例如CL结构域)和重链恒定结构域(例如CH1结构域)至少部分地通过凸起-空腔相互作用而相互作用。
在另一个实施方式中，本发明的异多聚体包含位于其CH21或CH22中的CH2结构域突变，所述突变导致具有改变的效应子功能的抗体。在优选的实施方式中，CH2结构域突变是N297突变。在某些实施方式中，N297突变是N297A突变。在某些其他实施方式中，CH2结构域还包含D256A突变。
其他方面，本发明的特征为生产异多聚体的方法。另一方面，本发明的特征为编码本发明的异多聚体的多聚核苷酸。其他方面，本发明的特征为包含本发明的多聚核苷酸的载体和包含该载体的宿主细胞。在一个实施方式中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在优选的实施方式中，哺乳动物细胞是CHO细胞。在一个实施方式中，宿主细胞是原核细胞。在其他实施方式中，原核细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞。其他方面，本发明的特征是生产异多聚体的方法，所述方法包括在培养基中培养包含具有编码异多聚体的多聚核苷酸的载体的宿主细胞。优选地，从宿主细胞或宿主细胞的培养基中回收异多聚体。
其他方面，本发明提供了包含单个多肽的单链抗体，其包含在从N端到C端方向相对彼此放置的以下结构域：VL1-CL1-CLH系链1-VH1-CH11-铰链1-CH21-CH31-HD系链-VL2-CL2-CLH系链2-VH2-CH12-铰链2-CH22-CH32，其中CLH系链1、CLH系链2和HD系链各包含可被弗林蛋白酶内肽酶切割的氨基酸序列。在方面的某些实施方式中，可被弗林蛋白酶切割的序列包含氨基酸序列RKRKRR(SEQ ID NO:9)，而在其他实施方式中，可被弗林蛋白酶切割的序列包含氨基酸序列RHRQPR(SEQ ID NO:10)。在相关方面，本发明提供编码本发明的单链抗体的多聚核苷酸分子、包含该多聚核苷酸的载体和包含该载体的宿主细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于CHO细胞。在某些其他实施方式中，宿主细胞是原核细胞，包括但不限于大肠杆菌细胞。在其他相关的方面，本发明提供生产单链抗体的方法，所述方法包括在培养基中培养包含载体的宿主细胞。在某些实施方式中，方法还包括从所述宿主细胞或所述培养基中回收所述单链抗体。
本发明的其他特征和优点从以下的发明详述、附图和权利要求书显而易见。
附图简述
图1是说明包含三个可切割系链的示例性异多聚体单链抗体的结构的示意图。内肽酶切割位点用三角形指示。还说明了任选的K222A突变。
图2是说明示例性异多聚体单链抗体的LC、HC、系链和切割位点的排列的示意图。切割位点由RKRKRRG(GGS)6GRSRKRR(SEQ ID NO:14)和(GGS)(8-10)RSRKRR(SEQ ID NO:15-17)示例。弗林蛋白酶识别位点表示为RXRXRR(SEQ ID NO:8)。
图3A是弗林蛋白酶切割后的异多聚体单链抗体的实例。括号内的残基(RKRKRR(SEQ ID NO:9)和RKRKR(SEQ ID NO:18))表示在用蛋白A柱纯化前可被内源性外肽酶移除，导致C端残缺的残基。还说明了任选的K222A突变。
图3B是弗林蛋白酶、Lys-C和外肽酶(例如羧肽酶B)处理后的异多聚体单链抗体的实例。还说明了任选的K222A突变。
图4是切割移除系链前的示例性的缀合的异多聚体单链抗体。还说明了任选的缀合的部分，例如毒素、抗生素等，以及任选的K222A突变。
图5A是说明含有一个可切割系链的示例性异多聚体多链抗体的结构的示意图。两个未连接的LC可独立于含有系链的多肽表达。未连接的LC可在与连接的重链相同或不同的细胞中表达。未连接的LC可在相同或不同的质粒中表达。还说明了任选的缀合的部分，例如毒素、抗生素等，以及任选的K222A突变。
图5B是说明含有两个可切割系链的示例性异多聚体多链抗体的结构的示意图。HD系链通过经连接的LC，间接地将第一HC与第二HC相连。未连接的LC可独立于含有系链的多肽表达。未连接的LC可在与连接的重链相同或不同的细胞中表达。未连接的LC可在相同或不同的质粒中表达。还说明了任选的K222A突变。
图5C是说明含有两个可切割系链的示例性异多聚体多链抗体的结构的示意图。HD系链直接连接第一HC和第二HC。未连接的LC可独立于含有系链的多肽表达。未连接的LC可在与连接的重链相同或不同的细胞中表达。未连接的LC可在相同或不同的质粒中表达。还说明了任选的K222A突变。
图6A-6D是说明Octet分析结果的图。(A)图B-D曲线的组合。(B)示例性异多聚体单链抗体同时结合抗原1和抗原2。(C和D)抗体1和抗体2不与彼此的抗原交叉反应，但结合其各自的抗原。x轴是时间，单位为秒。y轴是相对吸光度。引用实施例3。
发明详述
在产生单特异性或多特异性(例如双特异性)抗体或其他具有不同结合性质、有多条多肽链的异多聚体时，通常发生不希望的重链同二聚化。我们已经发现可通过产生单链单特异性或多特异性异多聚体避免这一常见问题，所述异多聚体的组装由一个或多个系链指导。不限于理论，我们相信HD系链能够使得不同的Fc重链组分以高精确度和效率结合，获得包含以相同或不同亲和力结合相同靶或不同靶的两个半分子(例如两个半抗体)的功能异多聚体。具有相连接的重链组分的异多聚体可额外地包含不同的轻链组分，获得具有完整互补的重链和轻链的功能性单链单特异性或多特异性异多聚体(例如抗体)。根据本发明的额外的系链可用于连接异多聚体的轻链和重链，从而帮助每个轻链与其同族重链的适当缔合。
本文说明的制造异多聚体的方法的用途允许生产从单个或多个多肽序列产生的基本上同质的单特异性或多特异性异多聚体群。用本文说明的方法产生的异多聚体可用于识别病原途径中的多于一个靶，或用于共定位特异性靶(例如肿瘤细胞)和针对该靶的活性剂(例如T细胞)。此外，由于消除了对靶向两个抗原的组合疗法的需求，以及与向对象提供两个或多个治疗剂相关的风险，本文说明的异多聚体是有优势的。
I.定义
本文中的术语“抗体”以最宽泛的含义使用，指任何包含两条重链和两条轻链的免疫球蛋白(Ig)分子，及其任何片段、突变体、变体或衍生物只要其显示理想的生物活性(例如表位结合活性)。抗体的实例包括单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体和抗体片段。
在提及可变结构域中的残基时(约为轻链中的残基1-107和重链中的残基1-113)，通常使用Kabat编号系统(例如，Kabat等人,Sequences of Immunological Interest.第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如Kabat等人，同上中报道的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号。除非本文中另有说明，提及抗体可变结构域中的残基号码指由Kabat编号系统编号的残基。除非本文中另有说明，提及抗体重链恒定结构域中的残基号码指由EU编号系统编号的残基。
天然存在的基本4链抗体单位是异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻链(LC)和两条相同的重链(HC)组成(IgM抗体由5个基本异四聚体单位和称为J链的额外的多肽链组成，因此含有10个抗原结合位点，而分泌型IgA抗体可聚合形成包含2-5个基本4链单位和J链的多价集合物)。在IgG的情况下，4链单位通常约为150000道尔顿。每条LC由一个共价二硫键连接至HC，而两条HC根据HC同种型，由一个或多个二硫键彼此连接。每条HC和LC也具有规律间隔的链内二硫桥。每条HC在N端具有可变结构域(VH)，随后对于α和γ链各是三个恒定结构域(CH1、CH2、CH3)，而对于μ和ε同种型是四个Cj结构域。每条LC在N端具有可变结构域(VL)，随后是位于其另一端的恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。CH1可由铰链区连接至重链第二恒定结构域(CH2)。据信特定氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL的配对共同形成单个抗原结合位点。关于不同类的抗体的结构和性质，参见例如Basic and Clinical Immunology,第8版,Daniel P.Stites,Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编),Appleton&Lange,Norwalk,CT,1994，第71页及第6章。
“铰链区”通常限定为人IgG1的Glu216至Pro230的伸展(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985))。其他IgG同种型的铰链区可通过将形成重链间SS键的第一个和最后一个半胱氨酸残基放置在同一位置与IgG1序列对齐。
Fc区的“下铰链区”通常限定为紧邻铰链区C端的残基的片段，即Fc区的残基233至239。在本发明之前，FcγR结合通常被归因于IgG Fc区的下铰链区内的氨基酸残基。
人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从IgG的约残基231延伸至约残基340。CH2结构域是独特的，在于其不与另一结构域紧密配对。相反，完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间插入了两条N-连接的分支糖链。据推测糖可提供结构域-结构域配对的替代，并帮助稳定CH2结构域。Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985).
“CH3结构域”包含Fc区的CH2结构域C端的残基的片段(即从IgG的约氨基酸残基341至约氨基酸残基447)。
根据其恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的轻链(LC)可被分为两个明显不同的类型，称为κ和λ。根据其重链恒定结构域(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同的类或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其具有的重链分别为α、δ、γ、ε和μ。γ和α类根据CH序列和功能中相对较小的差异进一步分为亚类，例如，人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“可变”指可变结构域的某些区段的序列在抗体之间差异巨大。V结构域介导抗原结合，并定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性不是在可变结构域的110个氨基酸跨度内均匀分布的。相反，V区由称为框架区(FR)的15-30个氨基酸的相对不变的片段组成，所述片段由各自长9-12氨基酸的称为“超可变区”的较短的极端变化区分开。天然重链和轻链各包含四个FR，主要采取β-片层构象，由三个超可变区连接，所述超可变区形成环，连接，在一些情况下，形成β-片层结构的部分。每条链中的超可变区被FR维持紧密接近，并与来自其他链的超可变区对形成抗体的抗原结合位点作贡献(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但显示多种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
如本文所用的术语“超可变区”或“HVR”指序列超可变和/或形成结构上确定的环(“超可变环”)的抗体可变结构域的每个区域。一般地，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自超可变环和/或来自“互补性决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别。如本文所用的HVR包含位于位置24-36(对于L1)、46-56(对于L2)、89-97(对于L3)、26-35B(对于H1)、47-65(对于H2)和93-102(对于H3)内的任何数量的残基。因此，HVR包含在(A)、(B)和(C)中先前说明的位置中的残基：(A)24-34(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)，和96-101(H3)(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；(B)L1的24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65和H3的95-102(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；(C)30-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35(H1)、47-58(H2)、93-100a-j(H3)(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。除非另有说明，HVR残基和可变结构域中的其他残基(例如FR残基)在本文中编号根据Kabat等人，同上。
多种HVR描述正在使用，并包含于本文。Kabat互补性决定区(CDR)基于序列可变性，并且是最常用的(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991)。而Chothia涉及结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR和Chothia结构环之间的折衷，并用于Oxford Molecular的AbM抗体建模软件。“接触”HVR基于现有的复杂晶体结构的分析。来自每个上述HVR的残基记录在下表中。
HVR可包含如下的“扩展的HVR”：VL中24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)，以及VH中26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。在上述每个定义中，可变结构域残基根据Kabat等人，同上编号。
“框架区”(FR)是非CDR残基的可变结构域残基。每个可变结构域通常有四个FR，称为FR1、FR2、FR3和FR4。如果根据Kabat定义CDR，轻链FR残基位于约残基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)和98-107(LCFR4)，重链FR残基位于重链残基中约残基1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)和103-113(HCFR4)。如果CDR包含来自超可变环的氨基酸残基，轻链FR残基位于轻链中约残基1-25(LCFR1)、33-49(LCFR2)、53-90(LCFR3)和97-107(LCFR4)，重链FR残基位于重链残基中约残基1-25(HCFR1)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)和102-113(HCFR4)。在一些情况下，当CDR包含来自如Kabat定义的CDR和超可变环的氨基酸时，相应地调整FR残基。例如，当CDRH1包含氨基酸H26-H35时，重链FR1残基位于位置1-25，FR2位于位置36-49。
“人共有框架”是代表了在选择人免疫球蛋白VL或VH框架序列中最常见的氨基酸残基的框架。通常，从可变结构域序列的子集选择人免疫球蛋白VL或VH序列。通常，序列的子集是如Kabat中的子集。在一个实施方式中，对于VL，子集是如Kabat中的κI子集。在一个实施方式中，对于VH，子集是如Kabat中的III子集。
“完整”抗体的一个实例是包含抗原结合位点以及CL和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。
“抗体片段”包含完整抗体的部分，优选地完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体(Db)；串联双抗体(taDb)、线性抗体(例如美国专利5,641,870实施例2；Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单臂抗体、单可变结构域抗体、微抗体(minibody)、单链抗体分子；以及从抗体片段形成的多特异性抗体(例如，包括但不限于Db-Fc、taDb-Fc、taDb-CH3和(scFV)4-Fc)。
“Fab”片段是木瓜蛋白酶消化抗体产生的抗原结合片段，由整个L链和H链的可变结构域(VH)，以及一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的Fab片段。胃蛋白酶处理抗体产生单个大F(ab’)2片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段，并仍能交联抗原。Fab’片段不同于Fab片段之处在于在CH1结构域的羧基端具有额外的数个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab’-SH在本文中指其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离巯基的Fab’。F(ab’)2抗体片段起初是其间有铰链半胱氨酸的Fab’片段对。也已知抗体片段的其他化学偶联。
“Fc”片段是木瓜蛋白酶消化产生的残留抗体片段，命名反映了该片段容易结晶的能力。Fc片段包含由二硫键结合在一起的两条H链的羧基端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列确定；此区也是被某些类型细胞中存在的Fc受体(FcR)识别的部分。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链Fc区的边界可改变，人IgG重链Fc区通常定义为从位置Cys226，或从Pro230的氨基酸残基延伸至其羧基端。Fc区的C端赖氨酸(根据EU编号系统，残基447)可被移除，例如在生产或纯化抗体的过程中，或通过重组地改造编码抗体重链的核酸。因此，完整抗体的组合物可包含全部K447残基被移除的抗体群、K447残基未被移除的抗体群，以及具有有和没有K447残基的抗体的混合物的抗体群。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括结合C1q；CDC；结合Fc受体；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体，BCR)的下调等。此类效应子功能通常需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，并且可用多种如本文的定义部分公开的测定法评估。
“天然序列Fc区”包含与天然存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；和天然序列人IgG4Fc区及其天然存在的变体。
“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰，优选地一个或多个氨基酸替换而与天然序列Fc区不同的氨基酸序列。优选地，变体Fc区与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比，具有至少一个氨基酸替换，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中从约1至约10个氨基酸替换，优选地从约1至约5个氨基酸替换。本文的变体Fc区优选地与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％的同源性，最优选地与其至少约90％的同源性，更优选地与其至少约95％的同源性。
如本文所用的“Fc复合物”指Fc区的两个共同相互作用的CH2结构域和/或两个共同相互作用的CH3结构域，其中CH2结构域和/或CH3结构域通过不是肽键的键和/或力(例如范德华力、疏水作用力、亲水作用力)相互作用。
如本文所用的“Fc组分”指Fc区的铰链区、CH2结构域或CH3结构域。
如本文所用的“Fc CH组分”或“FcCH”指包含Fc区的CH2结构域、CH3结构域或CH2和CH3结构域的多肽。
“Fv”由紧密非共价缔合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。此二个结构域的折叠产生6个超可变环(H和L链各3个环)，其提供用于抗原结合的氨基酸残基，并赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或只包含3个特异于抗原的CDR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，尽管通常比整个结合位点的亲和力低。
如本文所用，术语“免疫粘附素”指组合了异源蛋白(“粘附素”)的结合特异性和免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能的分子。结构上，免疫粘附素包含具有所需结合特异性、不同于抗体的抗原识别和结合位点的氨基酸序列(即与抗体的恒定区相比是“异源的”)与免疫球蛋白恒定结构域序列(例如IgG的CH2和/或CH3序列)的融合物。粘附素和免疫球蛋白恒定结构域可任选地被氨基酸间隔子分开。示例性粘附素序列包括连续氨基酸序列，所述连续氨基酸序列包含结合目标蛋白的受体或配体的部分。粘附素序列也可以是结合目标蛋白的序列，但不是受体或配体序列(例如肽体中的粘附素序列)。此类多肽序列可用多种方法选择或鉴定，包括噬菌体展示技术和高通量分选方法。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可从任何免疫球蛋白获得，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgE、IgD或IgM。
如本文所用的氨基酸“间隔子”指长度为2个或多个氨基酸的氨基酸序列，其不可被例如自切割、酶促或化学切割切割。间隔子可由中性、极性或非极性氨基酸组成。氨基酸间隔子长度可以是例如2至100个氨基酸长，例如10-80个氨基酸长或20-40个氨基酸长，例如3、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸长。在一些实施方式中，氨基酸间隔子可包含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基，例如GGS重复。在一些实施方式中，氨基酸间隔子可包含苏氨酸(T)和组氨酸(H)残基。示例性间隔子是THT(SEQ ID NO:1)、GGGSTHT(SEQ ID NO:2)和GGGSGGGSTHT(SEQ ID NO:3)。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽还在VH和VL结构域之间包含多肽接头，所述多肽接头使得sFv能够形成用于抗原结合的理想的结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)；Malmborg等人,J.Immunol.Methods 183:7-13,1995。
术语“双抗体”指小抗体片段，其是通过构建在VH和VL结构域之间有短接头(约5-10个残基)使得实现V结构域的链间而非链内配对，导致二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段的sFv片段(见上文)而制备的。双特异性双抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域位于不同的多肽链上。双抗体在例如EP 404,097；WO 93/11161和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)中更完整地说明。
表述法“单结构域抗体”(sdAb)或“单可变结构域(SVD)抗体”通常指其中单个可变结构域(VH或VL)可赋予抗原结合的抗体。即，该单个可变结构域不需要与另一可变结构域相互作用以识别靶抗原。单结构域抗体的实例包括源自骆驼科(美洲驼和骆驼)和软骨鱼(例如护士鲨)的那些，以及源自人和小鼠抗体的重组方法的那些(Nature(1989)341:544-546；Dev Comp Immunol(2006)30:43-56；Trend Biochem Sci(2001)26:230-235；Trends Biotechnol(2003)21:484-490；WO 2005/035572；WO 03/035694；Febs Lett(1994)339:285-290；WO00/29004；WO 02/051870)。
本文所用的术语“半抗体”指抗体的一条臂，并至少包含VH结构域和一个CH结构域。在一些实施方式中，半抗体可与免疫粘附素缔合，以形成本发明的异多聚体。在其他实施方式中，第一半抗体可与具有相同或不同的氨基酸序列(例如差别至少一个氨基酸残基)的第二半抗体缔合，以分别形成对称或非对称异多聚体。
术语“单链抗体”在本文中以最宽泛的含义使用，并具体覆盖最初作为单个连续多肽链产生的具有单特异性或多特异性(例如双特异性)的抗体。此类单链抗体包括但不限于，具有两个相连接的、可彼此不同或相同并且包含两个不同或相同的VH结构域的HC、连接该两个HC的HD系链，以及选自两个不同或相同的CH2结构域和两个不同或相同的CH3结构域的至少一个重链恒定结构域的抗体。单链抗体可额外包含一个或两个，不同或相同的CH1结构域。在一些实施方式中，单链抗体包含一个或两个铰链结构域，所述铰链结构域连接一个HC结构域(例如VH或CH1)与第二个连续定位的结构域(例如CH2)。在其他实施方式中，单链抗体可包含一个或两个相连接的LC，它们可彼此不同或相同并且可各可包含2个不同或相同的VL和CL结构域，各通过CLH系链连接到特定HC。如本文所述，单链抗体可额外使用结进孔(knob-into-hole)技术以支持HC/HC或HC/LC异二聚化，并可包含可切割系链。单链抗体是本发明的异多聚体。
如本文所用，术语“多链抗体”指由2条LC和2条HC组成的抗体，其中2条HC作为单条多肽链表达，并且至少1条LC作为单独的多肽链表达。独立表达的LC与其同族HC缔合以形成具有两条功能性臂的抗体。多链抗体可以是单特异性或多特异性的。多链抗体可额外使用结进孔(knob-into-hole)技术以支持HC/HC或HC/LC异二聚化，并可包含可切割系链。
本文提及的术语“结进孔(knob-into-hole)”或“KnH”技术指通过在其相互作用的界面将凸起(结)引入一条多肽中，并将空穴(孔)引入另一条多肽中，在体外或体内指导两条多肽配对的技术。例如，KnH被引入了抗体的Fc:Fc结合界面、CL:CH1界面或VH/VL界面(例如US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431和Zhu等人，(1997)Protein Science 6:781-788)。这在制备多特异性抗体期间，驱动两条不同的重链一起配对中特别有用。例如，在其Fc区具有KnH的多特异性抗体还可包含与每个Fc区连接的单可变结构域，或还包含与相似或不同的轻链可变结构域配对的不同的重链可变结构域。KnH技术也可用于一起配对两个不同的受体细胞外结构域，或包含不同的靶识别序列的任何其他多肽序列。
术语“多特异性抗体”以最宽泛的含义使用并具体覆盖具有多表位特异性的抗体。此类多特异性抗体包括但不限于，包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)、其中VH/VL单位具有多表位特异性的抗体，具有2个或更多VL和VH结构域、每个VH/VL单位结合不同的表位的抗体，具有2个或更多单可变结构域，每个单可变结构域结合不同表位的抗体，全长抗体，抗体片段例如Fab、Fv、dsFv、scFv、双抗体、双特异性双抗体和三价抗体、已经被共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”指特异性结合相同或不同靶上的2个或更多不同表位的能力。“单特异性”指只结合一种抗原的能力。在一个实施方式中，单特异性异多聚体结合相同靶/抗原上的2个不同的表位。根据一个实施方式，多特异性抗体是以5μΜ至0.001pM、3μΜ至0.001pM、1μΜ至0.001pM、0.5μΜ至0.001pM或0.1μΜ至0.001pM的亲和力结合每个表位的IgG抗体。
本发明的抗体可以是“嵌合”抗体，其中重和/或轻链的部分与源自特别物种或属于特别抗体类或亚类的抗体中相应的序列相同或同源，而链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中相应的序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要其表现理想的生物活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。本文的目标嵌合抗体包括包含源自非人灵长类(例如旧世界猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列的灵长类源化的抗体。
非人(例如啮齿类)抗体的“人源化的”形式是含有源自非人抗体的最小序列的嵌合抗体。大多数情况下，人源化的抗体是其中来自受体的超可变区的残基被来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类、具有理想的抗体特异性、亲和力和性能的超可变区的残基代替的人免疫球蛋白(受体抗体)。在一些情况下，人免疫球蛋白框架区(FR)残基被相应的非人残基代替。此外，人源化的抗体可包含不存在于受体抗体或供体抗体中的残基。进行此类修饰以进一步改善抗体性能。通常,人源化的抗体将包含基本上全部或者至少一个，通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部超可变环对应于非人免疫球蛋白的超可变环，而全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化的抗体也任选地包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多详细信息参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
本文所用的“复合物”或“复合的”指通过非肽键的键和/或力(例如范德华力、疏水作用力、亲水作用力)彼此相互作用的两个或更多个分子的缔合。在一个实施方式中，复合物是异多聚体。应当理解，本文所用的术语“蛋白复合物”或“多肽复合物”包含在蛋白复合物中具有缀合至蛋白质的非蛋白物质的复合物(例如包括但不限于化学分子例如毒素或检测剂)。
如本文所用的术语“异多聚体”或“异多聚体的”描述两个或更多具有不同序列，通过非肽共价键(例如二硫键)和/或非共价相互作用(例如氢键、离子键、范德华力或疏水相互作用)彼此相互作用的多肽。具有初始连接的形式的多聚体多肽(例如作为单个连续多肽链形式产生的)也包含于此定义内。如本文所用，异多聚体包括例如单链抗体和多链抗体，以及具有与一个或多个免疫粘附素缔合的一个或多个半抗体的多聚体。异多聚体包括其中存在或不存在HD系链的多肽和/或多肽复合物。
本发明的“结合”目标抗原的抗体是以足够的亲和力结合抗原的抗体，使得抗体可用作靶定蛋白质或表达抗原的细胞或组织的诊断和/或治疗剂，并且不与其他蛋白质显著地交叉反应。在此类实施方式中，如用荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)或ELISA确定的，抗体与“非靶”蛋白质结合的程度少于抗体与其特定靶蛋白结合的约10％。关于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异地结合”或是“特异于”特定多肽或特定多肽靶上的表位表示与非特异性相互作用(例如非特异性相互作用可以是与牛血清白蛋白或酪蛋白的结合)可测量地不同的结合。特异性结合可通过例如确定分子的结合相比对照分子的结合而测量。例如，特异性结合可通过与和靶相似的对照分子，例如过量的未标记靶竞争而确定。在此情况下，如果经标记的靶与探针的结合被过量的未标记靶竞争性抑制，则指示特异性结合。本文所用的术语“特异性结合”或“特异地结合”或是“特异于”特定多肽或特定多肽靶上的表位可被这样的分子展示，所述分子对靶具有约1μM至约1fM，备选地约200nM至约1fM，备选地约200nM至约1pM，备选地约150nM至约1fM，备选地约150nM至约1pM，备选地约100nM至约1fM，备选地约100nM至约1pM，备选地约60nM至约1fM，备选地约60nM至约1pM，备选地约50nM至约1fM，备选地约50nM至约1pM，备选地约30nM至约1fM，备选地约30nM至约1pM，备选地约20nM至约1fM，备选地约20nM至约1pM，备选地约10nM至约1fM，备选地约10nM至约1pM，备选地约8nM至约1fM，备选地约8nM至约1pM，备选地约6nM至约1fM，备选地约6nM至约1pM，备选地约4nM至约1fM，备选地约4nM至约1pM，备选地约2nM至约1fM，备选地约2nM至约1pM，备选地约1nM至约1fM，备选地约1nM至约1pM的Kd。在一个实施方式中，术语“特异性结合”指这样的结合，其中分子结合特定多肽或特定多肽上的表位，而基本不结合其他多肽或多肽表位。
“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合伙伴(例如抗原)之间的总非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文所用的“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其伙伴Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)代表。例如，Kd可以是约200nM、150nM、100nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、1nM或更强。亲和力可用本领域熟知的常用方法测量，包括本文中说明的那些。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原，并倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原，并倾向于保持结合更久。本领域已知多种测量结合亲和力的方法，其中任一种可用于本发明的目的。
在一个实施方式中，根据本发明的“Kd”或“Kd值”通过用使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)的表面等离子共振测定法在25℃用固定化的抗原CM5芯片在～10响应单位(RU)测量。本发明的抗体可其对靶具有约1μM至约1fM，备选地约200nM至约1fM，备选地约200nM至约1pM，备选地约150nM至约1fM，备选地约150nM至约1pM，备选地约100nM至约1fM，备选地约100nM至约1pM，备选地约60nM至约1fM，备选地约60nM至约1pM，备选地约50nM至约1fM，备选地约50nM至约1pM，备选地约30nM至约1fM，备选地约30nM至约1pM，备选地约20nM至约1fM，备选地约20nM至约1pM，备选地约10nM至约1fM，备选地约10nM至约1pM，备选地约8nM至约1fM，备选地约8nM至约1pM，备选地约6nM至约1fM，备选地约6nM至约1pM，备选地约4nM至约1fM，备选地约4nM至约1pM，备选地约2nM至约1fM，备选地约2nM至约1pM，备选地约1nM至约1fM，备选地约1nM至约1pM的Kd值的亲和力。为通过使用表面等离子共振测定法测量Kd值，根据供应商的说明用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CMS,BIAcore Inc.)。用10mM醋酸钠，pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μΜ)，然后以5μl/分的流速注射，以获得约10响应单位(RU)的偶联的蛋白。在注射抗原后，注射1M乙醇胺，以封闭未反应基团。为进行动力学测量，在25℃以约25μl/min的流速注射在含0.05％Tween20的PBS(PBST)中的Fab的二倍系列稀释液(例如0.78nM至500nM)。通过同时拟合缔合和解离传感图，用简单一对一Langmuir结合模型(one-to-one Langmuir binding model)(BIAcore评估软件版本3.2)计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以koff/kon的比值计算。参见例如Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果用上述表面等离子共振测定法测得的缔合速率超过106M-1S-1，则可用荧光淬灭技术测量缔合速率，该技术在存在如分光计(诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌比色杯的8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic))测量的浓度增加的抗原的条件下，在25℃测量PBS，pH7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
根据本发明的“缔合速率”或“kon”也可通过上文所述相同的使用BIACoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)的表面等离子共振技术在25℃使用固定化的抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测定。简而言之，根据供应商的说明用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CMS,BIAcore Inc.)。用10mM醋酸钠，pH4.8将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μΜ)，然后以5μl/分的流速注射，以获得约10响应单位(RU)的偶联的蛋白。在注射抗原后，注射1M乙醇胺，以封闭未反应基团。为进行动力学测量，在25℃以约25μl/min的流速注射在含0.05％Tween20的PBS(PBST)中的Fab的二倍系列稀释液(例如0.78nM至500nM)。通过同时拟合缔合和解离传感图，用简单一对一Langmuir结合模型(BIAcore评估软件版本3.2)计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以koff/kon的比值计算。参见例如Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果用上述表面等离子共振测定法测得的缔合速率超过106M-1S-1，则可用荧光淬灭技术测量缔合速率，该技术在存在如分光计(诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌比色杯的8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic))测量的浓度增加的抗原的条件下，在25℃测量PBS，pH7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
除非另有说明，关于本发明的多肽，例如抗体、其片段或衍生物的“生物活性的”和“生物特征”指具有结合生物分子的能力。
本发明的异多聚体通常纯化至基本同质。短语“基本同质的”、“基本上同质的形式”和“基本同质”用于表示产品基本不含源自不希望的多肽组合的副产品。
用纯度的方式表达，基本同质表示副产品的量不超过按重量计10％、9％、8％、7％、6％、4％、3％、2％或1％，或者少于按重量计1％。在一个实施方式中，副产品低于5％。
“生物分子”指核酸、蛋白质、碳水化合物、脂及其组合。在一个实施方式中，生物分子天然存在。
当用于说明本文公开的多种异多聚体时，“分离的”表示异多聚体已被鉴定并从表达其的细胞或细胞培养物分开和/或回收。其天然环境的污染物组分是通常干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白质性溶质。在优选的实施方式中，异多聚体将纯化(1)至足以用旋杯测序仪获得至少15个残基的N端或内部氨基酸序列的程度，或(2)通过在非还原条件或还原条件下使用考马斯蓝，优选地银染色的SDS-PAGE至同质性。分离的异多聚体包括位于重组细胞内原位的抗体，因为多肽天然环境的至少一个组分不会存在。然而，通常分离的多肽将由至少一个纯化步骤制备。
本文所用的“连接的”或“连接”指第一和第二氨基酸序列之间的直接肽键连接或者涉及肽键结合到并且在第一和第二氨基酸序列之间的第三氨基酸序列的连接。例如，结合到一个氨基酸序列C端和另一氨基酸序列N端的氨基酸接头。
本文所用的“接头”指两个或更多氨基酸长的氨基酸序列。接头可由中性、极性或非极性氨基酸组成。接头长度可以是例如2至100个氨基酸长，例如2至50个氨基酸长，例如3、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。接头可以是“可切割的”，例如被自切割或者酶促或化学切割。本领域熟知氨基酸序列中的切割位点和在此类位点切割的酶和化学物，并在本文中也有说明。
本文所用的“HD系链”或“异二聚化系链”指联结两个不同的含重链恒定(CH)结构域的多肽的氨基酸接头。通常，该两个含CH结构域的多肽是通过将第一多肽的CH2或CH3结构域与VL结构域连接而联结到一起的，所述VL结构域自身是第二含CH的多肽的组分。在一些实施方式中，HD系链将第一多肽的CH3结构域直接连接至第二含CH结构域的多肽的VH结构域。通常，15-100个氨基酸的HD系链是有效的，同样20-40个氨基酸、25-40个氨基酸和30-40个氨基酸的HD系链是有效的。在特别实施方式中，HD系链为30-39个氨基酸长(例如30、31、32、33、34、35、36、37、38或39个氨基酸长)。HD系链可以是“可切割的”，例如通过自切割，或者使用本领域标准的方法或试剂的酶促或化学切割。
本文所用的“CLH系链”或“同族LC-HC系链”指联结轻链和其同族重链的氨基酸接头。CLH系链通常指将轻链的CL结构域与重链的VH结构域连接的氨基酸。在一些实施方式中，CLH系链将轻链的VL结构域直接连接至重链的VH结构域。通常，10-80个氨基酸的CLH系链是有效的，同样20-40个氨基酸、25-40个氨基酸、30-40个氨基酸和35-40个氨基酸(例如30、31、32、33、34或35个氨基酸)的CLH系链是有效的。本发明的单链抗体可具有多个CLH系链，它们的序列和/或长度可相同或不同。在优选的实施方式中，单链抗体具有两个系链(CLH系链1和CLH系链2)，各连接轻链和其同族重链。CLH系链可以是“可切割的”，例如通过自切割，或者使用本领域标准的方法或试剂的酶促或化学切割。
“接头”或“系链”的酶促切割可涉及使用内肽酶，诸如，例如，尿激酶、Lys-C、Asp-N、Arg-C、V8、Glu-C、糜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝血酶、组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPa)、genenase、因子Xa、TEV(烟草蚀纹病毒蛋白酶)、肠激酶、HRV C3(人鼻病毒C3蛋白酶)、激肽原酶，以及枯草杆菌蛋白酶样前蛋白转化酶(例如弗林蛋白酶(PC1)、PC2或PC3)或N-精氨酸二碱转化酶。在所希望的实施方式中，酶促切割涉及内肽酶弗林蛋白酶。化学切割也涉及使用例如羟胺、N-氯代琥珀酰亚胺、N溴代琥珀酰亚胺或溴化氰。
本文所用的“弗林蛋白酶内肽酶切割位点”是X1-X2-X3-精氨酸氨基酸序列(SEQ ID NO:6)，其中X1是碱性氨基酸残基(天然或非天然、经修饰或未修饰的)，X2和X3各自可以是可被弗林蛋白酶内肽酶在C端侧切割的任何氨基酸残基(天然或非天然、经修饰或未修饰的)。弗林蛋白酶内肽酶在精氨酸残基的C端侧切割。在某些实施方式中，弗林蛋白酶切割位点包含氨基酸序列RXRXYR，其中Y是K或R，X是任何氨基酸残基(SEQ ID NO:7)，更具体地RXRXRR(SEQ ID NO:8)。在某些实施方式中，弗林蛋白酶切割位点包含氨基酸序列RKRKRR(SEQ ID NO:9)。在某些其他实施方式中，弗林蛋白酶切割位点包含氨基酸序列RHRQPR(SEQ ID NO:10)。在其他实施方式中，弗林蛋白酶切割位点包含氨基酸序列RSRKRR(SEQ ID NO:11)。
本文所用的“Lys-C内肽酶切割位点”是氨基酸序列中的赖氨酸残基，所述赖氨酸残基可被Lys-C内肽酶在C端侧切割。Lys-C内肽酶在赖氨酸残基的C端侧切割。
“接头”或“系链”的酶促切割也可涉及使用外肽酶，例如羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶D、羧肽酶E(也称为羧肽酶H)、羧肽酶M、羧肽酶N或羧肽酶Z，以在内肽酶切割后移除残留的内肽酶识别序列。
抗体“效应子功能”指可归因于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性，可随抗体同种型而改变。抗体效应子功能的实例包括：结合C1q和补体依赖性细胞毒性；结合Fc受体；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞激活。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”即“ADCC”指细胞毒性的形式，其中结合于存在于某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应子细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，然后用细胞毒性剂杀死靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞，是此类杀伤绝对需要的。介导ADCC的主要细胞NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上FcR的表达总结于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)464页上的表3中。为评估目标分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定，例如美国专利号5,500,362或5,821,337中说明的。对此类测定有用的效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选或额外地，目标分子的ADCC活性可在体内，例如动物模型中评估，例如Clynes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的。
“Fc受体”或“FcR”描述了结合抗体的Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括此类受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活性受体”)和FcγRIIB(抑制性受体)，二者具有相似的氨基酸序列，主要区别在于其胞质结构域。激活性受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述M.in Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)；Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994)和de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中综述。本文的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括留待将来鉴定的。术语也包含新生儿受体FcRn，它负责将母体IgG转运到胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))。
“人效应子细胞”是表达一种或多种FcR，并执行效应子功能的白细胞。优选地，细胞至少表达FcγRIII，并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，其中优选PBMC和NK细胞。效应子细胞可从天然源，例如血液分离。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指靶细胞在补体的存在下裂解。经典补体途径的激活是以补体系统的第一组分(C1q)与结合了其同族抗原的(适当亚类的)抗体的结合起始的。为评估补体激活，可进行如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中说明的CDC测定。
术语“治疗有效量”指用于治疗对象中疾病或病症的异多聚体、抗体、抗体片段或衍生物的量。在肿瘤(例如癌症肿瘤)的情况下，治疗有效量的异多聚体、抗体或抗体片段(例如多特异性抗体或抗体片段)可减少癌细胞数量；减小原发肿瘤大小；抑制(即在一定程度上减缓，优选地阻止)癌细胞渗透入外周器官；抑制(即在一定程度上减缓，优选地阻止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或多种与病症相关的症状。在异多聚体、抗体或抗体片段可阻止生长和/或杀伤已有癌细胞的程度上，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症治疗，体内效力可以通过例如评估生存时间、疾病进展时间(TTP)、响应率(RR)、响应持续时间和/或生活质量测量。
“降低或抑制”表示导致总体降低优选地20％或更高，更优选地50％或更高，最优选地75％、85％、90％、95％或更高的能力。降低或抑制可指所治疗的病症的症状、转移瘤的存在或大小、原发肿瘤的大小、血管生成病症中的血管大小或数量。
本文所用的术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。术语意欲包含放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、Ra223、P32和Lu的放射性同位素)、化疗剂例如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花碱类(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、道诺霉素或其他插入剂、酶及其片段例如核分解酶、抗生素以及毒素例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体，以及本文公开的多种抗肿瘤、抗癌和化疗剂。本文公开了其他细胞毒性剂。杀肿瘤剂导致肿瘤细胞破坏。
“化疗剂”是用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括化疗剂的例子包括烷化剂类，诸如噻替哌(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸酯，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，诸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺类(ethylenimine)和methylamelamine，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；acetogenin(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻醇(屈大麻酚(dronabinol)，)；β-拉杷醌(beta-lapachone)；拉杷醌醇(lapachol)；秋水仙碱类(colchicine)；桦木酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan)()、CPT-11(依立替康(irinotecan)，)、乙酰喜树碱(acetylcamptothecin)、scopolectin和9-氨基喜树碱(9-aminocamptothecin))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；念珠藻环肽(cryptophycins)(特别是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成的类似物、KW-2189和CB1-TM1)；艾植素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆怜酸胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆留醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲怜胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲类(nitrosureas)如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如，卡里奇霉素(calicheamicin)、特别是卡里奇霉素γ1(参见例如，Agnew，Chem Intl.编辑.Engl.,33:183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色素蛋白烯二炔类抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素类(bleomycin)、放线菌素(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星(morpholino-doxorubicin)、氰基吗啉代多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、2-吡咯代多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)和脱氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培来霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿啶(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、羟甲雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡内酯(aceglaone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；醋酸羟吡咔唑(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin))；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2’,2”-三氯三乙胺(2,2',2”-trichlorotriethylamine)；单端孢菌素类(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；噻替哌(thiotepa)；类紫杉醇(taxoid)，如紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)、不含克列莫佛(Cremophor)、白蛋白改造纳米颗粒剂型紫杉醇(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和多西他塞(doxetaxel)(Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨(gemcitabine)6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨喋呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)奥沙利铂(oxaliplatin)；亚叶酸(leucovorin)；长春瑞宾(vinorelbine)诺安托(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊拜膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoid)，诸如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)以及上述任何物质的制药学可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两个或更多的组合，例如CHOP，环磷酰胺(cyclophosphamide)、多柔比星(doxorubicin)、长春新碱(vincristine)和泼尼松龙(prednisolone)的组合治疗的缩写，以及FOLFOX，用奥沙利铂(oxaliplatin)(ELOXATINTM)组合5-FU和亚叶酸(leucovorin)的治疗方法的缩写。
此定义也包含起调控、减少、阻断或抑制可以促进癌症生长的激素的作用的抗激素活性剂，所述抗激素活性剂通常处在系统治疗或全身治疗形式中。它们可以是激素本身。实例包括抗雌激素药和选择性雌激素受体调节物(SERM)，包括例如，他莫昔芬(tamoxifen)(包括他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene),4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen),曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)；抗黄体酮药；雌激素受体下调剂(ERD)；起作用抑制或关闭卵巢的活性剂，例如，黄体生成激素释放素(LHRH)激动剂如和醋酸亮丙立德(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和tripterelin；其它抗雄激素药诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡鲁胺(bicalutamide)；和抑制芳香酶的芳香酶抑制剂(aromatase inhibitors),该酶调节肾上腺中的雌激素生成，例如4(5)-咪唑类(4(5)-imidazoles)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、依西美坦(exemestane)、赴美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole)、来曲唑(letrozole)和阿那曲唑(anastrozole)。此外，所述化疗剂的定义包含二膦酸盐(bisphosphonates)如氯膦酸盐(clodronate)(例如，或)、依替膦酸盐(etidronate)、NE-58095、唑来膦酸(zoledronic acid)/唑来膦酸盐(zoledronate)、阿仑膦酸盐(alendronate)、帕米膦酸盐(pamidronate)、替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戍环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸、特别是抑制异常细胞增生所涉及的信号传导途径中的基因表达的那些，诸如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗诸如疫苗和基因治疗疫苗，例如疫苗、疫苗和疫苗；拓扑异构酶I抑制剂； GnRH拮抗剂；二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinib ditosylate)(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016)；和上述任意物质的制可药用的盐、酸或衍生物。
本文所用的术语“生长抑制剂”指在体外或体内抑制细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低S期细胞百分比的活性剂。生长抑制剂的实例包括(在非S期的位置)阻断细胞周期前进的活性剂，例如诱导G1停滞和M期停滞的活性剂。经典的M期阻断剂包括长春花碱类(例如长春新碱和长春碱)、紫杉烷类和拓扑异构酶II抑制剂例如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。阻滞G1的活性剂也溢出到S期停滞，例如DNA烷基化剂诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、氮烯唑胺(dacarbazine)、氮芥(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。其他信息参见Molecular Basis of Cancer,Mendelsohn和Israel(编),第1章，题为"Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs"，Murakami等人(WB Saunders:Philadelphia,1995)，特别是第13页。紫杉烷类(紫杉醇和多西他赛)是源自紫杉树的抗癌药物。多西他赛(Rhone-Poulenc Rorer)源自欧洲紫杉，是紫杉醇(Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进微管蛋白二聚体组装成微管并通过阻止解聚稳定微管，导致抑制细胞中有丝分裂。
本文所用的“抗癌治疗”指降低或抑制对象中癌的治疗。抗癌治疗的实例包括细胞毒性放疗以及向对象给药治疗有效量的细胞毒性剂、化疗剂、生长抑制剂、癌疫苗、血管发生抑制剂、前体药、细胞因子、细胞因子拮抗剂、皮质类固醇、免疫抑制剂、抗呕吐剂、抗体或抗体片段或止痛剂。
“靶分子”指可结合本发明的蛋白复合物(优选地以根据Scatchard分析高于lμM Kd的亲和力结合)的分子。靶分子的实例包括但不限于血清可溶性蛋白及其受体，例如细胞因子和细胞因子受体、粘附素、生长因子及其受体、激素、病毒颗粒(例如RSVF蛋白、CMV、StaphA、流感病毒、丙肝病毒)、微生物(例如细菌细胞蛋白、真菌细胞)、粘附素、CD蛋白及其受体。
“对象”是脊椎动物，例如哺乳动物，例如人。哺乳动物包括但不限于家畜(例如牛)、运动动物、宠物(例如猫、狗和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。
除非另有说明，实施例中涉及的商购试剂根据制造商的说明使用。在下文的实施例中，以及整个说明书中的细胞的来源由American Type Culture Collection,Manassas,VA的ATCC检索号识别。除非另有说明，本发明使用重组DNA技术的标准实验方案，例如上文和以下教科书中说明的：Sambrook等人,同上；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing Associates and Wiley Interscience,NY,1989)；Innis等人,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press,Inc.,NY,1990)；Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,1988)；Gait,Oligonucleotide Synthesis(IRL Press,Oxford,1984)；Freshney,Animal Cell Culture,1987；Coligan等人,Current Protocols in Immunology,1991。
在本说明书和权利要求书中，单词“包含”，或变异“包含”或“包含的”应被理解为包括说明的事物或事物的集合，但不排除任何其他事物或事物的集合。
本申请所用的术语“前体药”指药物学活性物质的前体或衍生物形式，与母体药物相比可任选地对肿瘤细胞细胞毒性较低，并能被酶激活或转化为更有活性的母体形式。参见例如Wilman,“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”Biochemical Society Transactions,14,第375-382页,615th Meeting Belfast(1986)和Stella等人,“Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,”Directed Drug Delivery,Borchardt等人,(编),第247-267页,Humana Press(1985)。前体药包括但不限于含磷酸盐的前体药、含硫代磷酸盐的前体药、含硫酸盐的前体药、含肽的前体药、D-氨基酸修饰的前体药、糖基化的前体药、含β-内酰胺的前体药、含任选地取代的苯氧乙酰胺的前体药或含任选地取代的苯乙酰胺的前体药、5-氟胞嘧啶和其他可被转化为更有活性的细胞毒性游离药物的5-氟尿苷前体药。可被衍生为用于本发明的前体药形式的细胞毒性药物的实例包括但不限于上述化疗剂。
术语“细胞因子”指由一种细胞群释放的、作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素例如人生长激素(HGH)、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类诸如卵泡刺激激素(FSH)、甲状腺刺激激素(TSH)和黄体生成激素(LH)；表皮生长因子(EGH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子(FGF)；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素(activin)；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子例如NGF-α；血小板生长因子；转化生长因子类(TGF)例如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factor)；干扰素诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)；和粒细胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-18；肿瘤坏死因子诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。本文所用的术语细胞因子包含来自天然源或重组细胞培养物的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物活性同等物。
“细胞因子拮抗剂”指部分或完全阻断、抑制或中和至少一种细胞因子的生物活性的分子。例如，细胞因子拮抗剂可通过抑制细胞因子表达和/或分泌，或通过结合细胞因子或细胞因子受体，抑制细胞因子活性。细胞因子拮抗剂包括抗体、异多聚体、合成或天然序列肽、免疫粘附素和结合细胞因子或细胞因子受体的小分子拮抗剂。细胞因子拮抗剂任选地与细胞毒素剂缀合或融合。
本文所用的术语“免疫抑制剂”指作用以抑制或掩蔽治疗对象的免疫系统的物质。这包括抑制细胞因子产生、下调或抑制自体抗体表达或掩蔽MHC抗原的物质。免疫抑制剂的实例包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(见美国专利号4,665,077)；霉酚酸吗啉乙酯(mycophenolate mofetil)例如硫唑嘌呤(azathioprine)/6-巯基嘌呤；溴隐亭(bromocryptine)；达扎唑(danazol)；氨苯砜(dapsone)；戊二醛(如美国专利号4,120,649中所述，它掩蔽MHC抗原)；MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A；类固醇，诸如皮质类固醇和糖皮质类固醇，如泼尼松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)诸如(泼尼松龙磷酸钠)或(泼尼松龙磷酸钠口服溶液)、甲基泼尼龙(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone)；甲氨蝶呤(methotrexate)(口服或皮下)(TREXALLTM)；羟氯喹/氯喹(hydroxycloroquine/chloroquine)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；来氟米特(leflunomide)；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗干扰素-α、-β或-γ抗体、抗肿瘤坏死因子-α抗体(英夫利昔单抗或阿达木单抗)、抗TNF-α免疫黏附素(依那西普(etanercept))、抗肿瘤坏死因子-β抗体、抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗LFA-1抗体，包括抗CD11a和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；多克隆或泛T(pan-T)抗体，或单克隆抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合结构域的可溶性肽(WO 90/08187)；链激酶(streptokinase)；TGF-β；链道酶(streptodornase)；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin)；T细胞受体(Cohen等人，美国专利号5,114,721)；T细胞受体片段(Offner等人，Science 2251：430-432(1991)；WO 90/11294；Ianeway，Nature341：482(1989)；及WO 91/01133)；T细胞受体抗体(EP 340,109)诸如T10B9；环磷酰胺(cyclophosphamide)氨苯砜(dapsone)；青霉胺(penicillamine)血浆置换(plasma exchange)；或静脉内免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin)(IVIG)。以上可单独使用或彼此组合使用，特别是类固醇和另一免疫抑制剂的组合，或此类组合之后是非类固醇活性剂的维持剂量以降低对类固醇的需求。
“止痛剂”指作用以抑制或平定对象中疼痛的药物。示例性止痛剂包括非类固醇抗炎药物(NSAID)，包括布洛芬(ibuprofen)萘普生(naproxen)乙酰水杨酸(acetylsalicylic acid)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)和托美汀(tolmetin)，包括其盐和衍生物，以及多种其他用于降低可能发生的刺痛的药物，包括抗惊厥药(anticonvulsant)(巴喷丁(gabapentin)、phenyloin、卡马西平(carbamazepine))或三环抗抑郁药(tricyclic antidepressant)。具体实例包括对乙酰氨基酚(acetaminophen)、阿司匹林(aspirin)、阿米替林(amitriptyline)卡马西平(carbamazepine)phenyltoin加巴喷丁(gabapentin)(E)-N-香草基-8-甲基-6-壬烯酰胺或神经阻断剂。
“皮质类固醇”指具有类固醇的一般化学结构，模拟或提高天然存在皮质类固醇的效果的数种合成的或天然存在的物质的任一种。合成的皮质类固醇的实例包括泼尼松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)(包括甲基泼尼龙(methylprednisolone))、地塞米松(dexamethasone)、曲安西龙(triamcinolone)和倍他米松(betamethasone)。
本文所用的“癌症疫苗”是刺激对象中针对癌症的免疫应答的组合物。癌症疫苗通常由对对象自体(来自自身)或同种异体(来自其他)的癌症相关材料或细胞的来源(抗原)和用于进一步刺激和促进针对抗原的免疫应答的其他组分(例如佐剂)组成。癌症疫苗可导致刺激对象的免疫系统，产生针对一种或多种特异性抗原的抗体，和/或产生杀伤T细胞以攻击具有上述抗原的癌细胞。
“抗呕吐剂”是降低或防止对象恶心的化合物。抗呕吐化合物包括例如神经激肽-1受体拮抗剂、5HT3受体拮抗剂(例如奥坦西隆(ondansetron)、格兰西龙(granisetron)、曲匹西龙(tropisetron)和zatisetron)、GABAB受体激动剂例如巴氯芬(baclofen)、皮质类固醇例如地塞米松(dexamethasone)、或抗多巴胺剂、吩噻嗪类(例如氯吡嗪(prochlorperazine)、氟非那嗪(fluphenazine)、甲硫哒嗪(thioridazine)和美索哒嗪(mesoridazine))、屈大麻酚(dronabinol)、甲氧氯普胺(metroclopramide)、多潘立酮(domperidone)、氟哌啶醇(haloperidol)、劳拉西泮(lorazepam)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)、和levomopromazine。
II.单链和多链系链连接的抗体和其他异多聚体的构建
本文说明的异多聚体，包括单特异性和多特异性(例如双特异性)抗体可通过使用一个或多个系链构建。
系链的使用允许构建在单个异多聚体内具有不同重链和/或轻链的相对纯的异多聚体群。具体地，如上所述，抗体通常包含两条相同的重链，各自与两条相同的轻链之一配对。使用本发明的系链技术允许在由单一多肽链形成的单一异多聚体抗体的形成中不同的抗体重链彼此二聚化。系链可连接第一重链与第二重链，通常通过连接第一重链的CH3结构域和轻链的VL结构域，轻链自身通过第二系链与第二重链连接。在异多聚体单链抗体中，第三系链可直接连接第二轻链和第一重链，从而产生包含两条不同的重链的异多聚体，每条重链可各自与其同族轻链配对。在其他实施方式中，系链可通过连接第一重链恒定结构域的C端和第二重链可变结构域的N端，直接连接第一重链和第二重链。由于存在不同的重链和轻链同族对，此类异多聚体内的每对重链和轻链可具有不同的结合特异性，因此异多聚体可被认为是多特异性抗体。本发明的系链技术的使用也允许形成包含三条多肽链的缔合的异多聚体(例如多链抗体)，其中一条多肽链包含两个由如上所述的HD系链直接连接到一起的HC，另两条多肽链相同并形成LC，其与所述两个HC缔合，以形成两个功能性HC/LC同族对。在其他实施方式中，HD和CLH系链的使用允许用两条多肽链形成多特异性抗体，其中一条多肽链形成第一LC，另一条多肽链包含两个HC和第二LC，第二LC通过HD系链与第一HC结合，通过CLH系链与第二HC结合。在其他实施方式中，HD和CLH系链的使用允许用两条多肽链形成多特异性抗体，其中第一多肽链包括第一LC和两个HC，其中一个HC通过CLH系链与第一LC直接相互作用，并通过HD系链与第二HC直接相互作用，第二多肽形成第二LC，所述第二LC与未和第一LC连接的HC缔合。在其他实施方式中，本发明的系链技术的使用允许形成异多聚体，其中免疫粘附素与半抗体通过HD系链缔合。系链技术可单独开发或与结进孔(knob-into-hole)(”KnH”)技术结合以改造本发明的异多聚体。包含系链，有或没有KnH技术的异多聚体，以及重组异多聚体的生产在下文中详细说明。
A.异多聚体系链
本发明提供用系链构建的异多聚体。例如，异多聚体可具有连接免疫球蛋白重链恒定结构域C端和免疫球蛋白重链可变结构域N端的系链。在其他实施方式中，异多聚体还包含一个或多个(例如两个)额外的系链，以帮助重链与其同族轻链适当的缔合(即重链与和它连接的轻链缔合)。此类异多聚体可用或不用额外的异多聚化结构域构建，例如用KnH技术构建的异多聚体。
如图1中的示意图所示，示例性异多聚体是多特异性单链抗体，包含两条不同的重链(HC1和HC2)和两条不同的轻链(LC1和LC2)，其中HC1和LC1形成第一同族对，HC2和LC2形成第二同族对。在示例性异多聚体中，有3个系链。第一系链(HD系链)连接HC1和LC2，第二系链(CLH系链1)和第三系链(CLH系链2)分别连接LC1和HC1以及LC2和HC2。系链帮助将两条不同的重链和其同族的轻链结合到一起，从而产生具有多特异性的异多聚体单链抗体。
在具体实施方式中，在组装的异多聚体中(图1)，HD系链足够长以跨越HC1的C端和LC2(或者在LC2不存在的情况下，HC2)的N端之间的距离，以允许第一和第二重链之间的适当缔合，但足够短，以防止HC1和/或HC2的分子间同多聚化。HC1的C端和LC2(或者在LC2不存在的情况下，HC2)的N端之间的距离可在组装的异多聚体之间不同，因此HD系链的长度也可在异多聚体之间变化。通常，15-100个氨基酸的HD系链是有效的，同样20-40个氨基酸、25-40个氨基酸和30-40个氨基酸的HD系链是有效的。在具体实施方式中，HD系链为36-39个氨基酸长(例如36、37、38或39个氨基酸长)。
在具体实施方式中，在组装的异多聚体中(图1)，CLH系链各自足够长以跨越重链的N端与其同族轻链的C端之间的距离，以允许适当的轻链/重链缔合，但足够短以防止不希望的链间缔合(即轻链与其未直接连接的非同族重链的缔合)。重链的N端和其同族的轻链的C端之间的距离可在抗体之间，甚至在抗体本身内不同(即第一同族对的重链的N端和其同族的轻链的C端之间的距离不同于第二同族对)。因此，HD系链的长度可在本发明的异多聚体之间变化，并且在同一异多聚体内，CLH系链1的长度可不同于CLH系链2的长度。通常，10-80个氨基酸的CLH系链是有效的，同样20-40个氨基酸、25-40个氨基酸、30-40个氨基酸和35-40个氨基酸(例如30、31、32、33、34或35个氨基酸)的CLH系链是有效的。本发明的异多聚体可具有两个系链(CLH系链1和CLH系链2)，所述系链将第一轻链与第一重链相结合，将第二轻链与第二重链相结合。
HD或CLH系链可保持柔性，并且不形成二级结构，为此目的可使用含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的系链。系链可只由G和S残基组成，但只要系链保持柔性以允许上述的链间缔合，也可包含其他残基。在具体实施方式中，HD或CLH系链包含GGS重复(图2)。在一些实施方式中，HD系链包含至少1个GGS重复。本文描述的示例性HD系链含有8-9个GGS重复(SEQ ID NO:19)和在其N和C端的内肽酶切割位点(弗林蛋白酶和Lys-C切割位点)(图2)。在另一实施方式中，CLH系链包含至少1个GGS重复。本文描述的示例性CLH系链含有6个GGS重复(SEQ ID NO:20)和在其N和C端的内肽酶切割位点(弗林蛋白酶)(图2)。
B.异多聚体系链的切割
在本发明的异多聚体组装后，不再需要系链，并且在一些实施方式中，将系链从异多聚体切割。存在于系链内或紧邻系链，但不存在于非系链异多聚体组分序列中，或者在使用的条件下不能被切割的切割位点可用于移除系链。
图2说明了可存在于示例性异多聚体单链抗体中的3个系链中的示例性切割位点的位置。通常，系链内的切割位点位于或接近系链序列的C端或N端，或者在位于或接近抗体和系链结合的位点的抗体序列内。如果用Lys-C内肽酶切割一个或多个系链(例如在恒定重链的C端赖氨酸残基处)，异多聚体的序列可需要被修饰以移除Lys-C内肽酶切割位点。此类修饰的实例是铰链区的赖氨酸突变为丙氨酸(例如在本文说明的示例性异多聚体中的K222A，Kabat编号系统；K222A，EU编号系统)。当不同的切割剂被选择用于本发明时，可需要并以相似方式进行其他切割位点的修饰。
在特定位点切割氨基酸序列是本领域的标准，并可涉及酶促切割、化学切割或自处理。例如，可用内肽酶从蛋白质切割系链。示例性内肽酶包括但不限于弗林蛋白酶、尿激酶、Lys-C、Asp-N、Arg-C、Glu-C、凝血酶、组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPa)、genenase(枯草杆菌蛋白酶BPN’蛋白酶的变体)、因子Xa、TEV(烟草蚀纹病毒蛋白酶)、肠激酶、HRV C3(人鼻病毒C3蛋白酶)、激肽原酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶，上述酶均为商购(例如来自Boehringer Mannheim,Thermo Scientific或New England Biolabs)。枯草杆菌蛋白酶样前蛋白转化酶例如弗林蛋白酶(PC1)、PC2或PC3(Steiner(1991)in Peptide Biosynthesis and Processing(Fricker编辑)第1-16页,CRC Press,Boca Raton,FL；Muller等人,JBC 275:39213-39222,(2000))和N-精氨酸二碱转化酶(Chow等人,JBC 275:19545-19551(2000))在二碱位点切割。Lys-C在赖氨酸残基的羧基侧切割，V8和Glu-C在谷氨酸残基的羧基侧切割，Arg-C在精氨酸残基的羧基侧切割，Asp-N在天冬氨酸残基的氨基侧切割，糜蛋白酶在酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和亮氨酸残基的羧基侧切割，胰蛋白酶在精氨酸和赖氨酸残基的羧基侧切割。TEV在“Gln”和“Gly”残基之间切割氨基酸序列GluAsnLeuTyrPheGlnGly(SEQ ID NO:4)。此类酶的使用在本领域是标准的，实验方案可从制造商获得。图3说明了用弗林蛋白酶切割后的示例性异多聚体单链抗体。
备选地，可用化学品，例如羟胺从蛋白质切割系链。羟胺切割天冬酰胺-甘氨酸肽键。如果使用羟胺从蛋白质切割系链，蛋白质中的多个甘氨酸或天冬酰胺残基可需要被突变，以免将蛋白质切成碎片。
本领域知悉多种可切割肽键的其他化学品。例如，N-氯代琥珀酰亚胺在色氨酸残基的C端侧切割(Shechter等人,Biochemistry 15:5071-5075(1976))。N-溴代琥珀酰亚胺和溴化氰也在色氨酸残基的C端侧切割。此外，2-硝基硫氰苯甲酸或有机膦可用于在半胱氨酸的N端侧切割蛋白质(参见例如EP 0339217)。
也已知蛋白质自处理。例如，Hedgehog蛋白质由其内部的蛋白水解活性在GlyAspTrpAsnAlaArgTrpCysPhe切割位点(SEQ ID NO:5)处理。自体蛋白水解切割位点也可包含于接头或系链序列中。
在内肽酶切割后，本发明的异多聚体可在其纯化前或纯化后由一种或多种外肽酶进一步处理。图3B说明了纯化及弗林蛋白酶、Lys-C和外肽酶(例如羧肽酶B)处理后的异多聚体单链抗体。在弗林蛋白酶处理后，仍附着于异多聚体的CH31结构域的HD系链由Lys-C处理移除。附着于CL1和CL2结构域的残留弗林蛋白酶识别序列由使用外肽酶(例如羧肽酶B)的处理移除。
C.结进孔(knob-into-hole)技术
本发明的异多聚体可额外地包含使用结进孔(knob-into-hole)(KnH)技术(参见例如美国专利号5,731,168，以引文整体合并入本文)的异二聚化结构域，该技术可在两个不同的抗体重链之间改造界面，以促进其缔合。通常，该技术涉及在第一重链的界面引入“凸起”，在第二重链的界面引入相应的“空穴”，使得凸起可置于空穴中，以进一步促进重链的异二聚化。
第一个优选的界面包含至少部分第一重链恒定结构域的CH3结构域(CH31)和至少部分第二重链恒定结构域的CH3结构域(CH32)。凸起可通过将来自第一结构域(例如CH31)的界面的小氨基酸侧链替换为较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)构建。通过将大氨基酸侧链替换为较小的侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)，任选地在第二结构域(例如CH32)的界面构建与凸起相同或相似大小的补偿性空穴。第二个优选的界面包含至少部分轻链的CL结构域和重链的CH1结构域，在此处可按如上所述构建凸起-空穴相互作用。当第一或第二结构域的界面存在位置和空间适当的凸起或空穴时，只需要在相邻的界面分别加工相应的空穴或凸起。
D.具有不同结合性质的单特异性或多特异性异多聚体
应当理解，此类异多聚体的可变结构域可源自多种方法。例如，本发明的异多聚体的可变结构域可与本领域已知的已有抗体相同。
如上所述，本发明的HD系链可用于产生具有不同结合性质的异多聚体。在一些实施方式中，本发明可用于产生单链单特异性抗体，其包含对相同靶表位具有不同结合亲和力的两个半抗体。在另一实施方式中，本发明可用于产生单链多特异性抗体(结合至少两个抗原或同一抗原上至少两个不同表位的抗体)。通常在天然存在的IgG抗体中，抗体中每对重链和轻链的可变区是相同的。使用根据本发明的系链允许抗体中两条重链不同，获得拥有具有不同结合特异性(例如表位靶)的抗原结合结构域或具有相同结合特异性但具有不同结合亲和力的抗原结合结构域的抗体。在一些实施方式中，HD系链促进编码于单多肽链中的两个不同的重链的缔合，以获得只有重链的单链抗体。在其他实施方式中，CLH系链促进重链与其同族轻链的缔合。在一些实施方式中，重链之一及其同族的轻链的缔合在没有CLH系链的条件下建立，以产生本发明的异多聚体。任选地，一个或多个系链包含内肽酶切割位点(例如弗林蛋白酶和Lys-C切割位点)，所述切割位点可被切割，使得将一个或多个系链在组装后从异多聚体移除。任选地，本发明的异多聚体还包含一个或多个用KnH技术产生的凸起-空穴界面。
如图1所示，上述示例性双特异性异多聚体(在此情况下，双特异性抗体)含有HD系链和两个CLH系链，它们可在其N端和C端各包含两个弗林蛋白酶切割位点。任选地，示例性异多聚体可利用KnH技术进一步促进HC1和HC2的缔合。
预期切割系链的异多聚体不应在其序列内包含用于切割系链的内肽酶的切割位点，或者如果在异多聚体的非系链序列内有切割位点，切割位点不应在使用的条件下被切割，除非也意欲切割异多聚体。异多聚体的序列可被扫描以确定在异多聚体的重链或轻链序列中是否有应被移除以避免在移除系链时切割异多聚体本身的任何切割位点(例如弗林蛋白酶或Lys-C内肽酶切割位点)。
单链单特异性或多特异性异多聚体(例如抗体)可用本文说明的方法构建，其中异多聚体的两条不同的重链通过HD系链直接彼此连接。在一个实施方式中，单链只含重链的单特异性或多特异性异多聚体可额外地缺少CH1结构域(VH结构域直接与至少一个CH结构域连接，任选地通过铰链连接)。在另一个实施方式中，单链单特异性或多特异性异多聚体重链缺少CH1结构域，但通过CLH系链与其相应的缺少CL结构域的轻链缔合。此类异多聚体可用于将两个不同的抗原结合到一起，或缔合B细胞和T细胞。在另一个实施方式中，系链可用于缔合半抗体和免疫粘附素。
此外，本发明包含具有单特异性或多特异性的异多聚体。在一个实施方式中，通过CLH系链连接至其同族的轻链的第一重链与第二重链缔合，所述第二重链的同族的轻链与其独立于系链地缔合。
E.具有不同效应子功能的异多聚体
在一些实施方式中，用本文说明的方法构建的本发明的异多聚体(例如单链或多链抗体，或抗体-免疫粘附素复合物)可包含CH2结构域突变，允许改变的效应子功能。通常，CH2结构域突变是N297处的突变，导致异多聚体具有改变的糖基化状态。在某些实施方式中，N297突变是N297A替换。改变的效应子功能包括但不限于C1q结合和补体依赖性细胞毒性、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调和B细胞激活。
F.缀合的蛋白复合物
如下文详述，本发明的HD系链也可用于产生蛋白质复合物例如异多聚体(例如单特异性、双特异性、多特异性单链或多链抗体)，其中通过与细胞毒性剂缀合修饰恒定区。例如，HD系链允许构建异多聚体，其中重链恒定区(HC1或HC2)之一含有允许与细胞毒性剂缀合的修饰，而另一个重链恒定区不含此类修饰。在一个实例中，HC1与细胞毒性剂缀合，而HC2未缀合。图4展示了说明本发明的缀合的异多聚体的实例的示意图。示例性异多聚体单链抗体包含两条全长重链和同族的轻链，以及上述的HD和CLH系链。如图4所示，重链之一已经与细胞毒性剂(例如毒素或抗生素)缀合。类似地，在备选的异多聚体构建物中，轻链恒定区之一可与细胞毒性剂缀合，而另一个轻链恒定区未缀合(例如LC1缀合细胞毒性剂，LC2未缀合)。如图5A所示，缀合的蛋白复合物可以是本发明的多链抗体。细胞毒性剂的缀合不限于图5A所示的具体多链抗体。多链抗体，例如如图5B和5C所示的，以及免疫粘附素-抗体异多聚体也可在恒定区缀合。
在一个具体实例中，异多聚体的恒定区可被修饰以引入亲电部分，所述亲电部分可与用于将细胞毒性剂缀合到异多聚体的接头试剂上的或细胞毒性剂自身上的亲核取代基反应。糖基化的抗体的糖可被氧化，例如用高碘酸氧化剂氧化，以形成醛或酮基团，所述醛或酮基团可与接头试剂或细胞毒性剂的胺基反应。获得的亚胺希夫碱基团可形成稳定的键，或被还原，例如被硼氢化物试剂还原，以形成稳定的胺键。细胞毒性剂上的亲核基团包括但不限于能与抗体区和接头试剂上的亲电基团反应形成共价键的胺基、巯基、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳酰肼基，所述亲电基团包括：(i)活性酯例如NHS酯、HOBt酯、卤甲酸酯和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物例如卤乙酰胺；和(iii)醛基、酮基、羧基和马来酰亚胺基。
G.其他蛋白质特征
根据本发明的异多聚体可包括来自任何来源，包括人或鼠来源的序列，或其组合。蛋白质的某些部分(例如超可变区)的序列也可以是人工序列，例如通过筛选包含随机序列的文库(例如噬菌体展示文库)鉴定的序列。
在包含来自不同来源的异多聚体的情况下，异多聚体可以是“嵌合”异多聚体，其中重和/或轻链的部分与源自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应的序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或术语另一抗体类或亚类的抗体中的相应的序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要其表现所需的生物活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。此类嵌合异多聚体可包含例如鼠可变区(或其部分)和人恒定区。
嵌合单链异多聚体也可以任选地是“人源化的”单链异多聚体(例如单链抗体)，它含有最少的源自非人抗体的序列。人源化的异多聚体通常源自人抗体(受体抗体)，其中来自受体的超可变区的残基被来自非人物种(供体抗体)(例如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类)、具有所需特异性、亲和力和性能的超可变区的残基代替。在一些情况下，人免疫球蛋白框架区(FR)的残基被相应的非人残基取代。此外，人源化的异多聚体可包含不存在于受体抗体或供体抗体中的残基。进行此类修饰以进一步改善异多聚体性能。一般地,人源化的异多聚体将包含至少一个，通常两个的基本上全部的可变结构域，其中全部或基本上全部超可变环对应于非人免疫球蛋白的超可变环，而全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化的异多聚体也任选地包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多详细信息参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
更具体地，人源化的异多聚体可具有一个或多个从非人源引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。人源化基本上可按照Winter及其同事(Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；；Riechmann等人,Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science 239:1534-1536(1988))的方法，通过用啮齿类一个或多个CDR序列取代人抗体的对应序列进行。因此，此类“人源化的”异多聚体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整的人可变结构域已经被来自非人物种的相应的序列替换。实践上，人源化的异多聚体通常是人抗体，其中一些CDR残基以及可能地一些FR残基被来自啮齿类抗体中类似位点的残基取代。
在制备人源化的异多聚体中使用的人轻链和重链可变结构域的选择对降低抗原性非常重要。根据所谓的“最佳适配”(“best-fit”)方法，针对已知人可变结构域序列的文库筛选啮齿类抗体的可变结构域的序列。最接近啮齿类序列的人序列被作为人源化的异多聚体的人框架(FR)(Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993)；Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901(1987))。另一个方法使用源自特定亚组的轻链或重链的全部人抗体的共有序列的特定框架。同一框架可用于多个不同的人源化的异多聚体(Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285(1992)；Presta等人,J.Immnol.151:2623(1993))。
更重要的是，异多聚体在人源化时保留对一个或多个靶抗原的高亲和力和其他有利的生物性质。为实现此目标，根据示例性方法，通过使用亲本和人源化的序列的三维模型的亲本序列和多个概念性人源化产品分析的方法制备了人源化的异多聚体。三维免疫球蛋白模型是通常可获得的，为本领域技术人员所熟悉。可获得说明和展示所选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。对此类展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能的作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原能力的残基。这样，可以从受体和输入序列选择并组合FR残基，使得获得所需要的异多聚体特征，例如对一种或多种靶抗原的增加的亲和力。一般而言，CDR残基直接并最实质地参与影响抗原结合。
III.载体、宿主细胞和重组方法
为重组生产本发明的异多聚体，编码异多聚体的核酸被分离并插入可复制载体中，用于进一步克隆(扩增DNA)或用于表达。编码异多聚体的DNA用常规程序方便地分离和测序(例如通过使用能特异性结合编码异多聚体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。可获得许多载体。载体的选择部分取决于要使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞是原核或真核(通常是哺乳动物的，但也包括真菌(例如酵母)、昆虫、植物，以及来自其他多细胞生物的成核细胞)来源。应当理解，任何同种型的恒定区可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且此类恒定区可从任何人或动物物种获得。
A.用原核宿主细胞产生异多聚体
i.载体构建
编码本发明的异多聚体的多肽组分的多核苷酸序列可用标准重组技术获得。所需的多核苷酸序列可从生产抗体的细胞例如杂交瘤细胞分离并测序。备选地，多核苷酸可用核苷酸合成仪或PCR技术合成。一旦获得，编码多肽的序列被插入能在原核宿主内复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。许多可获得并为本领域所知悉的载体可用于本发明的目的。适当的载体的选择将主要取决于要插入载体中的核酸的大小和要用载体转化的特定宿主细胞。根据其功能(扩增或表达异源多核苷酸，或二者皆有)及其与所处的特定宿主细胞的相容性，每个载体包含多个组分。载体组分通常包括但不限于：复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入片段和转录终止序列。
一般而言，含有源自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与此类宿主共同使用。载体通常携带复制位点和标记序列，所述标记序列能在转化的细胞中提供性状选择。例如，大肠杆菌通常用源自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，并因此提供了鉴定转化的细胞的简便方法。pBR322、其衍生物或其他微生物质粒或噬菌体也可包含或被修饰以包含可被微生物用于表达内源蛋白的启动子。用于表达特定异多聚体抗体的pBR322衍生物的实例在Carter等人,美国专利号5,648,237中详述。
此外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可用做转化载体与此类宿主共同使用。例如，细菌噬菌体诸如λGEM-11TM可用于制备可用于转化易感宿主细胞例如大肠杆菌LE392的重组载体。
本发明的表达载体可包含两个或更多启动子-顺反子对，编码每个多肽组分。启动子是位于顺反子上游(5’)，调节其表达的非翻译调控序列。原核启动子通常分为两类，可诱导型和组成型。可诱导型启动子是这样的启动子，其响应培养条件的改变，例如营养物质的存在与否或温度的改变，起始其控制之下的顺反子的增加水平的转录。
众所周知被多种潜在的宿主细胞识别的大量启动子。可通过限制性酶消化从来源DNA移出DNA，并将分离的启动子序列插入本发明的载体中，将选择的启动子有效连接于编码轻链或重链的顺反子DNA。天然启动子序列和许多异源启动子均可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在一些实施方式中，使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常允许表达的靶基因的更多的转录和更高的产量。
适于原核宿主使用的启动子包括PhoA启动子、β半乳糖酶(galactamase)和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子例如tac或trc启动子。然而，其他在细菌中有功能的启动子(例如其他已知的细菌或噬菌体启动子)也适合。其核苷酸序列已被公布，从而允许本领域技术人员将其连接到编码靶轻链和重链的顺反子(Siebenlist等人,(1980)Cell 20:269)，使用接头或衔接子以提供任何需要的限制位点。
在本发明的一方面，重组载体内的每个顺反子包含指导表达的多肽跨膜易位的分泌信号序列组分。通常，信号序列可以是载体的组分，或其可以是插入载体中的靶多肽DNA的部分。为本发明的目的选择的信号序列应是被宿主细胞识别和处理(即被信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别和处理对于异源多肽天然的信号序列的原核宿主细胞，用选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定肠毒素II(STII)引导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP的原核信号序列替换该信号序列。在本发明的一个实施方式中，在表达系统的两个顺反子中使用的信号序列都是STII信号序列或其变体。
另一方面，根据本发明的异多聚体的生产可在宿主细胞的细胞质中进行，因此不需要每个顺反子中分泌信号序列的存在。在此方面，异多聚体轻链和重链在细胞质内表达、折叠和组装形成功能性异多聚体。某些宿主菌株(例如大肠杆菌trxB菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质环境，从而允许表达的蛋白质亚基的适当的折叠和组装(Proba和Pluckthun,Gene,159:203(1995))。
适于表达本发明的异多聚体的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，例如革兰氏阴性和革兰氏阳性生物。有用的细菌的实例包括埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌)、芽孢杆菌属(Bacilli)(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、肠杆菌属(Enterobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、鼠伤寒沙门杆菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)或副球菌属(Paracoccus)。在一个实施方式中，使用革兰氏阴性菌。在一个实施方式中，使用大肠杆菌作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann,Cellular and Molecular Biology,第2卷(Washington,D.C.:American Society for Microbiology,1987),第1190-1219页；ATCC保存号27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3lac Iq lacL8ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41kanR的菌株33D3(美国专利号5,639,635)。其他菌株及其衍生物，例如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)也适用。上述实例是说明性的而非限制。本领域知悉构建具有限定的基因型的上述任何细菌的衍生物的方法，并在例如Bass等人,Proteins 8:309-314(1990)中说明。通常需要考虑复制子在细菌细胞内的可复制性，选择适当的细菌。例如，当使用著名的质粒例如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410提供复制子时，可适当地使用大肠杆菌、沙雷氏菌属或沙门杆菌属物种作为宿主。通常宿主细胞应分泌最小量的蛋白水解酶，并且理想地在细胞培养物中掺入额外的蛋白酶抑制剂。
ii.异多聚体生产
用上述表达载体转化宿主细胞，并在修改为适于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养所述宿主细胞。
转化指将DNA引入原核宿主，使得DNA可作为染色体外元件或作为染色体整合体而复制。根据使用的宿主细胞，用适于此类细胞的标准技术进行转化。使用氯化钙的钙处理通常用于含有实质性细胞壁屏障的细菌细胞。另一个转化方法使用聚乙二醇/DMSO。另一个使用的技术是电穿孔。
在本领域知悉并且适于培养所选的宿主细胞的培养基中培养用于生产本发明的异多聚体的原核细胞。适当的培养基的实例包括Luria broth(LB)加必要的营养补充剂。在一些实施方式中，培养基也包含基于表达载体的构建选择的选择剂，以选择性地允许含有表达载体的原核细胞生长。例如，向培养基加入氨苄青霉素以培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞。
也可以适当的浓度包含除了碳源、氮源和无机磷酸盐源的任何必要的补充剂，单独引入或作为与另一补充剂或培养基的混合物(例如复合氮源)引入。任选地，培养基可包含一种或多种选自谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、硫代乙醇酸盐、二硫赤藓醇和二硫苏糖醇的还原剂。
在适当的温度培养原核宿主细胞。例如对于大肠杆菌的培养，优选的温度范围从约20℃至约39℃，更优选地从约25℃至约37℃，甚至更优选地在约30℃。培养基的pH范围可以是从约5至约9的任何pH，主要取决于宿主生物。对于大肠杆菌，pH优选地是从约6.8至约7.4，更优选地约7.0。
如果本发明的表达载体中使用可诱导启动子，蛋白质表达在适于激活该启动子的条件下诱导。在本发明的一个方面，PhoA启动子用于控制多肽的转录。因此，在磷酸盐限制性培养基中培养经转化的宿主细胞用于诱导。优选地，磷酸盐限制性培养基是C.R.A.P培养基(参见例如Simmons等人,J.Immunol.Methods(2002),263:133-147)。如本领域所知，根据使用的载体构建物，可使用多种其他诱导物。
在一个实施方式中，表达的本发明的异多聚体被分泌到宿主细胞的周质并被回收。蛋白质回收通常涉及破坏微生物，通常用诸如渗透休克、超声或裂解的方法。细胞被破坏后，细胞碎片或全细胞可通过离心或过滤移除。异多聚体可进一步纯化，例如用亲和树脂色谱。备选地，蛋白质可转运到培养基中并从中分离。可从培养物移除细胞，并将培养物上清过滤和离心，以进一步纯化生产的蛋白质。表达的多肽可用众所周知的方法例如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹测定进一步分离和鉴定。
在本发明的一个方面，异多聚体生产用发酵工艺大量进行。可用多种大规模补料分批发酵程序生产重组蛋白质。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选地约1000至100000升的容量。这些发酵罐使用搅拌桨分配氧气和营养物质，特别是葡萄糖(优选的碳源/能源)。小规模发酵通常指在不超过约100升容量，并且范围可在从约1升至约100升的发酵罐中的发酵。
在发酵工艺中，蛋白质表达的诱导通常在细胞在适当的条件下生长到所需密度，例如约180-220的OD550后起始，在此阶段细胞处于早稳定期。如本领域所知和上文所述，根据使用的载体构建物，可使用多种其他诱导物。可在诱导前培养细胞较短的时间。尽管可使用更长或更短的诱导时间，细胞通常诱导约12-50小时。
为提高本发明的异多聚体的产量和质量，可修改多种发酵条件。例如，为改善分泌的异多聚体的适当组装和折叠，可用过表达分子伴侣蛋白，例如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有分子伴侣活性的肽基脯氨酰顺，反异构酶)的额外的载体共转化宿主原核细胞。分子伴侣蛋白已经被证明促进在细菌宿主细胞中生产的异源蛋白的恰当折叠和可溶性(Chen等人,(1999)J.Biol.Chem.274:19601-19605；Georgiou等人,美国专利号6,083,715；Georgiou等人,美国专利号6,027,888；Bothmann和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275:17100-17105；Ramm和Pluckthun,(2000)J.Biol.Chem.275:17106-17113；Arie等人,(2001)Mol.Microbiol.39:199-210)。
为将表达的异源蛋白质(特别是蛋白质水解敏感的那些)的蛋白水解减到最小，某些蛋白水解酶缺陷的宿主菌株可用于本发明。例如，宿主细胞菌株可被修饰为在编码已知的细菌蛋白酶例如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合的基因中产生(一个或多个)遗传突变。一些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株可用，并在例如Joly等人,(1998),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:2773-2777；Georgiou等人,美国专利号5,264,365；Georgiou等人,美国专利号5,508,192；Hara等人,Microbial Drug Resistance,2:63-72(1996)中说明。
在一个实施方式中，蛋白水解酶缺陷，并用过表达一个或多个分子伴侣蛋白的大肠杆菌菌株被用作本发明的表达系统的宿主细胞。
在另一个实施方式中，大肠杆菌细胞额外地表达内肽酶(例如弗林蛋白酶)，以在纯化前切割目标异多聚体的一个或多个系链。在另一个实施方式中，真核宿主细胞可表达内肽酶(例如弗林蛋白酶)和外肽酶(例如羧肽酶B)，其中在纯化前，内肽酶切割异多聚体的一个或多个系链，外肽酶降解残留的内肽酶切割位点。
iii.异多聚体纯化
可使用本领域知悉的标准蛋白质纯化方法。以下程序是适当的纯化程序的示例：在免疫亲和或离子交换柱上分级、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅或阳离子交换树脂例如DEAE上色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE、疏水相互作用柱(HIC)、硫酸铵沉淀、和使用例如SephadexG-75凝胶层析。
在一方面，固定于固相的蛋白A被用于本发明的全长异多聚体产品的免疫亲和纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的41kD的细胞壁蛋白，以高亲和力结合抗体的Fc区。Lindmark等人,(1983)J.Immunol.Meth.62:1-13。固定蛋白A的固相优选地是包含玻璃或二氧化硅表面的柱，更优选地受控的有空玻璃柱或硅酸柱。在一些应用中，已经用试剂例如甘油包被柱，以防止污染物的非特异性附着。
作为纯化的第一步，源自如上所述的细胞培养物的制备物被应用到蛋白A固定化的固相以允许目标异多聚体与蛋白A的特异性结合。然后洗固相，以移除非特异性地结合于固相的污染物。可通过洗脱到含有离液剂或温和去垢剂的溶液中，从固相回收目标异多聚体。示例性离液剂包括但不限于尿素、胍-HCl、高氯酸锂、组氨酸和精氨酸。示例性温和去垢剂包括但不限于Tween(例如Tween-20)、Triton(例如Triton X-100)、NP-40(壬基苯氧基聚乙氧基乙醇)、Nonidet P-40(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)和十二烷基磺酸钠(SDS)。在从柱(例如mAbSure柱)上洗脱后将异多聚体稀释到含离液剂或温和去垢剂的溶液中维持了洗脱后异多聚体的稳定性。在一些实施方式中，经内肽酶处理的本发明的异多聚体的一个或多个残留内肽酶切割位点可在纯化后通过加入外肽酶(例如羧肽酶B)处理和降解。在其他实施方式中，本发明的异多聚体的一个或多个系链可在纯化后而非纯化前用内肽酶(例如弗林蛋白酶)和外肽酶(例如羧肽酶B)切割和处理。
B.用真核宿主细胞产生异多聚体
载体组分通常包括但不限于以下一个或多个：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
i.信号序列组分
用于真核宿主细胞的载体可在目标成熟蛋白质或多肽的N端包含信号序列或其他具有特异切割位点的多肽。选择的异源信号序列应是被宿主细胞识别和处理(即被信号肽酶切割)的。在哺乳动物细胞表达中，可获得哺乳动物信号序列和病毒分泌引导序列，例如单纯疱疹gD信号。此类前体区的DNA与编码抗体的DNA符合读框连接。
ii.复制起点
通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分。例如，通常可用SV40起点，但只是因为它包含早期启动子。
iii.选择基因组分
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为可选择标记。典型的选择基因编码这样的蛋白质，所述蛋白质(a)赋予对抗生素或其他毒素，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的抗性，(b)补偿相关的营养缺陷型的缺陷，或(c)提供复合培养基没有的关键营养物质。
选择方案的一个实例利用药物停滞宿主细胞的生长。成功用异源基因转化的细胞产生赋予药物抗性的蛋白质，从而在选择方法中存活。此类显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
用于哺乳动物细胞的适当的可选择标记的另一个实例是使得能够鉴定能吸收异多聚体核酸的细胞的可选择标记，例如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和金属硫蛋白-II，优选地金属硫蛋白基因、腺苷酸脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，用DHFR选择基因转化的细胞通过将全部转化体在含有DHFR的竞争性拮抗剂甲氨蝶呤(Mtx)的培养基中培养而首先鉴定。使用野生型DHFR时的适当的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCC CRL-9096)。
备选地，可通过在含有用于可选择标记的选择剂(例如氨基糖苷抗生素，例如卡那霉素、新霉素或G418)的培养基中培养细胞，选择用编码异多聚体、野生型DHFR蛋白和另一可选择标记(例如氨基糖苷3‘-磷酸转移酶(APH))的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是含有内源性DHFR的野生型宿主细胞)。参见例如美国专利号4,965,199。
iv.启动子组分
表达和克隆载体通常包含被宿主生物识别，并有效连接于编码异多聚体的一条或多条核酸序列的启动子。已知真核生物的启动子。几乎所有的真核基因具有位于转录起始位点上游约25至30碱基的富含AT区。另一位于许多基因的转录起始上游70至80碱基的序列是CNCAAT区(SEQ ID NO:12)，其中N可以是任何核苷酸。在大部分真核基因的3’端是AATAAA序列(SEQ ID NO:13)，它可以是在编码序列的3’端添加聚A尾的信号。上述序列均适当地插入真核表达载体中。
在哺乳动物宿主细胞内来自编码异多聚体的载体的转录受到启动子控制，所述启动子例如从病毒诸如，例如，多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和猿猴病毒40(SV40)的基因组获得，从异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子获得，或从热休克启动子获得，只要此类启动子与宿主细胞系统相容。
SV40病毒的早期和晚期启动子作为SV40限制片段方便地获得，该限制片段也包含SV40病毒复制起点。人巨细胞病毒的即刻早期启动子作为HindIII E限制片段方便地获得。美国专利号4,419,446公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物细胞中表达DNA的系统。在美国专利号4,601,978中说明了对此系统的修改。备选地，劳氏肉瘤病毒长末端重复可用作启动子。
v.增强子元件组分
高等真核生物对编码一个或多个异多聚体多肽的DNA的转录可通过在载体中插入增强子序列而增强。目前已知许多来自哺乳动物基因(例如球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素基因)的增强子序列。也可使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括位于复制起点晚期侧(bp100-270)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子，和腺病毒增强子。也参见Yaniv,Nature 297:17-18(1982)对增强真核启动子的激活的元件的说明。增强子可剪接至载体中异多聚体多肽编码序列的5'或3’位置，只要实现增强，但通常位于启动子的5’位点。
vi.转录终止组分
用于真核宿主细胞中的表达载体通常也包含转录终止和稳定mRNA所需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5’,以及偶尔3’非翻译区获得。这些区含有转录为编码异多聚体的mRNA的非翻译部分中的多腺苷化的片段的核苷酸区段。一个有用的转录终止组分是牛生长激素多腺苷化区。参见WO 94/11026和其中公开的表达载体。
vii.宿主细胞的选择和转化
适于克隆或表达本文的载体中的DNA的宿主细胞包括本文说明的高等真核生物细胞，包括脊椎动物宿主细胞。在培养物(组织培养)中增殖脊椎动物细胞已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞的实例有用SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚胎肾细胞系(293或亚克隆用于在悬浮培养物中培养的293细胞，Graham等人,J.Gen.Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠塞尔托利氏细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。
用上述用于异多聚体生产的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在修改为适于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养所述宿主细胞。
viii.培养宿主细胞
用于生产本发明的异多聚体的宿主细胞可在多种培养基中培养。商购培养基例如Ham’s F10(Sigma)、Minimal Essential Medium((MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium((DMEM),Sigma)适于培养宿主细胞。此外，在Ham等人,Meth.Enz.58:44(1979)、Barnes等人,Anal.Biochem.102:255(1980)、美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195或美国专利Re.30,985中说明的任何培养基可用作宿主细胞的培养基。上述任何培养基可根据需要补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、铁传递蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸腺苷)、抗生素(例如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(限定为通常以微摩范围的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或同等能源。也可以本领域技术人员所知的适当浓度包含任何其他必要的补充物。培养条件，例如温度、pH等是之前选择用于表达的宿主细胞使用的，并对本领域技术人员是显而易见的。
ix.异多聚体的纯化
在使用重组技术时，异多聚体可在细胞内生产，或直接分泌到培养基中。如果异多聚体在细胞内生产，作为第一步，用例如离心或超滤移除颗粒状细胞碎片，宿主细胞或裂解的片段。当异多聚体被分泌到培养基中时，通常首先用商购蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自此类表达系统的上清。在任何上述步骤中可包括蛋白酶抑制剂例如PMSF以抑制蛋白质水解，并且可包括抗生素以防止偶然的污染物的生长。
从细胞制备的异多聚体组合物可用例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱纯化，其中亲和色谱是优选的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适当性取决于存在于异多聚体中的免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的异多聚体(Lindmark等人,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。对于全部小鼠同种型和人γ3，推荐蛋白G(Guss等人,EMBO J.5:15671575(1986))。亲和配体附着的基质最常用的是琼脂糖，但也可用其他基质。机械稳定的基质例如受控有孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许比用琼脂糖所能达到的更快的流速和更短的处理时间。当异多聚体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)可用于纯化。取决于要回收的抗体，也可用其他蛋白质纯化技术，例如在离子交换柱上分级、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上色谱、肝素SEPHAROSETM上色谱、阴离子或阳离子交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)上色谱、色谱聚焦、SDS-PAG和硫酸铵沉淀。
在一个实施方式中，真核细胞额外地表达内肽酶(例如弗林蛋白酶)，以在纯化前(例如在反面高尔基体转运期间)切割目标异多聚体的一个或多个系链。在另一个实施方式中，真核宿主细胞可表达内肽酶(例如弗林蛋白酶或Lys-C)和外肽酶(例如羧肽酶B)，其中在纯化前，内肽酶切割异多聚体的一个或多个系链，外肽酶降解残留的内肽酶切割位点。
可通过洗脱到含有离液剂或温和去垢剂的溶液中，从柱的固相回收目标异多聚体。“离液剂”指通过干扰稳定性分子内相互作用(例如氢键、范德华力或疏水效应)破坏蛋白质(例如抗体)的三维结构的水溶性物质。示例性离液剂包括但不限于尿素、胍-HCl、高氯酸锂、组氨酸和精氨酸。“温和去垢剂”指通过干扰稳定性分子内相互作用(例如氢键、范德华力或疏水效应)破坏蛋白质(例如抗体)的三维结构，但不永久破坏蛋白质结构从而导致生物活性丧失(即不变性蛋白质)的水溶性物质。示例性温和去垢剂包括但不限于Tween(例如Tween-20)、Triton(例如Triton X-100)、NP-40(壬基苯氧基聚乙氧基乙醇)、Nonidet P-40(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)和十二烷基磺酸钠(SDS)。
在任何一个或多个初步分离步骤后，可对包含目标异多聚体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用色谱，使用pH在约2.5至4.5的洗脱缓冲液，优选地在低盐浓度(例如从约0-0.25M盐)下进行。
在一些实施方式中，经内肽酶处理的本发明的异多聚体的一个或多个残留内肽酶切割位点可在纯化后被外肽酶(例如羧肽酶B)处理和降解。在其他实施方式中，本发明的异多聚体的一个或多个系链可在纯化后而非纯化前用内肽酶(例如弗林蛋白酶)和外肽酶(例如羧肽酶B)切割和处理。
x.使用杆状病毒生产异多聚体
可通过利用例如脂质体(可从GIBCO-BRL商购)，共转染编码异多聚体或异多聚体片段的质粒和BaculoGoldTM病毒DNA(Pharmingen)到昆虫细胞例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞(例如Sf9细胞；ATCC CRL 1711)或黑腹果蝇S2细胞中，产生重组杆状病毒。在具体实例中，异多聚体序列被融合到杆状病毒表达载体内含有的表位标签上游。此类表位标签包含多聚His标签。可使用多种质粒，包括源自商购质粒诸如pVL1393(Novagen)或pAcGP67B(Pharmingen)的质粒。简而言之，编码抗体异多聚体或其片段的序列可通过使用与5’和3’区互补的引物的PCR扩增。5’引物可掺入侧翼(选择的)限制酶位点。然后产物可用选择的限制酶消化并亚克隆到表达载体中。
在用表达载体转染后，将宿主细胞(例如Sf9细胞)在28℃孵育4-5天，然后收集释放的病毒，用于进一步扩增。病毒感染和蛋白质表达可按例如由O’Reilley等人(Baculovirus expression vectors:A Laboratory Manual.Oxford:Oxford University Press(1994))说明的进行。
表达的多聚His标记的异多聚体可随后用例如如下的Ni2+螯合亲和色谱纯化。可按Rupert等人(Nature 362:175-179(1993))说明，从重组病毒感染的Sf9细胞制备提取物。简而言之，洗涤Sf9细胞，重悬于超声破碎缓冲液(25mL HEPES pH 7.9；12.5mM MgCl2；0.1mM EDTA；10％甘油；0.1％NP-40；0.4M KCl)，并在冰上超声破碎2次，每次20秒。用离心澄清超声破碎产物，并将上清在上样缓冲液(50mM磷酸盐；300mM NaCl；10％甘油pH7.8)中50倍稀释，并通过0.45μm滤器。制备柱床体积为5mL的Ni2+-NTA琼脂糖柱(可自Qiagen商购)，用25mL水洗，并用25mL上样缓冲液平衡。将经过滤的细胞提取物以0.5mL/min装载至柱中。用上样缓冲液洗柱至基线A280，在此点开始级分收集。然后用第二洗脱缓冲液(50mM磷酸盐；300mM NaCl；10％甘油pH6.0)洗柱，洗脱非特异性结合的蛋白质。在再次达到A280基线后，用第二洗脱缓冲液中的0至500mM咪唑梯度展开柱。收集1mL级分，并用SDS-PAGE和银染或用Ni2+-NTA缀合的碱性磷酸酶(Qiagen)进行Western印迹分析。汇集含有洗脱的经His10标记(SEQ ID NO:2)的异多聚体的级分，并用上样缓冲液透析。
异多聚体的纯化也可用已知的色谱技术，例如蛋白A或蛋白G柱色谱进行。可通过洗脱到含有离液剂或温和去垢剂的溶液中，从柱的固相回收目标异多聚体。示例性离液剂和温和去垢剂包括但不限于胍-HCl、尿素、高氯酸锂、精氨酸、组氨酸、SDS(十二烷基磺酸钠)、Tween,Triton和NP-40，以上均为商购。如上所述，异多聚体的一个或多个系链可在纯化后通过加入内肽酶(例如弗林蛋白酶或Lys-C)和外肽酶(例如羧肽酶B)切割和处理。
C.纯化技术
可用于含HD系链的异多聚体的一个具体纯化方法如下所示。在4℃将连接的异多聚体装载到蛋白A(例如mAbSure)柱上
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用KPO4，然后用PBS+0.1％Trition X114洗柱
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将样品洗脱到Tris pH8.0(200mM)中
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将样品pH调整至8.0，并在37℃用Lys-C切割1.5小时
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用MabSURE柱重新纯化样品
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将样品pH调整至8.0，并在37℃用羧肽酶B切割4小时
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调整样品电导率，并装载到离子交换柱上
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收集级分，汇集并透析到PBS中
除了精氨酸，其他可用于初始蛋白A柱步骤之后的上述纯化实验方案的离液剂或温和去垢剂包括但不限于胍-HCl、尿素、高氯酸锂、组氨酸、SDS(十二烷基磺酸钠)、Tween、Triton和NP-40，以上均可商购。在一些实施方式中，经内肽酶处理的本发明的异多聚体的一个或多个残留内肽酶切割位点可在纯化后被外肽酶(例如羧肽酶B)处理和降解。在其他实施方式中，本发明的异多聚体的一个或多个系链可在纯化后而非纯化前用内肽酶(例如弗林蛋白酶或Lys-C)和外肽酶(例如羧肽酶B)切割和处理。
IV.缀合的蛋白质
本发明也提供缀合的蛋白质，例如缀合的异多聚体或免疫缀合物(例如“抗体-药物缀合物”或“ADC”)，包含本文说明的任何异多聚体(例如含HD系链的单链单特异性或多特异性抗体、含HD系链的多链单特异性或多特异性异多聚体)，其中轻链或重链的恒定区之一与化学分子例如染料或细胞毒性剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即放射缀合物)缀合。具体地，如本文所述，HD系链的使用使得能够构建含有两条不同的重链(HC1和HC2)以及两条不同的轻链(LC1和LC2)的异多聚体。用本文说明的方法构建的免疫缀合物可包含只与重链之一(HC1或HC2)或只与轻链之一(LC1或LC2)的恒定区缀合的细胞毒性剂。同样，由于免疫缀合物可具有只附着于一条重链或轻链的细胞毒性剂，向对象施用的细胞毒性剂的量相对于具有附着于两条重链或轻链的细胞毒性剂的异多聚体的施用减少了。减少向对象施用的细胞毒性剂的量限制了与细胞毒性剂相关的不良副作用。
使用抗体-药物缀合物用于在癌症的治疗中局部递送细胞毒性或细胞抑制剂，即杀死或抑制肿瘤细胞的药物(Syrigos和Epenetos,Anticancer Research 19:605-614(1999)；Niculescu-Duvaz和Springer,Adv.Drg.Del.Rev.26:151-172(1997)；美国专利号4,975,278)允许药物部分靶向运送到肿瘤以及在其中的细胞内积累，而这些非缀合药剂的全身给药可导致对正常细胞和试图除去的肿瘤细胞的不可接受的水平的毒性(Baldwin等人,Lancet(Mar.15,1986):603-605(1986)；Thorpe,(1985)“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review,”in Monoclonal Antibodies‘84:Biological And Clinical Applications,A.Pinchera等人.(编),第475-506页)。从而寻求具有最小毒性的最大效力。多克隆和单克隆抗体都已经被报道用于此类策略(Rowland等人,Cancer Immunol.Immunother.21:183-187(1986))。用于此类方法的药物包括柔红霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛(vindesine)(Rowland等人，(1986)同上)。用于异多聚体-毒素缀合物中的毒素包括细菌毒素例如白喉毒素、植物毒素例如蓖麻毒素、小分子毒素例如格尔德霉素(Mandler等人,Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581(2000)；Mandler等人,Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028(2000)；Mandler等人,Bioconjugate Chem.13:786-791(2002))、美登木素生物碱类(maytansinoids)(EP 1391213；Liu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996))和卡里奇霉素(Lode等人,Cancer Res.58:2928(1998)；Hinman等人,Cancer Res.53:3336-3342(1993))。毒素可通过包括结合微管蛋白、结合DNA或抑制拓扑异构酶的机制达到其细胞毒性和细胞抑制效果。当与大异多聚体抗体或蛋白质受体配体缀合时，一些细胞毒性药物倾向于无活性或活性较低。
用于产生免疫缀合物的化疗剂在本文中说明(例如上文)。可用的酶促活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素(exotoxin)A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、石碱草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogillin)、局限曲霉素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯类(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。多种放射性核素可用于生产放射性缀合抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。抗体和细胞毒性剂的缀合物是用多种双功能蛋白质偶联剂制备的，例如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二巯基)-丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯类的双功能衍生物(例如己二亚胺酸二甲酯HCl(dimethyl adipimidate HCl))、活性酯(例如双琥珀酰亚胺辛二酸酯(disuccinimidyl suberate))、醛类(例如戊二醛(glutaraldehyde))、双叠氮化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺(bis(p-azidobenzoyl)hexanediamine))、双重氮衍生物(例如双-(对二重氮基苯甲酰基)-乙二胺(bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylenediamine))、二异氰酸酯类(例如甲苯2,6-二异氰酸酯(toluene2,6-diisocyanate))和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯(1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene))。例如，蓖麻毒素免疫毒素可按Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中说明制备。碳-14标记的1-异硫氰基苯甲基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核素缀合到抗体的示例性螯合剂。参见例如WO94/11026。
本文也考虑异多聚体和一个或多个小分子毒素(例如卡里奇霉素、美登木素生物碱类、多拉司他汀类(dolastatins)、aurostatin、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065，及这些毒素的具有毒素活性的衍生物)的缀合物。
A.美登素和美登木素生物碱类
在一些实施方式中，免疫缀合物包含与一种或多种美登木素生物碱类分子缀合的本发明的异多聚体。
美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美国专利号3,896,111)。随后发现某些微生物也产生美登木素生物碱类，如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利号4,151,042)。例如下列美国专利号公开了合成的美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663和4,371,533。
在异多聚体抗体药物缀合物中，美登木素生物碱药物部分是引人注目的药物部分，这是因为他们：(i)通过发酵或化学修饰、衍生化发酵产物相对容易制备，(ii)能用适于通过非二硫键接头与抗体缀合的功能团衍生，(iii)在血浆中稳定，和(iv)针对多种肿瘤细胞系有效。
含美登木素生物喊类的免疫缀合物、制备它们的方法以及它们的治疗应用已被公开于诸如美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235 B1，其公开内容明确合并入本文作为参考。Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996)说明了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱的免疫缀合物。发现该缀合物对培养的结肠癌细胞是高度细胞毒性的，而且在体内肿瘤生长测定中显示抗肿瘤活性。Chari等人，Cancer Research 52:127-131(1992)说明了这样的免疫缀合物，其中美登木素生物碱经二硫键接头与结合人结肠癌细胞系上的抗原的鼠抗体A7缀合，或与结合HER-2/neu原癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1缀合。在体外在人乳腺癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.l-美登木素生物碱缀合物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3xl05个HER-2表面抗原。药物缀合物达到了与游离美登木素生物碱药物相似程度的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱缀合物在小鼠中显示低全身性细胞毒性。
可通过将异多聚体与美登木素生物碱分子化学连接，制备美登木素生物碱缀合物，而不显著降低异多聚体或美登木素生物碱分子的生物活性。参加例如美国专利号5,208,020(其公开内容明确合并入本文作为参考)。每个异多聚体抗体分子缀合平均3-4个美登木素生物碱分子，显示出增强靶细胞的细胞毒性的效力，而对抗体的功能或溶解性没有负面影响，尽管预计甚至一分子的毒素/抗体也将比使用裸抗体增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。合适的美登木素生物碱类在例如美国专利号5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开。优选的美登木素生物碱类是美登醇和在美登醇分子的芳香环或其它位置中修饰的美登醇类似物，如多种美登醇酯。
有许多本领域已知的用于制备美登木素生物碱缀合物的连接基团，包括例如美国专利号5,208,020或欧洲专利0 425 235 Bl、Chari等人，Cancer Research 52:127-131(1992)、和美国专利申请公开号2005/0169933中所公开的那些，其公开内容明确合并入本文作为参考。包含接头成分SMCC的美登木素生物碱缀合物可如美国专利申请公开号2005/0169933中所公开的制备。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，如上文所述专利中所公开的，优选二硫化物基团和硫醚基团。本文还说明并列举了其它连接基团。
可用多种双功能蛋白质偶联剂制备异多聚体和美登木素生物碱的缀合物，例如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二巯基)-丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯类的双功能衍生物(例如己二亚胺酸二甲酯HCl)、活性酯(例如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛类(例如戊二醛)、双叠氮化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双-(对二重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯类(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二巯基)-丙酸酯(SPDP)(Carlsson等人，Biochem.J.173:723-737(1978))和N-琥珀酰亚胺-4-(2-吡啶巯基)戊酸酯(SPP),用于提供二硫键连接。
根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置上。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、用羟甲基修饰的C-14位置、用羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置。在优选的实施方式中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成键。
B.Auristatin和多罗司他汀
在一些实施方式中，免疫缀合物包含与多拉司他汀或多罗司他汀肽类似物和衍生物，auristatin(美国专利号5,635,483；和5,780,588)缀合的本发明的异多聚体。多拉司他汀和auristatin已经显示出能干扰微管动力学、GTP水解、以及核和细胞分裂(Woyke等人(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584),并具有抗癌(美国专利号5,663,149)和抗真菌活性(Pettit等人,Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965(1998))。多拉司他汀或auristatin药物部分可通过肽药物部分的N(氨基)端或C(羧基)端附着于异多聚体(WO 02/088172)。
示例性auristatin实施方式包括N端连接的monomethylauristatin药物部分DE和DF,其公开于"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、美国申请公开号2005/0238649,其公开内容明确整体合并入本文作为参考。
通常，基于肽的药物部分可通过在两个或多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可根据例如肽化学领域熟知的液相合成方法来制备(参见E.和K.Lübke,"The Peptides",卷l,第76-136页,1965,Academic Press)。可根据以下的方法制备auristatin/多拉司他汀药物部分：美国专利号5,635,483和5,780,588；Pettit等人,J.Nat.Prod.44:482-485(1981)；Pettit等人,Anti-Cancer Drug Design 13:47-66(1998)；Poncet,Curr.Pharm.Des.5:139-162(1999)和Pettit,Fortschr.Chem.Org.Naturst.70:1-79(1997)。也可参见Doronina(2003)Nat Biotechnol 21(7):778-784；和"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"，美国申请公开号2005/0238649，以引文整体合并入本文(公开了，例如，接头和制备与接头缀合的单甲基缬氨酸化合物(诸如MMAE和MMAF)的方法)。
C.卡里奇霉素
在其他实施方式中，免疫缀合物包含与一个或多个卡里奇霉素分子缀合的本发明的异多聚体。卡里奇霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。对于卡里奇霉素家族缀合物的制备，参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296(全部属于American Cyanamid公司)。可用的卡里奇霉素结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和θI1(Hinman等人，Cancer Research 53:3336-3342(1993)、Lode等人，Cancer Research 58:2925-2928(1998)以及上述American Cyanamid的美国专利)。抗体可缀合的另一抗肿瘤药物是QFA，它是抗叶酸药物。卡里奇霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，此类活性剂通过抗体介导的内化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒性效果。
D.其他细胞毒性剂
可与本发明的或根据本文说明的方法制备的异多聚体缀合的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱、5-氟尿嘧啶、美国专利号5,053,394和5,770,710中描述的统称为LL-E33288复合物的活性剂家族以及埃斯波霉素(esperamicins)(美国专利号5,877,296)。
可用的酶活促性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒素、巴豆毒素、石碱草抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯类。
本发明还考虑了异多聚体和具有核分解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫缀合物。
为了选择性破坏肿瘤，异多聚体可包含高度放射活性原子。多种放射性同位素可用于生产放射性缀合的异多聚体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在将缀合物用于检测时，其可包含放射活性原子用于闪烁照相研究，例如Tc99m或I123，或是包含自旋标记物(spin label)用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri),如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
放射性或其他标记物可用已知方法掺入到缀合物中。例如，肽可生物合成，或通过化学氨基酸合成法使用合适的氨基酸前体，涉及例如代替氢的氟-19合成。标记物例如tc99m或I123、Re186、Re188和In111可通过肽中的半胱氨酸残基附着。钇-90可通过赖氨酸残基附着。IODOGEN方法(Fraker等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57(1978))可用于掺入碘-123。“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”(Chatal,CRC Press 1989)详细说明了其他方法。
可用多种双功能蛋白质偶联剂制备异多聚体和细胞毒性剂的缀合物，例如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二巯基)-丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯类的双功能衍生物(例如己二亚胺酸二甲酯HCl)、活性酯(例如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛类(例如戊二醛)、双叠氮化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双-(对二重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯类(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可按Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中说明制备蓖麻毒素免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰基苯甲基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核素缀合到异多聚体的示例性螯合剂。参见例如WO94/11026。接头可以是协助在细胞中释放细胞毒性药物的"可切割接头"。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫键的接头(Chari等人，Cancer Research 52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本发明的化合物明确考虑但不限于用下列交联剂制备的ADC:商购的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)(例如可购自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。见2003-2004应用手册和目录第467-498页。
E.制备缀合的异多聚体
在本发明的缀合异多聚体中，异多聚体与一个或多个部分(例如药物部分)缀合，例如每个抗体约1至约20个部分，任选地通过接头缀合。可用本领域技术人员知悉的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径制备缀合的异多聚体，包括：(1)抗体异多聚体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，随后与目标部分反应；和(2)部分的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，随后与抗体异多聚体的亲核基团反应。本文说明了制备缀合的异多聚体的其他方法。
接头试剂可由一个或多个接头组分组成。示例性的接头组分包括6-马来酰亚氨基乙酰基(“MC”)、马来酰亚氨基丙酰基(maleimidopropanoyl)(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、p-氨基苄氧基羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基巯基)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(“SMCC”)和N-琥珀酰亚氨基(4-碘代-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。本领域知悉其他接头组分，一些在本文中说明。也可参见“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands,”美国专利申请公布号2005/0238649，其内容以引文整体合并入本文。
在一些实施方式中，接头可包含氨基酸残基。示例性的氨基酸接头组分包括二肽、三肽、四肽或五肽。示例性二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。示例性三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。包含氨基酸接头组分的氨基酸残基包括天然存在的，以及少数氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，如瓜氨酸。可设计并优化氨基酸接头组分对于特定酶的酶促裂解的选择性，例如与肿瘤相关的蛋白酶、组蛋白酶-B、C和D、或血纤维蛋白溶酶蛋白酶。
本发明的异多聚体的亲核基团包括但不限于：(i)N端氨基；(ii)侧链氨基，如赖氨酸；(iii)侧链巯基，如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。氨基、巯基、和羟基是亲核的，并且能够与接头部分和接头试剂上的亲电基团反应而形成共价键，所述亲电基团包括：(i)活性酯例如NHS酯、HOBt酯、卤甲酸酯和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物例如卤乙酰胺；(iii)醛基、酮基、羧基和马来酰亚胺基。某些异多聚体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可通过用还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)处理使本发明的异多聚体具有与接头试剂缀合的反应性。因此每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可通过经由赖氨酸与2-亚氨基硫杂环戊烷(Traut氏试剂)的反应，导致胺转变为硫醇，将额外的亲核基团引入抗体。可通过引入一、二、三、四、或更多个半胱氨酸残基(例如，制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变体抗体)，将反应性硫醇基团引入到异多聚体(或其片段)中。
还可通过修饰异多聚体以引入可与接头试剂或药物或其他部分上的亲核取代基反应的亲电子部分，来产生本发明的缀合的异多聚体。糖基化的本发明的异多聚体的糖可被氧化，例如用高碘酸氧化剂氧化，以形成醛或酮基团，所述基团可与接头试剂或药物或其他部分的胺基反应。获得的亚胺希夫碱基团可形成稳定的键，或可被还原，例如被硼氢化物试剂还原，以形成稳定的胺键。在一个实施方式中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中生成羰基(醛和酮)基团，所述羰基基团可与药物或其他部分上的适宜基团反应(Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一个实施方式中，包含N端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸位置处生成醛(Geoghegan和Stroh,Bioconjugate Chem.3:138-146(1992)；美国专利号5,362,852)。此类醛可与药物部分或接头亲核体反应。
类似地，部分(例如药物部分)上的亲和基团包括但不限于能与接头部分和接头试剂上的亲电基团反应形成共价键的胺基、巯基、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳酰肼基，所述亲电基团包括：(i)活性酯例如NHS酯、HOBt酯、卤甲酸酯和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物例如卤乙酰胺；和(iii)醛基、酮基、羧基和马来酰亚胺基。
备选地，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含异多聚体和细胞毒性剂的融合蛋白。DNA的长度可包含编码缀合物的两个部分的各自的区域，所述区域彼此毗邻或是由不破坏缀合物的所需特性的编码接头肽的区域分隔。在另一个具体实施方案中，可将异多聚体与"受体"(诸如链霉亲和素)缀合，用于肿瘤的预先靶向应用中，其中对个体施用异多聚体-受体缀合物，接着使用清除剂从循环中去除未结合的缀合物，然后施用与细胞毒性剂(如放射性核素)缀合的“配体”(例如，抗生物素蛋白)。
V.治疗用途
本文说明的异多聚体(例如含HD系链的单链单特异性或多特异性抗体、含HD系链的单特异性或多特异性抗体、免疫粘附素-抗体复合物)可用于治疗应用。例如，此类异多聚体可用于治疗有产生异多聚体的适当的候选靶的任何疾病，包括增殖性疾病、癌症、血管发生病症、炎性病症、自身免疫疾病和免疫病症。
除了治疗用途，本发明的异多聚体可用于其他目的，包括诊断方法，例如用于有产生抗体的适当的候选靶的任何疾病或病况的诊断方法，诸如上述疾病或病况。
VI.剂量、制剂和持续时间
本发明的异多聚体以符合良好医学实践的方式配制、分配剂量和给药。在此背景下考虑的因素包括治疗的具体病症、治疗的具体哺乳动物、个体对象的临床状况、病因、活性剂的递送位点、给药方法、给药安排和执业医师知悉的其他因素。待施用的蛋白质的“治疗有效量”由此类考虑决定，并且是预防、改善或治疗特定病症(例如增殖性疾病、癌症、血管发生病症、炎性病症、自身免疫疾病或免疫病症)所需的最小量。蛋白质不需要，但可任选地与一种或多种目前用于预防或治疗该病症的活性剂配制。此类其他活性剂的有效量取决于制剂中蛋白质的量、病症或治疗的类型和上述其他因素。它们通常以相同剂量和如前文所用的给药途径使用，或以迄今为止使用的剂量的约1至99％使用。
在一个实施方式中，本发明可用于增加易感或被诊断为患有具有产生异多聚体的适当的候选靶的特定病症的人类对象的存活持续时间。存活持续时间定义为从第一次施用药物到死亡的时间。存活持续时间也可用治疗组对比对照组的分层危害比(HR)测量，它代表治疗期间对象死亡的风险。
在另一个实施方式中，本发明的方法显著增加易感或被诊断为患有病症并用针对该病症的一种或多种疗法治疗的人对象组中的响应率。响应率定义为响应治疗的受治疗的对象的百分比。一方面，使用本发明的蛋白质和手术或其他治疗形式(例如放射治疗或化疗剂)的本发明的组合治疗与单独用手术或其他治疗形式治疗的组相比，显著提高受治疗的对象组的响应率，该提高的χ2p值小于0.005。在美国专利申请公布号20050186208中说明了癌症治疗的治疗效力的额外的测量。
治疗制剂是用本领域知悉的标准方法，通过将具有所需纯度的活性成分与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合而制备(Remington’s Pharmaceutical Sciences(第20版),编辑.A.Gennaro,2000,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA)。可接受的载体包括盐水或缓冲剂诸如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮、氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖醇例如甘露醇或山梨糖醇；成盐反离子例如钠；和/或非离子表面活性剂例如TWEENTM、PLURONICSTM或PEG。
任选但优选地，制剂包含有可药用的盐，优选地氯化钠，优选地在约生理浓度。任选地，本发明的制剂可包含可药用的防腐剂。在一些实施方式中，防腐剂的浓度范围为从0.1-2.0％，通常是v/v。适当的防腐剂包括药学领域已知的那些。苯甲醇、酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯是优选的防腐剂。任选地，本发明的制剂可包含可药用的表面活性剂，其浓度为0.005-0.02％。
如治疗的具体适应症的需要，本文的制剂也可包含多于一种活性化合物，优选地具有互补活性，但不彼此不利地影响的化合物。此类分子以对意欲的目的有效的量适当地组合存在。
活性成分也可包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、胶状药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或粗滴乳状液中。此类技术在Remington’s Pharmaceutical Sciences,见上文中公开。
可制备缓释制剂。缓释制剂的适当实例包括含有异多聚体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形产品，例如薄膜或微胶囊的形式。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)，及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等聚合物允许释放分子超过100天，某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当封装的本发明的异多聚体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性的可能改变。可根据相关机制设计合理策略以稳定化。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适当的添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。
按照已知方法，例如作为团注或通过在一段时间内连续输注的静脉内施用、通过肌肉内、腹腔内、脑脊内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、经口、局部或吸入途径对人类对象施用本文说明的蛋白(例如含HD系链的单链单特异性或多特异性抗体、含HD系链的多链单特异性或多特异性异多聚体、免疫粘附素-抗体复合物)。如果对蛋白识别的靶分子的拮抗与广泛的副作用或毒性有关，特别需要局部给药。治疗应用也可使用先体外后体内(ex vivo)策略。先体外后体内策略涉及用编码本发明的异多聚体的多核苷酸转染或转导从对象获得的细胞。然后将经转染或转导的细胞返回对象。细胞可以是多种类型的中的任一种，包括但不限于造血细胞(例如骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、T细胞或B细胞)、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角化细胞或肌肉细胞。
在一个实例中，在病症或肿瘤的位置允许时，本发明的异多聚体局部使用，例如通过直接注射，并且注射可周期性重复。蛋白复合物也可全身性地递送到对象或直接递送到肿瘤细胞，例如递送到肿瘤或手术切除肿瘤后的肿瘤床，以防止或降低局部复发或转移。
VII.制品
本发明的另一实施方式是含有一个或多个本文说明的异多聚体，以及用于治疗或诊断有产生异多聚体的适当的候选靶的任何病症的材料的制品。制品包含容器和在容器上或与容器结合的标签或包装说明书。适当的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可用多种材料例如玻璃或塑料制成。容器装有有效治疗病况的组合物，并可具有无菌进入口(例如容器可以是具有可被皮下注射针穿刺的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中至少一种活性剂是本发明的异多聚体。标签或包装说明书指示组合物用于治疗特定病况。标签或包装说明书还包含向对象施用异多聚体组合物的说明。也考虑包含本文说明的组合疗法的制品和试剂盒。
包装说明书指通常包含于治疗产品的商业包装中的说明，含有关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或关于使用此类治疗产品的警告的信息。
此外，制品还可包含第二容器，所述容器包含可药用的缓冲剂，例如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和葡萄糖溶液。它还可包含商业和用户立场上考虑的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
也提供用于多种目的，例如从细胞纯化或免疫沉淀抗原的试剂盒。为分离和纯化抗原，试剂盒可包含与珠(例如琼脂糖凝胶珠)偶联的异多聚体。可提供包含异多聚体的试剂盒，用于体外，例如在ELISA或Western印迹中检测和定量抗原。与制品相同，试剂盒包含容器和在容器上或与容器结合的标签或包装说明书。容器装有包含至少一种本发明的异多聚体的组合物。可包含额外的容器，所述容器包含例如稀释剂和缓冲剂或对照异多聚体。标签或包装说明书可提供对组合物的说明以及意欲的体外或诊断用途的说明。
VIII.靶分子
可被本发明的异多聚体(例如单链或多链抗体，或免疫粘附素-抗体复合物)靶向的分子的实例包括但不限于，可溶性血清蛋白、受体蛋白、膜结合蛋白(例如粘附素)、细胞因子、趋化因子、生长因子和激素。
可溶性抗原或其片段，任选地缀合于其他分子，可用作用于产生异多聚体的免疫原。对于跨膜分子，例如受体，其片段(例如受体的胞外结构域)可用作免疫原。备选地，表达跨膜分子的细胞可用作免疫原。此类细胞可源自天然源(例如癌细胞系)，或可以是已经用重组技术转化以表达跨膜分子的细胞。用于制备异多聚体的其他抗原及其形式对本领域技术人员是显而易见的。
上述书面说明书被认为足以允许本领域技术人员实施本发明。以下实施例仅以说明的目的提供，不意欲以任何方式限制本发明的范围。实际上，根据上述说明，除了本文展示和说明的之外的多种修改对本领域技术人员是显而易见的，落入所附的权利要求书的范围内。实施例中提供的说明意欲总体上被考虑为本发明的部分。
实施例
实施例1.构建用于表达含HD系链的异多聚体的载体
所有的含HD系链的异多聚体单链抗体构建物是从内部已有的IgG1单克隆抗体构建物制备的。LC是用PCR制备的，其中LC的3’引物延伸超过LC C端，编码CLH系链的N端部分，并终止于BamHI位点。5’LC引物终止于ClaI位点。随后消化PCR片段，并克隆到相似消化并脱磷酸的pRK载体中(Genentech Inc.；Eaton等人，,Biochemistry 25:8343-8347(1986))。然后用PCR制备同族HC，其中5’引物延伸超过HC N端(减去信号序列)，编码CLH系链的C端部分，并终止于BamHI位点。3’HC引物终止于XbaI位点。消化HC PCR片段，并克隆到相似地制备的含如上所述的同族LC并因此形成连接的半抗体的质粒中。定位BamHI位点使得它编码氨基酸残基“GS”并维持系链的GGS重复的完整性。然后使用Stratagene’s Quikchange II XL定点诱变试剂盒将位置K222(Kabat编号方案)的赖氨酸残基突变为丙氨酸残基。
然后通过另一轮PCR将两个上述CLH连接的半抗体结合到一起，其中用以上使用的相同的5’LC引物和延伸超过HC的C端，编码HD系链的N端并终止于BspEI位点的3’引物扩增预定为单链抗体的N端的半抗体。将PCR片段消化，并克隆到相似地消化并脱磷酸的pRK载体中。用构建半抗体中使用的相同的3’HC引物和延伸超过LC N端(减去信号序列)，编码HD系链的C端部分并终止于BspEI位点的5’引物扩增预定为异多聚体单链抗体的C端的半抗体。将PCR产物消化，并克隆到相似地消化并脱磷酸的N端构建载体中。与BamHI相同，可定位BspEI使得它维持系链的GGS重复的完整性。
含HD系链的异多聚体多链抗体的构建类似，仅区别于“半抗体”的N端以HC信号序列开始，并且其同族LC从第二pRK质粒单独表达。
实施例2.含HD系链的异多聚体的切割和纯化
可用于纯化本发明的异多聚体的示例性方案如下所示。
在4℃将异多聚体装载到蛋白A(例如mAbSure)柱上
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用KPO4、然后用PBS+0.1％Trition X114洗柱
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用100mM醋酸(pH2.9)洗脱样品
↓
用1M Tris将样品pH调整至pH8.0，然后在37℃消化1.5hr，1:500(wt:wt)
Lys-C
↓
在mAbSure树脂上纯化样品，以移除Lys-C
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用100mM醋酸(pH2.9)洗脱样品并用1M Tris中和至pH8
↓
用羧肽酶B1:5(wt:wt)在37℃切割样品2.5hr
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调整样品pH，并装载到在20mM醋酸钠pH5.0中，梯度至20mM醋酸钠+1M NaCl的阳离子交换柱上
↓
收集级分，汇集&透析到PBS中
具体地，用来自GE Healthcare(瑞典)的mAbSure选择树脂在4℃过夜从条件培养基中纯化异多聚体。用2倍柱体积(CV)的PBS(磷酸缓冲的盐水)、然后用10CV PBS+0.1％Triton X114去垢剂、然后用10CV磷酸钾缓冲液洗柱。用100mM醋酸(pH2.9)洗脱柱，并立即用Tris(终浓度200mM)pH8.0调至pH8.0。在用1:500(wt:wt)比率的Lys-C内肽酶()在37℃处理1-5小时后，从异多聚体移除HD系链。然后将样品装载到柱上以移除酶。然后用1:5(wt:wt)猪羧肽酶B(Roche Applied Sciences,Cat#10103233001)处理1-5小时，移除残留的弗林蛋白酶识别位点。将经切割的样品装载到阳离子交换柱上以移除酶。汇集峰级分并用PBS透析过夜，然后进行质谱分析以确保同一性和纯度。
实施例3.改造的异多聚体的鉴定
为确定用本发明的HD系链异多聚化技术构建的示例性异多聚体保持了其序列来源的抗体或粘附素的结合性质，进行了结合测定(图6A-6D)。结合测定是用ForteBio Octet系统的kinetics wizard程序完成的。所有样品在25μg/ml的浓度测试，该浓度说明了在重复实验和不同样品中抗人IgG探针的饱和。用第一样品装载探针10分钟，然后在PBS中洗30秒。所有与第二和第三样品的缔合进行15分钟，在缔合之间在PBS中洗30秒。
其他实施方式
本说明书中引用或参考的全部专利、专利申请、专利申请公布、其他发表物在此以引文合并入本文，其程度如同指明每个独立的专利、专利申请、专利申请公布或发表物具体地并且单独以引文合并。