蜱的抗凝血蛋白B26及其基因和应用的制作方法

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种蜱的抗凝血蛋白B26及其基因和应用。

背景技术：

在生物进化过程中,哺乳动物形成了一个复杂的凝血系统来阻止血液的流失,而很多以血液为生的生物体内往往存在很多抗凝血蛋白以对抗宿主的凝血功能。蜱是一类以吸血为生的体外寄生虫。与其他吸血节肢动物相比，蜱的吸血时间特别长，如硬蜱的吸血时间一般在10-14天(Sonenshine,1993)。蜱的长时间吸血过程，必然引起宿主一系列止血反应，如血管收缩、血小板凝集和血液凝固。为了进行持续的吸血，蜱必须克服宿主的止血反应，自从Waxman(1990)鉴定出第一个蜱的抗凝血分子以来，研究人员发现蜱的唾液腺在吸血过程中分泌产生多种抗凝血分子，如凝血酶(thrombin)抑制蛋白分子、凝血因子Xa(FXa)抑制蛋白分子和组织因子通路抑制蛋白分子(TFPI)等，已在美洲花蜱、变异革蜱、间突硬蜱、具尾扇头蜱、微小牛蜱等多种国外优势蜱体内被发现(Maritz-Olivier,2007)。尽管已报道的蜱抗凝血分子多达20多种，但完全鉴定的还很少。从目前的结果分析，蜱抗凝血分子多数属于Kunitz家族丝氨酸酶特异性抑制分子，特征性含有1个或2个KU结构功能域和高度保守的半胱氨酸残基，在进化上可能来自同一祖先(Lai,2004)。

由于血栓引起的人心、脑血管疾病严重威胁着人类健康，目前可用的抗栓制剂有限，因此，抗栓药物的研究一直是十分关注的领域(Bates and Weitz，2006)。根据水蛭(蚂蝗)抗凝血分子合成的抗凝血多肽Hirudin已被应用于医学临床(Turk，2006；Bates and Weitz，2006)。在已经鉴定的蜱抗凝血分子中，有2个分子在动物模型实验中具有抗血栓治疗作用，其中1990年鉴定的TAP分子为凝血因子Xa(FXa)抑制剂，重组表达的TAP在多个动物模型上都显示了良好的抗血栓作用，由于抗原性等原因目前还未能在人体临床上使用(Bates and Weitz，2006)，但利用TAP分子的结构和作用机制设计更小的、没有抗原性的抗栓药物，或者构建新型重组抗栓药物分子正在研究并取得进展，例如，应用TAP功能区序列和锚定蛋白Annexin V序列构建一个新的重组抗凝血蛋白分子，其抗血栓活性比单个锚定蛋白Annexin V的活性提高10倍(Chen，2005)。另一个蜱抗凝血分子Ixolaris，是近年从间突硬蜱鉴定的分子，与人的组织通道抑制因子(TFPI)同源，抑制凝血因子VIIa/组织因子复合体，在大鼠模型中，显示了很强的抗血栓作用(Monteiro,2005；Nazareth,2006)。这些研究表明，蜱的抗凝血分子可能开发为新型抗血栓药物。

亚洲璃眼蜱是中国优势蜱种之一，在牛、羊等多种动物吸血寄生，关于其抗凝血分子的研究还没有公开报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种蜱的抗凝血蛋白及其基因，该抗凝血蛋白为亚洲璃眼蜱的抗凝血蛋白B26，可用于制备抗凝血药物或抗凝血生物制剂。

此外，还需要提供一种蜱抗凝血蛋白B26的重组表达蛋白及其在制备抗凝血药物或抗凝血生物制剂中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种蜱的抗凝血蛋白，该抗凝血蛋白为亚洲璃眼蜱的抗凝血蛋白B26，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种蜱的抗凝血蛋白基因，所述基因为亚洲璃眼蜱的抗凝血蛋白B26基因，该B26基因包含：编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

优选的，所述抗凝血蛋白基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述亚洲璃眼蜱抗凝血蛋白B26编码基因的重组载体。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述重组载体的细胞。

在本发明的另一方面，还提供了一种抗凝血重组蛋白，该重组蛋白是由上述重组载体经表达而制得。

在本发明的另一方面，还提供了一种抗凝血蛋白的重组表达方法，包括以下步骤：

构建含亚洲璃眼蜱抗凝血蛋白B26编码基因序列的重组表达载体；

将所述重组表达载体转化至大肠杆菌中，经诱导表达获得B26抗凝血重组蛋白。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述蜱抗凝血蛋白在制备抗凝血药物或抗凝血生物制剂中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述蜱抗凝血蛋白基因在制备抗凝血药物或抗凝血生物制剂中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述抗凝血重组蛋白在制备抗凝血药物或抗凝血生物制剂中的应用。

本发明的亚洲璃眼蜱抗凝血蛋白B26，经重组表达后获得抗凝血蛋白B26重组蛋白，该重组蛋白经部分凝血酶激活时间(Activated Partial Thromboplastin Time，APTT)实验证实，具有抗凝血生物活性，非常适于制备抗凝血生物制剂。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明B26全长基因序列及推测的氨基酸序列示意图；

图2是本发明实施例2的B26基因重组表达产物的SDS-PAGE分析结果图；

图3是本发明实施例2不同浓度的重组蛋白B26的APTT实验凝血时间结果图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。

本发明通过构建亚洲璃眼蜱雌蜱吸血前后的唾液腺消减文库和测序分析，从亚洲璃眼蜱克隆到一个抗凝血分子B26的全长编码基因，该基因全长为540bp，有一个完整开放阅读框架，从第53个碱基到358个碱基，编码101个氨基酸多肽，预测的蛋白含有一个典型的Kunitz结构域，并在N端有信号肽序列。将除去信号肽后的编码序列与pGEX-4T-3表达载体连接，转化至大肠杆菌BL21中，得到重组表达蛋白。以纯化的重组蛋白进行部分凝血酶激活时间实验，证实蜱抗凝血蛋白B26分子具有抗凝血生物活性，可用于制备抗凝血生物制剂。

实施例1亚洲璃眼蜱抗凝血蛋白B26的基因克隆和序列分析

1.材料与方法

1.1实验动物：亚洲璃眼蜱采自新疆绵羊，由本实验室兔体繁殖保存。新西兰大白兔购自中国科学院上海实验动物中心。

1.2试验菌种、质粒及试剂：大肠杆菌菌株DH5α购自博大泰克公司，质粒pGEM-T Easy、T4DNA连接酶购自Promega公司，质粒pGEX-4T-3购自Amersham Pharmacia Biotech；TRIZOL试剂购自Invitrogen公司；DNA胶回收试剂盒购自赛百盛公司；Taq DNA聚合酶、DNA Marker购自TaKaRa公司；PCR SelectTM cDNA Subtraction Kit，SMART PCR cDNA Synthesis Kit，PCR Purification Kit为Clontech公司产品。

1.3亚洲璃眼蜱唾液腺的制备

亚洲璃眼蜱未吸血成蜱按雌雄1∶1混合接种兔耳，接种后4-5天，取出半饱血雌蜱，解剖镜下分离唾液腺，-70℃保存备用；同一蜱群未吸血雌蜱的唾液腺按同样方法分离。

1.4蜱唾液腺总RNA的提取

采用Invitrogen公司的Trizol试剂，按实验说明操作，分别提取亚洲璃眼蜱未吸血雌蜱和半饱血雌蜱总RNA，溶于无RNase的水中，测定总RNA浓度，然后保存于-70℃冰箱备用。

1.5双链cDNA的合成

采用Clontech公司的SMART PCR cDNA Synthesis Kit，分别以总RNA为模板，用Olig(dT)18引物在M MLV逆转录酶作用下合成第一链cDNA(ss cDNA)，并用长距离PCR(LD-PCR)扩增cDNA第二链(ds cDNA)。

1.6抑制性消减杂交

应用Clontech PCR SelectTM cDNA Subtraction Kit。本试验以半饱血雌蜱唾液腺为Tester，以未吸血雌蜱唾液腺为Driver；步骤如下：分别将Adaptor1-Tester cDNA和Adaptor2R-Tester cDNA与Driver cDNA混合，68℃温育8h，进行第1轮杂交；将上述两个反应产物混合，并再次加入足量的Driver cDNA，68℃过夜，进行第2轮杂交；对消减杂交的产物进行两轮PCR扩增，分别以加接头未消减的半饱血雌蜱的cDNA做对照。PCR的引物序列对应于Adaptor1和Adaptor2R的序列(Clontech PCR SelectTM cDNA Subtraction Kit)。

1.7消减文库的建立、阳性克隆的筛选、EST序列测定与分析

PCR扩增后的消减杂交产物经PCR Purification Kit纯化，与pGEM-T-easy载体连接，转化到感受态细胞DH5α筛选蓝白斑，挑取全部白色克隆，以巢式PCR引物Primer1和Primer2R进行扩增，将阳性克隆送上海英俊生物技术公司测序，测序结果在GenBank上进行同源性分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。

1.8抗凝血分子B26的全长基因序列测定和分析

根据EST序列信息，挑选一个编号为B26的EST序列，进行全序列测定和生物信息学分析，结果为完整编码抗凝血分子同源性基因，命名为B26基因。

2.结果与分析

亚洲璃眼蜱雌蜱吸血前后唾液腺消减文库成功构建，对所有克隆进行末端测序分析，共获得120个有效EST序列。对其中一个抗凝血分子同源性基因的克隆，进行了全序列测定和生物信息学分析，发现为完整编码基因，命名为B26基因。如图1所示，该B26基因全长为540bp(SEQ ID NO.2),在3'端有polyA和polyA的信号序列AATAAAA,含有有一个完整的开放阅读框,编码101个氨基酸(SEQ ID NO.1)。图1中，下划线部分表示信号肽序列，方框部分表示Kunitz功能域结构，*表述终止密码子。蛋白质信号肽分析，B26蛋白在N-端有一个23个氨基酸构成的信号肽序列(http://www.cbs.dtu.dk)，预测实际编码分子量为8.4kDa多肽(Genetyx-win)。蛋白质功能域分析，在其编码的氨基酸序列的30-89位存在由一个α螺旋和两个反向平行的β折叠构成的单Kunitz结构域(http://smart.embl-heidelberg.de)。BlastP分析发现该分子与抗凝血分子之一的组织通道抑制因子(TFPI)显著同源(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)。

实施例2亚洲璃眼蜱抗凝血蛋白B26基因的重组表达和抗凝血活性验证

1.材料与方法

1.1实验动物：新西兰大白兔购自中国科学院上海实验动物中心。

1.2试验菌种、质粒及试剂：大肠杆菌菌株DH5α、BL21(DE3)购自博大泰克公司，质粒pGEM-T Easy、T4DNA连接酶购自Promega公司，质粒pGEX-4T-3购自Amersham Pharmacia Biotech；DNA胶回收试剂盒购自赛百盛公司；Taq DNA聚合酶、DNA Marker、EcoRI和Xhol内切酶购自TaKaRa公司。GST·Bind^TM试剂盒购自Novagen；APTT试剂盒购于美国SIEMENS公司；BCA蛋白分析试剂盒为PIERCE公司产品；引物由赛百盛公司合成。

1.3亚洲璃眼蜱B26的重组表达质粒构建

根据亚洲璃眼蜱B26基因生物信息学分析结果，将不包含信号肽序列的实际编码区亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中，

上游引物为:5’GAATTCAGTTGCTTTCGAACAGCCGAAGTAC3’(SEQ ID NO.3)；

下游引物为:5’CTCGAGCTAGTTCCATCCGTCGCAATA3’(SEQ ID NO.4)。

5’端和3’端分别引入EcoRⅠ和Xhol Ⅰ酶切位点，斜体字母表示酶切位点，方框中为保护性碱基。以重组克隆载体pGEM/B26为模板进行PCR扩增；该程序为：94℃2min后，以94℃45s，53℃45s，72℃60s循环30次后，最后72℃延伸7min。将PCR产物回收、酶切、纯化，同时将载体pGEX-4T-3用相应的酶作双酶切，将酶切后纯化的PCR产物和载体连接，转化DH5α，经PCR和酶切鉴定阳性菌落，按试剂盒说明书操作抽提阳性菌的重组质粒pGEX-4T-3/B26。

1.4亚洲璃眼蜱B26的的重组表达与纯化

将重组质粒转化到BL21(DE3)，37℃、200r/min振荡培养，当菌液OD600在0.6～0.8左右时，向培养基中加入IPTG，使终浓度为1mmol/L，继续培养4h后，离心收集菌体，用12％SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况，重组GST融合表达蛋白，用GST·Bind^TM试剂盒纯化，BCA法测蛋白浓度。

1.5重组蛋白部分凝血酶活化时间(APTT)的测定

按体积比，将9份新西兰大白兔静脉血加1份3.8％的枸橼酸钠抗凝剂混匀，1000g离心10分钟，制备兔血浆。将不同浓度的重组蛋白加入至抗凝血浆中，使其终浓度分别为0uM、0.5uM、1uM、1.5uM和2uM，对照组加入同浓度的GST蛋白。将APTT的试剂Dade Actin Reagente Cefaloplastina Attivata、CaCl2放到血凝分析仪CA-500(日本SYSMEX公司)中，将制备好的含重组蛋白的抗凝样本放至样本架。在屏幕上进入WORK LIST菜单，设好ID号及要检测的项目，准备好后按START键开始进行测定。每个样本的APTT试验均重复三次。

2.结果与分析

2.1亚洲璃眼蜱B26的基因的表达与纯化

亚洲璃眼蜱B26的重组质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21中,经IPTG诱导成功表达。SDS-PAGE电泳结果显示(见图2)，在分子量约为35kDa左右有一明显的条带，与该基因的理论值相符。阳性重组菌经4h扩大培养，反复冻融超声裂解，尿素变性，GST标签蛋白纯化试剂盒纯化，PBS透析，得到纯化的B26蛋白，同样的方法得到GST标签蛋白。图2中，M：蛋白分子量标准；1：未诱导的B26-pGEX-4T-3转化菌沉淀；2：IPTG诱导后的B26-pGEX-4T-3转化菌沉淀；3：纯化的重组蛋白；4：GST标签蛋白。

2.2重组Rhipilin-1对兔血浆部分凝血酶激活时间的影响

兔血浆部分凝血酶激活时间(APTT)的实验结果如图3所示，与对照GST相比，当亚洲璃眼蜱B26重组蛋白终浓度为0.5uM、1uM、2uM时，B26融合蛋白的APTT凝血时间明显延长，显示了抗凝血活性，而在空白对照和高浓度时则没有抗凝效果。图3中，*表示T检验显著性差异。

由上述实验结果可知，本发明亚洲璃眼蜱B26可用于制备抗凝血生物制剂或抗凝血药物。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。