一种高效提取深层液态发酵生产樟芝菌丝体多糖的方法
【专利摘要】本发明公开了一种高效提取深层液态发酵生产樟芝菌丝体多糖的方法，该方法是将樟芝发酵液分离的菌丝体通过超声波和复合酶解进行处理、分离得到樟芝多糖。本发明改变了传统的多糖“水提醇沉”的提取方式，提高了樟芝多糖的提取收率和产品品质，减少了生产中纯化水用量和能源消耗，增加了经济效益。
【专利说明】一种高效提取深层液态发酵生产樟芝菌丝体多糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】，具体是一种高效提取深层液态发酵生产樟芝菌丝体多糖的方法。
【背景技术】
[0002]樟芝又名樟生薄孔菌,牛樟燕，牛樟芝，红樟芝，樟燕，樟郝，樟窟内郝，红樟，隶属真菌门，担子菌亚门，层菌纲，多孔菌科，薄孔菌属多年生蕈类，是台湾特有一种珍稀、尚未开发的名贵食、药用真菌。只生长在台湾山区海拔450~2000公尺间特有的牛樟树树干腐朽之心材内壁,或枯死倒伏之牛樟木材阴暗潮湿之表面,发现着实不易。樟芝作为台湾特有的菌种，自然环境中牛樟树是其唯一的寄主，一般真菌不能在其上生长。由于樟芝可造成牛樟树中心空洞腐朽，加上人对牛樟树乱砍乱伐,致使牛樟树数量相当稀少，目前已被列为一级保育树种。近百年来，牛樟树难得一见，而能够长出牛樟芝的牛樟树则更少，其结果导致野生樟芝资源严重短缺。因此樟芝十分珍贵，在港澳台被称为“神芝”，台湾民间则称樟芝为“森林中的红宝石”。
[0003]近年来，研究得知樟芝能有效治疗肝病及其它方面如:抗肿瘤、抗病毒、抗过敏、降血脂、降血糖的疾病。研究发现，樟芝多糖是樟芝中的主要活性物质，具有免疫生理活性、预防及控制肿瘤等生理活性，主要含0-0^111(^11(0-0-葡聚糖))其作用是透过激发巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞以及自然杀手细胞等来增强免疫功能，进而达到抗肿瘤的效果。此外樟芝多糖还有强心、降血压、降血糖、抗血栓等功效。
[0004]目前国内外对樟芝的研究还不是很透彻，采取的主要培养法是固体发酵法。由于此法发酵周期长，劳动强度大，占地面积广，受季节限制，而且容易污染，不宜进行纯种发酵等缺点，导致樟芝发酵规模一直得不到扩大。为此，以生物技术方法进行天然樟芝液体深层发酵培养可以缩短培养时间，获得大量且纯正的菌丝体，成本低，可实现发酵工业的连续化、自动化，提升生产效益，成为十分值得开发的途径。国内外也有少量研究者对樟芝的深层发酵进行过研究，但往往其主要侧重点是如何获取更高的生物量，而目前国内关于液态发酵生产樟芝的功效成分多糖的相关报道很少。目前关于真菌类原料多糖的提取工艺多为传统的水提醇沉法，即向干燥后的菌丝体加入8-20倍重量的水，控制温度80-100°C浸泡2_4h，静止1-2h，然后反复浸提2-3次，然后合并上清液进行浓缩，再用50-85%的酒精进行醇沉，最终烘干即可得到粗多糖。此工艺的缺点是需加入大量水长时间进行浸提，并且为提高收率需反复浸提2-3次，操作周期较长、劳动强度偏大，并且多糖的提取收率多在2-3%，产品成本比较昂贵。并且分离的上清液作为废液直接弃液排掉，增加了治污成本。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了解决传统多糖的水提醇沉的技术瓶颈，采用此发明能够快速、高效生产出樟芝多糖。
[0006]为了实现上述目的，本发明主要按照下述步骤进行:
[0007]—种樟芝菌丝体多糖的提取方法，该方法包括下述步骤:
[0008]I)分离:将樟芝发酵液经分离，得到樟芝上清液和湿菌丝体；
[0009]2)超声处理:向步骤I)所得的湿菌丝体中加入步骤I)所得2-5倍的樟芝上清液进行稀释，搅拌均匀后进行超声处理10-40min，得到超声处理液；上清液的添加主要是作为水溶性溶液来进行提取菌丝体中的多糖，添加量偏少，提取不完全，收率偏低，并且在超声过程中容易温度偏高，影响设备使用；若添加过多，后期处理需消耗大量的能源，成本偏闻;
[0010]3)复合酶解:将步骤2)所得超声处理液调节pH值为4-7，控制温度30_70°C，然后向其加入相当于干菌丝体重量0.2-3 %的纤维素酶以及相当于干菌丝体重量0.2-3 %的蛋白酶，进行酶解l_4h，得到酶解液；
[0011]4)分离、浓缩:将步骤3)所得的酶解液进行分离，将分离所得到的上清液经低温浓缩，浓缩过程均要求控制温度不高于75°C，真空度不低于0.085MPa，得到浓缩比重为
1.25~1.40的浓缩浆；
[0012]5)醇沉、烘干:加入浓缩浆重量3-5倍量的95%酒精，用酒精计检测混合液酒精度为65-80 % (v/v)，静置2-6h，将沉淀物进行真空烘干，温度50-75°C，真空度不低于0.085MPa ;烘干至干燥物水分含量为3~8%，即得菌丝体多糖提取物。
[0013]其中，步骤1)、4)所述的所述的分离为离心分离，采用三足离心机或高速离心机等离心设备进行，转速控制在1500-5000rpm。
[0014]步骤2)超声所用的设备为超声波细胞粉碎机，其他同等超声设备均可；超声功率为 0.5-2.5kw0
[0015]所述的纤维素酶酶活为15000 μ /g~25000 μ /g,所述的蛋白酶的单位酶活为47000 μ /g ~53000 μ /g。
[0016]步骤4)所述的低温浓缩过程均要求控制温度不高于75°C，真空度不低于0.085Mpa。
[0017]5)所述的真空烘干的温度控制在50-75 °C，真空度不低于0.085Mpa。
[0018]本发明中醇沉次数越多，多糖的含量越高。真空烘干采用的真空干燥箱，本发明提取的多糖含量在30-60%。
[0019]本发明具有以下几个突出的优点:
[0020]传统的工艺是至少用菌丝体干重的20倍的纯化水进行稀释，而本工艺采用上清液进行稀释，并且添加量只为菌丝体干重的2-5倍；具有以下优点:1、本发明利用上清液替代纯化水进行稀释，减少了废液排放，减少了治污成本；2、因上清液中含部分胞外多糖，作为溶液稀释时，其中所含的多糖也可被回收利用。3、用上清液替代纯化水，节约了纯化水，降低生产成本。
[0021]本发明提取路线简洁，节约了大量的能源消耗:因减少了纯化水的加入量，相应的在后期的分离、浓缩等工序减少了大量的电、蒸汽能源的消耗。
[0022]缩短了操作周期，减少了劳动强度:本发明改变了传统的多次浸提，采用一次短时间处理，是传统处理时间的1/3-1/6，减轻了工人的劳动强度。
[0023]提高了提取收率:传统的水提多糖的提取收率在2_3%，此发明用超声和酶解加剧了菌丝体胞内产物的溶出度，本发明提取多糖收率在4-5%，比传统工艺提升了近I倍。
[0024]提升了产品品质:因本发明采用超声和复合酶解处理菌丝体，将部分菌丝体的蛋白降解成可溶性的小分子物质，减少了在醇沉过程中杂质蛋白的含量，提升了多糖的产品品种，采用本发明提取多糖含量多在40%以上，比传统工艺提升了 30%以上。
[0025]采用本发明可根据市场需求和产品标准，制得不同含量的高品质的多糖，多糖含量可在30-60%。
【具体实施方式】
[0026]以下通过具体实施例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发明，不应理解为对本发明总的技术方案的限定。本发明使用于普遍的樟芝菌，其来源不受实施例的限制，实施例中使用的菌种编号为CGMCC N0.0543的樟芝菌种仅是为了举例说明本发明的技术方案。
[0027]实施例1
[0028]本发明高效提取深层液态发酵生产樟芝菌丝体多糖的方法按下述步骤进行:
[0029]1、樟芝发酵液的制备:樟芝菌种购买于中科院微生物研究所(其菌种编号为CGMCC N0.0543)。将活化好的樟芝摇瓶菌株按接种量10% (v/v)接种于种子培养基(1L)，其中种子培养基组成为葡萄糖3%、蛋白胨0.2%、酵母粉1%、磷酸二氢钾0.3%、七水硫酸镁0.15%、豆油0.02%，用稀硫酸调节pH值4.8，通风比为1:0.3vvm，罐压0.03Mpa，26~28°C振荡培养7天即得樟芝种子液；将种子液按接种量15% (v/v)接入发酵培养基(50L)，其中发酵培养基组成为葡萄糖2.8 %、蛋白胨0.5 %、酵母粉1.0%、磷酸二氢钾0.2 %、七水硫酸镁0.2%、硫酸锌 0.10%、豆油0.03%，用稀硫酸调节pH值4.8 ;通风比为1:0.5vvm，罐压0.03Mpa, 26~28°C培养7天，发酵至发酵液香气浓郁(牛奶香味)、菌球变碎、滤液浑浊；pH值降至最低3.2并略有波动，还原糖降至最低0.6并略有波动；镜检菌丝细碎，大量孢子，无杂菌污染，即得樟芝发酵液。其中上述培养基组成中的“ ”均表示g/100ml。
[0030]2、樟芝发酵液分离:取上述樟芝发酵液1Kg通过高速离心机3000rpm进行分离，得到樟芝上清液液9.5Kg和0.5Kg的湿菌丝体(含水量为80% );
[0031]3、超声处理:向步骤2所得的0.5Kg湿菌丝体中加入1.SKg的樟芝上清液进行稀释，搅拌均匀后进行1.0kw超声处理20min，得到超声处理液2.3Kg ；
[0032]4、复合酶解:将步骤3所得超声处理液调节pH值为5.5，在水浴控制温度45 °C，然后向其缓慢加入纤维素酶2.0g (购自枣庄杰诺生物酶有限公司，单位酶活20000 μ /g,下同)、蛋白酶1.Sg(购自枣庄杰诺生物酶有限公司，单位酶活50000 μ /g，下同)并不断搅拌，搅拌均匀后计时进行酶解2h，得到酶解液；
[0033]5、分离、浓缩:将步骤4所得的酶解液用高速离心机5000rpm进行分离，将分离所得到的上清液1.9Kg用旋转蒸发仪低温浓缩，浓缩过程均要求控制温度不高于75°C，真空度不低于0.085MPa，得到浓缩比重为1.3(50°C热测)的浓缩浆50g ；
[0034]6、醇沉、烘干:向50g浓缩浆的中加入180ml的95%酒精，用酒精计检测混合液酒精度72% (v/v)，缓慢搅拌均匀后静置2h，将底部沉淀物分离用真空干燥箱进行烘干，温度60°C，真空度0.09MPa ;烘干Ih得樟芝菌丝体多糖提取物12.6g。检测水分含量为3.7%，多糖含量为42%，折合纯多糖提取收率为5.29%。
[0035]发明中的多糖提取收率是按干菌粉计算的。即多糖提取收率=菌丝体多糖提取物质量*多糖含量/ [湿菌丝体质量* (1-湿菌丝体含水量)]*100 %
[0036]实施例2
[0037]本发明高效提取深层液态发酵生产樟芝菌丝体多糖的方法按下述步骤进行:
[0038]1、樟芝发酵液的制备:樟芝菌种购买于中科院微生物研究所(其菌种编号为CGMCC N0.0543)。将活化好的樟芝摇瓶菌株按接种量12% (v/v)接种于种子培养基(20L)，其中种子培养基组成为葡萄糖3%、蛋白胨0.2%、酵母粉I %、磷酸二氢钾0.3%、七水硫酸镁0.15 %、豆油0.02%，用稀硫酸调节pH值4.8，通风比为1:0.3vvm，罐压0.03Mpa,26~28°C振荡培养7天即得樟芝种子液；将种子液按接种量18% (v/v)接入发酵培养基(100L)，其中发酵培养基组成为葡萄糖2.8%、蛋白胨0.4%、酵母粉1.2%、磷酸二氢钾
0.2%、七水硫酸镁0.2%、硫酸锌0.10%、豆油0.03%，用稀硫酸调节pH值4.8 ;通风比为1:0.5vvm,罐压0.03Mpa, 26~28°C培养7天，发酵至发酵液香气浓郁(牛奶香味)、菌球变碎、滤液浑浊；pH值降至最低3.2并略有波动，还原糖降至最低0.3并略有波动；镜检菌丝细碎，大量孢子，无杂菌污染，即得樟芝发酵液。其中上述培养基组成中的“ ％ ”均表示g/100ml。
[0039]2、樟芝发酵液分离:取上述樟芝发酵液20Kg通过高速离心机3000rpm进行分离，得到樟芝上清液液19.0Kg和1.0Kg的湿菌丝体(含水量为80% );
[0040]3、超声处理:向步骤2所得的1.0Kg湿菌丝体中加入2.6Kg的樟芝上清液进行稀释，搅拌均匀后进行2.0kw超声处理25min，得到超声处理液3.6Kg ；
[0041]4、复合酶解:将步骤3所得超声处理液调节pH值为5.0，在水浴控制温度50°C，然后向其缓慢加入纤维素酶4.2g (购自枣庄杰诺生物酶有限公司，单位酶活20000 μ /g,下同)、蛋白酶3.Sg(购自枣庄杰诺生物酶有限公司，单位酶活50000 μ /g，下同)并不断搅拌，搅拌均匀后计时进行酶解2h，得到酶解液；
[0042]5、分离、浓缩:将步骤4所得的酶解液用高速离心机5000rpm进行分离，将分离所得到的上清液2.SKg用旋转蒸发仪低温浓缩，浓缩过程均要求控制温度不高于75°C，真空度不低于0.085MPa，得到浓缩比重为1.4(50°C热测)的浓缩浆105g ；
[0043]6、醇沉、烘干:向105g浓缩浆的中加入350ml的95%酒精，用酒精计检测混合液酒精度74% (v/v)，缓慢搅拌均匀后静置2.5h，将底部沉淀物分离用真空干燥箱进行烘干，温度60°C，真空度0.09MPa ;烘干Ih得樟芝菌丝体多糖提取物23.8g。检测水分含量为
3.1%，多糖含量为45%，多糖提取收率为5.35%。
【权利要求】
1.一种樟芝菌丝体多糖的提取方法，其特征在于该方法包括下述步骤: 1)分离:将樟芝发酵液经分离，得到樟芝上清液和湿菌丝体； 2)超声处理:向步骤I)所得的湿菌丝体中加入步骤I)所得2-5倍的樟芝上清液进行稀释，搅拌均匀后进行超声处理10-40min，得到超声处理液； 3)复合酶解:将步骤2)所得超声处理液调节pH值为4-7，控制温度30-70°C，然后向其加入相当于干菌丝体重量0.2-3 %的纤维素酶以及相当于干菌丝体重量0.2-3 %的蛋白酶，进行酶解l_4h，得到酶解液； 4)分离、浓缩:将步骤3)所得的酶解液进行分离，将分离所得到的上清液经低温浓缩，浓缩过程均要求控制温度不高于75°C，真空度不低于0.085MPa，得到浓缩比重为1.25~1.40的浓缩浆； 5)醇沉、烘干:加入浓缩浆重量3-5倍量的95%酒精，用酒精计检测混合液酒精度为65-80% (v/v)，静置2-6h，将沉淀物进行真空烘干，温度50-75 °C，真空度不低于0.085MPa ；烘干至干燥物水分含量为3~8%，即得菌丝体多糖提取物。
2.根据权利要求1所述的樟芝菌丝体多糖的提取方法，其特征在于所述的所述的分离为离心分离，转速控制在1500-5000rpm。
3.根据权利要求1所述的樟芝菌丝体多糖的提取方法，其特征在于所述的纤维素酶酶活为15000 μ /g~25000 μ /g，所述的蛋白酶的单位酶活为47000 μ /g~53000 μ /g。
4.根据权利要求1所述的樟芝菌丝体多糖的提取方法，其特征在于步骤4)所述的低温浓缩过程均要求控制温度不高于75°C，真空度不低于0.085Mpa。
5.根据权利要求1所述的樟芝菌丝体多糖的提取方法，其特征在于步骤5)所述的真空烘干的温度控制在50-75°C，真空度不低于0.085Mpa。
【文档编号】C08B37/00GK104072631SQ201410336261
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】王文风, 徐国华, 徐玲, 王英燕, 杨亚威, 黄盟盟, 张芙蓉 申请人:江苏阜丰生物科技有限公司