一种阳离子化丝素蛋白/基因复合物、制备方法及其应用与流程

本发明属于生物医用高分子材料技术领域，尤其是涉及一种靶向型基因载体材料、制备方法与应用。

背景技术：
近年来基因治疗技术的发展使得基因缺陷导致的疾病或癌症等的根治成为可能，也为外伤、手术等原因造成的组织缺损的修复及功能恢复提供了新的途径。成功的基因治疗需要将目的基因有效的运送到细胞内。理想的基因传递载体应该具有细胞靶向性、高度稳定性、低细胞毒性及高转染效率；同时载体应简便易制、可大量生产且使用方便。病毒类载体虽然转染效率高，但存在免疫原性、突变性等安全隐患，且制备方法复杂，极大地限制了其发展。非病毒类载体因易于大量制备且不存在病毒类载体的安全隐患等优点，开发应用前景广阔。阳离子聚合物如超支化树枝状聚合物、聚乙烯亚胺等，作为非病毒基因载体具有明显的生物安全性优势和较高的转染效率，其不足之处在于有细胞毒性和不可降解。脂质体类非病毒基因载体具有较好的穿膜性和高的转染效率，但存在细胞靶向性低、体内稳定性差和表达时间短等不足。壳聚糖类天然高分子材料具有良好的生物相容性和生物降解性，但普遍缺乏靶向性并且转染效率低。近年来为了增强非病毒载体对靶向细胞的特异性识别，通常采取将具有靶向识别能力的配体，如半乳糖、叶酸、转铁蛋白和精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸（RGD）三肽等，通过一定化学键偶联到载体表面以提高其转染效率。RGD三肽序列能够与细胞膜上的整合素发生特异性相互作用，靶向识别并粘附到含有其受体的细胞表面，因此很多研究通过将RGD三肽偶联到载体材料上，提高细胞对载体的内吞作用。但复杂的化学修饰过程往往会在实际制备中存在困难。因此开发具有良好生物相容性、生物降解性和高转染效率的新型非病毒基因传递载体是十分重要和必要的。蚕丝是一种天然蛋白质纤维，作为手术缝合线在临床中已应用近百年。家蚕丝素蛋白作为家蚕丝的主要成分，具有良好的生物相容性及生物降解性。近年来，将家蚕丝素蛋白应用于组织工程支架及药物控释载体等生物医用材料领域的研究愈来愈多。柞蚕、天蚕等野蚕丝素中含有丰富RGD序列，能特异性识别、结合表面大量表达αvβ3和αvβ5整合素的人类细胞和哺乳动物细胞，例如新生血管内皮细胞等，有利于细胞的特异性粘附，因而比家蚕丝素具有更强的生物活性及生物医学应用前景。但因为丝素蛋白在中性环境下带负电荷，难以直接包装、压缩DNA，所以应采取必要的手段，赋予柞蚕丝素包装、压缩DNA的能力。鱼精蛋白是从成熟雄鱼精细胞中分离出来的一种天然阳离子多肽，由30个左右氨基酸组成，其中2/3以上为精氨酸，等电点pI为l0～12，可被生物降解。鱼精蛋白硫酸盐注射液已通过FDA批准用于临床，具有良好生物安全性。鱼精蛋白能够通过静电作用力压缩DNA类物质至纳米尺寸，并且含有一种核定位短肽，具有一定的核定位功能，能够协助DNA靶向进入细胞核。在本发明之前，公开号为101225399A的中国发明专利中提供了一种聚氨基酸材料的非病毒基因载体的制备方法，其原理是利用氨基醇对低聚氨基酸侧基进行开环后，通过活化氨基醇上的活泼羟基，连接聚乙烯亚胺，获得聚氨基酸-氨基醇与聚乙烯亚胺的功能性复合材料。这种方法获得的新型基因载体转染效率高。但是，高分子量的聚乙烯亚胺不能被生物降解，且反应过程中要用到丙酮、二甲基亚砜等有机试剂，残留在载体内的试剂有细胞毒性隐患。同时反应过程中涉及避光、通氮气等步骤，制备过程较为复杂。文献“AntheraeapernyisilkfibroinfortargetedgenedeliveryofVEGF165-Ang-1withPEI”（Biomed.Mater.9(2014)035015）中，通过静电自组装法制备了一种含靶向遮蔽体系的基因传递系统，包括富含RGD序列的柞蚕丝素遮蔽体系、聚乙烯亚胺阳离子载体和质粒DNA，该具有遮蔽体系的靶向基因载体系统能够有效靶向识别细胞，避免基因载体的非特异性吸附，同时降低了复合物的细胞毒性。但是由于丝素蛋白在中性环境下带大量负电荷，等电点pI约为4.0～4.5，大大降低了带负电荷的细胞表面对载体的吸附，影响载体与目标细胞的结合效率，转染效率仍然不高。

技术实现要素：
本发明针对现有技术中非病毒基因载体存在的不足，提供一种能有效提高载体与目标细胞的结合效率和转染效率的阳离子化丝素及其与基因的复合物、制备方法及其应用。本发明通过以下技术方案的实施实现发明目的：提供一种阳离子化丝素蛋白/基因复合物的制备方法，将蚕丝脱胶后得到的丝素溶解，经透析、过滤得到丝素蛋白溶液，再进行如下步骤的加工：1、将硫代琥珀酰亚氨基-4-[N-马来酰亚胺甲基]-环己烷-1-羧酸酯（sulfo-SMCC）溶解于PBS缓冲溶液中，将得到的溶液滴加到浓度为1～20mg/ml的丝素蛋白溶液中，按质量百分比，sulfo-SMCC为丝素蛋白的0.25～5%；在温度为0～4℃、搅拌条件下反应，再经超滤离心处理后，得到截留分子量为9～12kDa的活化丝素蛋白溶液；2、将硫酸鱼精蛋白溶解于含5mMEDTA的PBS缓冲溶液中，再加入水溶性2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐（Trant’s试剂），硫酸鱼精蛋白的浓度为1～20mg/ml，鱼精蛋白与Trant’s按质量比为1:(1～20)；在温度为0～4℃、搅拌条件下反应，得到巯基化鱼精蛋白溶液；3、将步骤2得到的巯基化鱼精蛋白溶液与步骤1得到的活化丝素蛋白溶液混合，巯基化鱼精蛋白与活化丝素蛋白的质量比为（0.025～0.1）：1；在温度为0～4℃的条件下反应，得到的反应液在去离子水中透析,截留分子量为9～12kDa，再经超滤离心处理，得到经鱼精蛋白改性的阳离子化丝素蛋白溶液；4、在温度为2～8℃、搅拌步骤3制备的阳离子化丝素蛋白溶液15～30min后将基因物质滴加到溶液中，阳离子化丝素蛋白与基因的质量比为（2～10）：1；涡旋处理30～45s，升温至25～37℃，静置30～45min，得到阳离子化丝素蛋白/基因复合物。本发明技术方案所述的丝素为柞蚕丝素、天蚕丝素，所述丝素蛋白的分子量分布在15～250kDa范围内。所述的硫酸鱼精蛋白的分子量分布在4.9～5.1kDa范围内。所述的基因为质粒DNA或siRNA。本发明制备方法得到的阳离子化丝素蛋白的等电点pI为7～8，表面Zeta电位为+12～+20mV。本发明技术方案还包括按上述制备方法得到的阳离子化丝素蛋白/基因复合物。它的表面Zeta电位为+3～+10mV，粒径为100～260nm。本发明提供的阳离子化丝素蛋白/基因复合物的应用，将复合物中携带的基因传递给靶细胞，其靶细胞为细胞膜表面大量表达αvβ3和αvβ5整合素的细胞。所述的靶细胞为血管内皮细胞、L929成纤维细胞、Hela人宫颈癌细胞、HCT116结肠癌细胞及U87胶质瘤细胞。本发明用鱼精蛋白对丝素蛋白进行阳离子化改性，构建同时具备细胞靶向识别及细胞核定位功能的安全高效基因传递载体，其发明原理是：阳离子化丝素由水溶性2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐（2-Iminothiolane•HCl，Traut,sReagent）介导鱼精蛋白硫酸盐（PS）偶联经硫代琥珀酰亚氨基-4-[N-马来酰亚胺甲基]-环己烷-1-羧酸酯(sulfo-SMCC)活化的丝素蛋白(SF)反应得到。Traut,sReagent修饰PS上的伯胺产生巯基基团，并在巯基基团上添加短间隔末梢，保留被修饰的PS上伯胺的电荷。Sulfo-SMCC中的琥珀酰亚胺酯基团与丝素蛋白上的赖氨酸残基反应，转化成易反应的马来酰亚胺。在pH值为6.5～7.5时，马来酰亚胺与巯基化的鱼精蛋白反应形成稳定的硫醚结合，用鱼精蛋白对丝素蛋白进行阳离子化修饰，其反应机理为：。本发明是用鱼精蛋白对丝素蛋白进行阳离子化改性，利用柞蚕或天蚕丝素自身富含RGD序列及鱼精蛋白富含核定位短肽的特性，保证基因载体生物降解性的同时，提高载体的细胞膜靶向及细胞核定位功能。用阳离子化丝素蛋白包装、压缩DNA，作为基因传递载体，制备阳离子化丝素/基因复合物。该复合物能稳定转染细胞，有效提高基因对细胞的转染效率，不仅能解决基因治疗所面临的转染效率低的问题，而且阳离子化丝素载体无细胞毒性，可被生物降解。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：1.鱼精蛋白改性丝素蛋白的反应条件温和，方法简单，同时避免了丝素或鱼精蛋白自身的交联反应，提高了反应效率，产物单一，且原材料成本低廉，具有很好的推广性。2.鱼精蛋白阳离子化丝素基因载体可通过改变原材料的投料比控制反应的阳离子化改性程度，且产物具有良好生物相容性及生物降解性。3.柞蚕或天蚕丝素上RGD序列与细胞膜表面整合素特异性结合作用及鱼精蛋白的核定位功能，赋予该载体良好的细胞膜靶向性和细胞核定位双重功效。4.阳离子化丝素基因载体细胞毒性低，转染效率高，在针对其靶向细胞的体内外转染中均具有良好的应用前景。附图说明图1为不同质量比改性柞蚕丝素/DNA复合物的Zeta电位；图2为不同质量比改性柞蚕丝素/DNA复合物的琼脂糖凝胶电泳；图3为不同质量比改性柞蚕丝素/DNA复合物转染E.A细胞1天的细胞毒性；图4改性柞蚕丝素/DNA复合物转染E.A细胞1天的激光共聚焦照片。具体实施方式下面结合实施例和附图对本发明做进一步描述。实施例1鱼精蛋白阳离子化丝素的制备，具体步骤如下：(1)将100g柞蚕生丝放入5L质量浓度为0.25%的Na2CO3水溶液中，于98～100℃处理45min，重复3次，使蚕丝脱胶，充分洗涤干燥后得到柞蚕丝素纤维。将柞蚕丝素纤维加入熔融的四水合硝酸钙中，在105℃搅拌溶解。将所得到的混合溶液装入透析袋中(截留分子量为9～12KDa)，去离子水中透析4天，去除杂质得到纯的柞蚕丝素蛋白溶液。调节柞蚕丝素溶液浓度到20mg/ml，用0.22μm微孔滤膜过滤；(2)将sulfo-SMCC溶解在PBS溶液（磷酸盐缓冲液，pH=7.4）中，配置成浓度为1mg/ml的溶液。取1ml的sulfo-SMCC溶液缓慢滴加到20ml步骤(1)得到的丝素溶液中，4℃下磁力搅拌2h，用截留分子量为10kDa的超滤离心管以5000g离心力离心溶液，除去过量的sulfo-SMCC，得到活化的丝素溶液;(3)将硫酸鱼精蛋白溶解在含5mMEDTA的PBS（pH=7.4）溶液中，调节溶液浓度到10mg/ml，用0.22μm微孔滤膜过滤。将2mg的Trant’s试剂加入1ml的鱼精蛋白溶液中，缓慢磁力搅拌，调节pH=8，4℃反应2h，得到巯基化的鱼精蛋白；(4)将步骤(3)得到巯基化的鱼精蛋白与步骤(2)得到的活化的柞蚕丝素蛋白溶液混合，4℃下反应24h，去离子水中透析3天(截留分子量为9～12KDa)。然后用截留分子量为10kDa的超滤离心管在4℃，以5000g离心力离心溶液，得到经阳离子化改性的柞蚕丝素蛋白（AP），记作样品号为1。按本实施例上述的技术方案，改变柞蚕丝素和sulfo-SMCC的质量比，鱼精蛋白和Trant’s试剂的质量比，可以得到阳离子化程度不同的柞蚕丝素蛋白。参见表1，它是本实施例中按原料、质量比的不同得到的产物的等电点、表面电位的结果对比，其产物依次记作样品号为2～9。表1。实施例21、用煮沸的浓度为3.5‰的Na2CO3溶液处理天蚕茧3次，每次30min，使蚕丝脱胶，充分洗涤干燥后得到天蚕丝素纤维。将天蚕丝素纤维加入熔融的四水合硝酸钙中，在90℃搅拌溶解。将所得到的混合溶液装入透析袋中(截留分子量为9～12KDa)，用去离子水透析4天，去除杂质得到纯的天蚕丝素蛋白溶液。调节天蚕丝素溶液浓度为20mg/ml，用0.22μm微孔滤膜过滤；2、将sulfo-SMCC溶解在PBS溶液（pH=7.4）中，配置浓度为1mg/ml的溶液。取1ml的sulfo-SMCC溶液缓慢滴加到20ml步骤1得到的天蚕丝素溶液中，4℃下磁力搅拌2h，用截留分子量为10kDa的超滤离心管以5000g离心力离心溶液，除去过量的sulfo-SMCC，得到活化的天蚕丝素溶液;3、将硫酸鱼精蛋白溶解在含5mMEDTA的PBS（pH=7.4）溶液中，调节溶液浓度到10mg/ml，用0.22μm微孔滤膜过滤。将2mg的Trant’s试剂加入1ml的鱼精蛋白溶液中，磁力搅拌，调节pH=8，4℃下反应2h，得到巯基化的鱼精蛋白；4、将步骤3得到巯基化的鱼精蛋白与步骤2得到的活化的天蚕丝素溶液混合，4℃下反应24h，去离子水中透析3天(截留分子量为9～12KDa)。然后用截留分子量为10kDa的超滤离心管在4℃，以5000g离心力离心溶液，得到经阳离子化改性的天蚕丝素蛋白，记作样品号为10。按本实施上述技术方案，改变天蚕丝素和sulfo-SMCC的质量比，鱼精蛋白和Trant’s试剂的质量比可以得到不同阳离子化的天蚕丝素蛋白。表2为本实施例提供的不同原料、质量比得到产物的表面电位对比，其产物依次记作样品号为11～18。表2。实施例3阳离子化丝素/基因载体的制备，具体步骤如下：将本发明实施例1中得到的样品号为1的阳离子化柞蚕丝素溶液调节浓度到0.01mg/ml，用0.22μm微孔滤膜过滤，用无菌水将DNA浓度调节为0.01mg/ml。在2～8℃下用电动搅拌器以60rpm的速度对含4μg阳离子化丝素的丝素溶液进行缓慢搅拌，施加剪切作用力15min后，边搅拌边向其中滴加含2μg的DNA溶液，涡旋30s后升温至25℃，静置复合物溶液45min，通过静电作用自组装成阳离子化丝素/DNA复合物，记作样品19，阳离子化丝素与DNA的质量比为2:1。参照上述方法，对实施例1得到的样品号为2～9的样品分别以阳离子化丝素与DNA的质量比分别为3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1和10:1制备不同质量比的阳离子化丝素/DNA复合物，依次对应记作样品20～27。将样品号为19～27的样品制备的不同质量比的阳离子化丝素/DNA复合物稀释于1ml生理盐水后放入比色皿中，用马尔文激光粒度分析仪和Zeta电位仪测定复合物包裹DNA后的有效粒径和表面电位，分析阳离子化丝素与所包裹基因物质的质量比对复合物粒径、电位的影响。每个样品室温平衡120s，测试至少30次。结果如图1所示，阳离子化丝素/DNA复合物的表面Zeta电位随着阳离子化丝素与DNA质量比增加而由负值逐渐向正值转变，并最终稳定在+10mV左右。取10μl样品号为19～27不同质量比的阳离子化丝素/基因复合物溶液与2μl的10×loadingbuffer充分混合后加入1%的琼脂糖凝胶中，加入1×TEA电泳缓冲液,调节电压为120V，电泳时间20min。紫外灯下观察阳离子化丝素基因载体包裹DNA能力并拍照。图2所示，泳道1为maker，泳道2为裸DNA，泳道3～11为样品号19～27制备的阳离子化丝素/DNA复合物。裸DNA泳道出现典型的质粒条带，随着阳离子化丝素与DNA质量比的增加，阳离子化丝素对DNA的延滞能力明显增强。当阳离子化柞蚕丝素与DNA质量比大于4时能完全包裹住DNA，为阳离子化丝素/DNA复合物转染细胞提供了前提。实施例4阳离子化丝素/DNA复合物的体外细胞转染，包括以下步骤：(1)将E.A细胞以1×105细胞/孔的密度接种到6孔板上，用含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养细胞24h后，吸去培养基，用无血清的DMEM冲洗细胞2次。每孔加入不同质量比的阳离子化丝素/DNA复合物溶液，每孔含质粒DNA质量为2μg，阳离子化丝素与DNA质量比分别为5/1，7/1和10/1，用无血清的DMEM补足体积到500μl，轻轻混匀后滴加到细胞表面。37℃孵育4h后，吸去复合物溶液，用含10%FBS的DMEM培养基继续培养。(2)采用MTT法检测阳离子化丝素/DNA复合物的细胞毒性，以相同质量比的PEI/DNA复合物作为对照组。图3显示不同质量比的阳离子化丝素/DNA复合物，转染1d后细胞的存活率达到90%以上(AP/DNA=5/2为92.87士2.52%，AP/DNA=7/2为93.34士2.14%和AP/DNA=10/2为92.38士2.38%)，细胞毒性要远小于相同质量比的PEI/DNA复合物，且具有显著性差异(p<0.05)，说明阳离子化丝素基因载体具有较好的生物安全性。(3)采用激光共聚焦显微镜观察细胞转染丝素/DNA复合物1d后的荧光表达情况。图4表明阳离子化丝素能够成功介导质粒DNA转染E.A.细胞，并在细胞中表达绿色荧光蛋白。将细胞经胰酶消化收集后用PBS清洗两次，离心去除上清液，加入200μl的PBS溶液重悬细胞，流式细胞仪测定细胞转染效率高达20～25%。(4)采用经荧光标记的阳离子丝素/DNA复合物转染E.A.细胞后继续孵育6h，期间激光共聚焦显微镜每隔1h观察细胞对该载体的摄取情况，考察丝素上RGD对细胞摄取复合物的影响。细胞消化后，4%多聚甲醛固定，加入台盼兰淬灭细胞外荧光，流式细胞仪定量检测细胞摄取的量。用DAPI染细胞核15min，4%多聚甲醛固定后激光共聚焦显微镜动态追踪观测阳离子化丝素/DNA复合物在细胞中的核定位现象。