本发明涉及一种鉴定猪体长和/或体高的方法及其专用引物对,属于生物技术领域。
背景技术：
猪的体型一直是猪育种目标的重要组成部分，体型的大小不仅与生长速度及产肉量密切相关，对于配种也有较大的影响，因此其育种价值很高。但是，由于体长和体高等指标只能在动物长成之后才能测定，一方面加大了育种成本，另一方面拉长了世代间隔，遗传进展缓慢。分子生物技术的飞速发展和猪遗传连锁图谱的构建，为围绕体长和体高等数量性状开展的育种提供了研究基础。另一方面，由于猪是人类研究的一种重要的模式动物，因此，找到对猪的体型有影响的基因有可能对人类的研究提供一定的借鉴意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种鉴定猪体长和/或体高的方法及其专用引物对。本发明提供一种扩增含有g.14694A>G多态性位点的DNA片段的引物对；所述g.14694A>G多态性位点为GenBankAccessionNumber为GU565976.1的序列的自5’末端起第14694位；所述GenBankAccessionNumber为GU565976.1的序列的更新日为2010年4月26日。上述引物对中，所述引物对由SEQIDNo.1所示的DNA分子和SEQIDNo.2所示的DNA分子组成。一种鉴定或辅助鉴定猪的体长和/或体高大小的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含上述任一所述的引物对；所述试剂盒还包含使用说明书，说明书中记载内容如下：以待测猪的基因组DNA为模板，以上述任一所述的引物对为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，该PCR扩增产物含有GenBankAccessionNumber为GU565976.1的序列的自5’末端起第14694位碱基，如果该处碱基均为A，则所述猪的基因型为纯合AA基因型，如果该处碱基为A和G，则所述猪的基因型为杂合AG基因型，如果该处碱基均为G，则所述猪的基因型为纯合GG基因型；纯合AA基因型的猪的体长大于杂合AG基因型的猪的体长，杂合AG基因型的猪的体长大于纯合GG基因型的猪的体长；或，纯合AA基因型的猪的体高大于杂合AG基因型的猪的体高，杂合AG基因型的猪的体高大于纯合GG基因型的猪的体高。上述试剂盒中，所述猪为大民杂交猪，由大白猪和民猪杂交得到。一种鉴定或辅助鉴定猪的体长和/或体高大小的方法也属于本发明的保护范围，该方法如下：纯合AA基因型的猪的体长大于杂合AG基因型的猪的体长，杂合AG基因型的猪的体长大于纯合GG基因型的猪的体长；或，纯合AA基因型的猪的体高大于杂合AG基因型的猪的体高，杂合AG基因型的猪的体高大于纯合GG基因型的猪的体高；所述纯合AA基因型的猪为g.14694A>G多态性位点的碱基均为A的猪；所述杂合AG基因型的猪为g.14694A>G多态性位点的碱基为A和G的猪；所述纯合GG基因型的猪为g.14694A>G多态性位点的碱基均为G的猪；所述g.14694A>G多态性位点为GenBankAccessionNumber为GU565976.1的序列的自5’末端起第14694位；所述GenBankAccessionNumber为GU565976.1的序列的更新日为2010年4月26日。上述方法中，所述纯合AA基因型、杂合AG基因型或纯合GG基因型的判定方法如下：以猪的基因组DNA为模板，以上述任一所述的引物对为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，如果PCR扩增产物中含有的GenBankAccessionNumber为GU565976.1的序列的自5’末端起第14694位碱基均为A，则所述猪的基因型为纯合AA基因型，如果该处碱基为A和G，则所述猪的基因型为杂合AG基因型，如果该处碱基均为G，则所述猪的基因型为纯合GG基因型。上述任一所述的方法中，所述引物为上述引物对时，所述GenBankAccessionNumber为GU565976.1的序列的自5’末端起第14694位碱基位于所述PCR扩增产物的自5’末端起第230位。上述任一所述的方法中，所述猪为大民杂交猪，由大白猪和民猪杂交得到。上述任一所述的引物对、上述试剂盒和/或上述任一所述的方法在猪的选育中的应用也属于本发明的保护范围。上述应用中，所述猪为大民杂交猪，由大白猪和民猪杂交得到。本发明提供的方法是通过检测g.14694A>G位点的碱基判别猪个体的基因型，通过基因型进一步对猪的体高和体长性状进行选择，可使猪平均体长约提高10.34cm，体高约提高4.65cm，从而获得生产性能更高的猪。采用本发明提供的方法对猪进行育种，可对待选猪进行早期筛选，有效地缓解实际生产中选取优良种猪时间长的问题，降低了育种花费，能有效降低或提高实际生产中的猪的体型大小。本发明提供的方法操作简单、费用低、准确度高，并可实现自动化的直接检测，在猪的育种工作中将发挥巨大作用。附图说明图1为g.14694A>G位点附近序列的测序结果图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。大民杂交猪(Susscrofa)，由大白猪和民猪杂交获得，该猪购自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平畜禽实验基地。下述实施例中的GenBankAccessionNumber为GU565976.1的序列均是指更新日为2010年4月26日的GenBankAccessionNumber为GU565976.1的序列。实施例1、鉴定猪体长和/或体高的方法一、g.14694A>G多态性位点的确定(一)以两头大民杂交猪为实验材料，分别提取其耳缘组织的基因组DNA。(二)引物的设计与合成根据猪PPARD基因基因组DNA序列(GenBankAccessionNumber为GU565976.1)信息,设计并合成如下引物：U(上游引物)：5’-CAGACACCACACCAGAACTACC-3’(SEQIDNo.1)；D(下游引物)：5’-CGTGGCTGATGTGTTAGAGGAA-3’(SEQIDNo.2)。(三)PCR扩增分别以步骤(一)得到的大民杂交猪的基因组DNA为模板，以U和D为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，分别命名为产物1和产物2。PCR扩增体系：基因组DNA200ng，10×PCR扩增缓冲液5μl，dNTPs终浓度为10mM，上、下游引物各50ng，TaqDNA聚合酶0.75U，Mg2+2.5mmol/L，用ddH2O补足体系至50μl。PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。(四)测序及序列分析将产物1和产物2进行测序，得到产物1的序列(如SEQIDNo.3所示)和产物2的序列(如SEQIDNo.4所示)。SEQIDNo.3和SEQIDNo.4只存在一个碱基的差异，均为SEQIDNo.3和SEQIDNo.4中自5’末端起第230位。该处的碱基为G或A，如图1中箭头所示，该位点为GenBankAccessionNumber为GU565976.1序列的自5′末端起第14694位，因此将该位点命名为g.14694A>G。在GenBankAccessionNumber为GU565976.1的序列自5′末端第14694位的碱基(或步骤(三)得到的PCR扩增产物自5’末端起第230位的碱基)均为G的个体， 该个体为纯合型个体，将该个体的基因型命名为纯合GG基因型，在GenBankAccessionNumber为GU565976.1的序列自5′末端第14694位的碱基(或步骤(三)得到的PCR扩增产物自5’末端起第230位的碱基)均为A的个体，该个体为纯合型个体，将该个体的基因型命名为纯合AA基因型，在GenBankAccessionNumber为GU565976.1的序列自5′末端第14694位的碱基(或步骤(三)得到的PCR扩增产物自5’末端起第230位的碱基)为G和A的个体，该个体为杂合型个体，将该个体的基因型命名为杂合AG基因型。二、g.14694A>G多态性位点与猪体高及体长的相关性分析为确定g.14694A>G多态性位点与猪体长和体高性状是否相关，以601头大民杂交猪为实验材料，进行如下试验：(一)提取每头猪的耳缘组织的基因组DNA，分别按照步骤一中(三)的方法进行PCR扩增，得到各PCR扩增产物，按照步骤一中(四)的方法确定每头猪的基因型是纯合GG、杂合AG还是纯合AA。(二)测定并记录每头猪的体长与体高性状。结果如表1所示。表1表明，纯合AA基因型个体的体高大于杂合AG基因型个体的体高，杂合AG基因型个体的体高大于纯合GG基因型个体的体高。纯合AA基因型个体的体长大于杂合AG基因型个体的体长，杂合AG基因型个体的体长大于纯合GG基因型个体的体长。(三)对g.14694A>G位点与体长和体高性状以最小二乘法开展关联分析。具体方法可参见文献“ZhangL,WangL,LiY,LiW,YanH,LiuX,ZhaoK,WangL.AsubstitutionwithinerythropoietinreceptorgeneD1domainassociatedwithlittersizeinBeijingBlackpig,Susscrofa.AnimSciJ.2011；82(5):627-632”。所用模型如下：Y＝S+P+B+G+e其中Y为性状测定值，S为性别效应，P为胎次效应，B为屠宰批次效应，G为基因型效应，e为残差效应。结果如表1所示。表1猪突变位点g.14694A>G基因型与体长、体高相关性状的关联注：同列上标不同字母表示差异显著(P<0.05)表1表明，在体长与体高性状中，纯合AA基因型个体分别比纯合GG基因型个体在体长与体高性状方面高约10.34cm和4.65cm(P<0.05)。所以，在实际的猪育种中，为获得更长体长与更高体高性状的猪，最好选择纯合AA基因型个体的猪进行育种。