Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽及其抑制剂和单抗及其应用的制作方法与工艺

本发明属于医药领域，涉及Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽以及其在制备检测或治疗类风关(RA)滑膜细胞(FLS)增生、银屑病表皮细胞增生及炎症疾病的药物中的用途。

背景技术：
Cyr61(cysteine-rich61)，又称为CCN1，是一种由381个氨基酸残基的相对分子质量为42kDa的分泌蛋白，最早被克隆的Cyr61/CCN1是1985年Lau等在用血清或血小板衍生生长因子(PDGF)刺激小鼠BALB/c3T3成纤维细胞时发现的，因富含半胱氨酸(含10％的半胱氨酸残基)被命名为Cyr61/CCN1。Cyr61/CCN1具有明显的促有丝分裂活性和趋化性，可诱导成纤维细胞与表皮细胞增殖和分泌细胞外基质，参与调节细胞增生、分化、胚胎发育形成，是生命活动的基本蛋白。在抗原抗体的结合反应中，抗体参与结合的部位称抗体的对位(paratope)，而抗原(Cyr61/CCN1蛋白)参与结合的部位称为抗原的表位(epitope)。表位是蛋白质抗原性的基础。抗原表位(小分子肽段)的确定对于明确蛋白的作用位点即小分子肽段、进而设计采用该小分子肽段而模拟蛋白作用、或者设计能够模拟该肽段的小分子化合物用于代替蛋白或肽分子的作用、或者设计小分子化合物以阻断该蛋白作用具有重要意义，这也是当今国际上流行的新型药物的发展和制备方法之一。

技术实现要素：
本发明提供了Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，为GLECNFG。本发明还提供了Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽，其为如SEQIDNO.2所示的环状肽段，即在SEQIDNO.1的肽段的N端添加一个半胱氨基酸，从而构成如SEQIDNO.2所示的环状肽段“C-GLECNFG”。本发明的Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽是位于Cyr61/CCN1蛋白的第75-81位氨基酸，能够和特异性抗Cyr61/CCN1单抗093G9结合(KD为10-7)并在体内外中和Cyr61/CCN1功能，当N端添加一个C时可经人工合成为环状肽段“C-GLECNFG”。本发明中，Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽可通过蛋白酶水解制备得到，Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽还可以通过常规的固相多肽合成方法合成或基因工程技术制备得到。本发明中，根据基因库检索所得的人Cyr61/CCN1蛋白全长序列(GenBank：M_001554)，如SEQIDNO.3所示，为：其中，黑框中序列为Cyr61/CCN1蛋白的信号肽。本发明还提供了特异性抗Cyr61/CCN1单抗，所述特异性抗Cyr61/CCN1单抗能与本发明Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽结合。本发明还提供了Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽的抑制剂，其能与本发明Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽结合、能与GLECNFG环状结构结合、并能够阻断由此介导的生物学功能。本发明Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽的抑制剂，包括能够阻断Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽生物学功能的小分子化合物。较佳地，如本发明实施例所示的小分子化合物SC1-SC15。具体地，可以根据Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽的肽段构象表位能够设计具有模拟和抑制该肽段生物学功能的小分子化合物。能够阻断该多肽肽段的小分子化合物具有抑制Cyr61/CCN1分子病理生物学的作用，这对于进一步发展成为先导化合物及其在制备抗滑膜增生和骨破坏、抗Cyr61/CCN1高表达乳腺癌细胞增殖、抗表皮细胞过度增生以及抗纤维化(如肝纤维化)的药物均有重要用途。本发明抑制剂能够和GLECNFG环状结构相结合、并能够阻断由此介导的病理作用(包括致炎，致纤维母细胞增生、致Cyr61/CCN1高表达乳腺癌细胞增生与转移、致表皮细胞增生与活化等)。本发明之前的研究已经表明，IL-17能够上调Cyr61/CCN1的表达，而上调表达Cyr61/CCN1能够通过与滑膜细胞表明整合素受体AvB5结合后而促进滑膜细胞的过度增生，并可促进金属蛋白酶3和金属蛋白酶9的合成而参与软骨和骨破坏。本发明研究表明，Cyr61/CCN1蛋白能直接促进滑膜细胞产生IL-6，从而参与炎症发生发展。进一步地，本发明研究表明Cyr61/CCN1还能够促进人类表皮细胞增生，参与银屑病发生。本发明动物实验中还发现Cyr61/CCN1能够介导干燥综合征、增生型炎性肠病发生。本发明实验已经证实用抗Cyr61/CCN1单抗中和该蛋白表达可以抑制滑膜细胞增生和IL-6产生、减轻CIA模型中关节炎的临床症状和组织破坏与炎症；抑制表皮细胞增生，减轻银屑病样小鼠的皮肤增厚与鳞屑产生、缓解干燥综合征和增生型肠病动物模型的炎症和临床症状。本发明制备得到能够结合Cyr61/CCN1蛋白的单克隆抗体。这些抗体表现出功能的不同，其原因在于这些不同的单克隆抗体所结合的抗原表位，也就是Cyr61/CCN1蛋白的不同部位所造成的。本发明还提供了Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽在制备检测和/或治疗炎症性疾病药物中的应用。优选地，所述炎症性疾病包括风湿性疾病、类风湿性关节炎、银屑病。优选地，所述炎症性疾病包括干燥综合征。优选地，所述炎症性疾病包括增生型炎性肠病。本发明还提供了Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽在制备抗类风关滑膜细胞增生的药物中的应用。本发明的实施例表明，能够特异性中和这一抗原表位的单克隆抗体093G9在体内和体外可以抑制类风关及其动物模型的滑膜细胞增生抑制银屑病及其动物模型的表皮细胞增生、抑制干燥综合征动物模型的症状和炎症、抑制增生型炎性肠病动物模型的炎症和症状。本发明还提供了Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽在制备抑制乳腺癌细胞高表达的药物中的应用。本发明实施例表明，能够特异性中和Cyr61/CCN1蛋白抗原表位的单克隆抗体093G9在体内和体外可以抑制高表达Cyr61/CCN1蛋白的乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，在动物模型(体内)中可以抑制该类型的肿瘤生长和淋巴转移。本发明还提供了Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽在制备抗纤维化药物中的应用。本发明还提供了Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽在制备抗银屑病的药物中的应用。本发明实施例表明，能够特异性中和这一抗原表位的单克隆抗体093G9在体内和体外可以抑制表皮细胞增殖、银屑病样小鼠的皮肤增厚与鳞屑产生。本发明还提供了Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽的抑制剂在制备治疗风湿性疾病药物中的应用。对于本发明位于Cyr61/CCN1蛋白上的抗原表位进行功能分析表明，抗体093G9的识别肽段的环肽具有刺激类风关滑膜细胞体外增殖的作用，而对照抗体096B7的识别表位不具有这样的特性，如图1所示。将所获得的抗体识别表位用人工合成肽段，将这些肽段加入细胞培养中观察其生物学特性。结果发现某些肽段能够抑制滑膜细胞和Cyr61/CCN1高表达乳腺癌细胞株在体外增生，表明其具有模拟抗Cyr61/CCN1单抗的作用。因此，这些肽段及其能够与之结合的化合物小分子，均具有抑制Cyr61/CCN1蛋白的作用，具有制药的潜能。本发明有益效果还包括Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽在研究开发治疗类风湿关节炎、银屑病、干燥综合征、增生型炎性肠病的新药物中的应用。类风湿关节炎的发病率在中国高达0.4-1％；银屑病在中国人中的发病率高达0.3-0.5％，在白种人中的发病率更高(如美国发病率为1-3％；挪威发病率高达7％)，可见，本发明Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽及根据本表位发展的新药物将有广阔应用前景。本发明肽段GLECNFG(114，环肽为111)表位的意义：根据“TrendsBiochemSci.2008October；33(10)：461-473”报道序列：CCN家族分子序列的IGFBP区域的第75-81位氨基酸中均含有GLC这样三个保守氨基酸。上述中，涂色部分的7个氨基酸是这个家族分子(CCN1-6)的保守序列，但是，093G9只能和Cyr61/CCN1结合。虽然GLECNFG仅位于Cyr61/CCN1上，是093G9的特异性识别表位，但是其中保守的序列G-L-C在所有CCN家族中都有。根据093G9不与线肽GLECNFG结合、只与环肽*CGLECNFG结合的实验结果，提示虽然环肽C-G-L-C形成构象表位可能位于CCN家族分子中，但是GLECNFG是具有致病作用的特异性表位。本发明的表位的生物学意义包括：环肽111能够刺激RA患者滑膜细胞和Cyr61/CCN1高表达乳腺癌MDA-MB-231细胞的体外增殖，因此，该肽段是Cyr61/CCN1分子的特异性致病表位。单抗093G9能够特异性识别Cyr61/CCN1的肽段(IGFBP)中的表位，阻断这一表位的抗体093G9具有阻断Cyr61/CCN1致滑膜细胞、高表达乳腺癌MDA-MB-231细胞、其他纤维母细胞增殖的作用。根据这一肽段构象表位能够设计具有模拟和抑制该肽段生物学功能的化学小分子(SC)。其中，能够阻断该肽段化学小分子(SC)具有抑制Cyr61/CCN1分子病理生物学的作用。这对于进一步发展成为先导化合物及其在制备抗滑膜增生和骨破坏、抗Cyr61/CCN1高表达乳腺癌细胞增殖、以及抗纤维化(如肝纤维化)的药物中，有重要的用途。由于Cyr61/CCN1蛋白内富含半胱氨酸，容易形成二硫键，因此，采用基因工程方法表达十分困难，而该肽段容易进行人工合成，因此能够代替Cyr61/CCN1分子免疫以获得抗该功能表位的抗血清，或者制备相应单抗，用于进一步的临床检测和治疗中的应用。本发明旨在保护多肽111的序列、由该序列所可能产生的立体结构(包括线形结构和环状结构)，以及与其相结合并产生相同作用(如促进滑膜细胞增殖、免疫后产生抗体能够抑制胶原诱导关节炎(CIA)小鼠炎症作用等)或者直接抑制这些肽段功能的小分子化合物。附图说明图1表示本发明多肽的模拟构象示意图及化学结构，其中，(A)表示线性构象的多肽114；(B)表示环状构象的多肽111；(C)表示多肽111的化学结构。图2表示本发明多肽刺激RA滑膜细胞体外增值的实验结果。图3表示本发明多肽刺激MDA-MB-231细胞增殖作用的实验结果。图4表示本发明小分子化合物对肽段刺激的滑膜细胞增殖的抑制效果，其中，(A)表示15个化学小分子(SC1-15)分别对肽段111刺激的滑膜细胞增殖的明显抑制；(B)表示15个化学小分子(SC1-15)分别对Cyr61/CCN1蛋白刺激的滑膜细胞增殖的明显抑制。图5表示本发明小分子化合物对肽段刺激的乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖的抑制效果，其中，(A)表示15个化学小分子(SC1-15)对肽段111刺激的乳腺癌细胞株MDA-MB-231体外增殖的明显抑制；(B)表示15个化学小分子(SC1-15)分别对Cyr61/CCN1蛋白刺激的乳腺癌细胞株MDA-MB-231体外增殖的明显抑制。具体实施方式结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。实施例1本发明Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽的筛选本发明中，采用免疫印迹法筛选：采用了改进的传统测定抗原表位方法，即通过基因工程分段表达Cyr61/CCN1一系列的小肽段，然后用这2株抗体进行蛋白印迹(WesternBlot)杂交而筛选结合表位，从而得到能够和2株Cyr61/CCN1单抗结合的肽段。根据已有研究结果将Cyr61/CCN1蛋白分成约25个氨基酸片段长度的小肽段，然后设计引物将这些片段的基因克隆入大肠杆菌中，经表达测序正确后诱导表达，PAGE电泳后转至硝酸纤维膜上，然后分别用鼠抗人Cyr61/CCN1特异性单克隆抗体093G9(CGMCCNo.3351)和鼠抗人Cyr61/CCN1特异性单克隆抗体096B7(CGMCCNo.3299)进行杂交和显色，观察结合情况。能够结合则显色阳性，否则阴性。由此判断这两种抗体的结合表位。通过上述方法，筛选出抗体093G9结合的抗原表位位于Cyr61/CCN1的75-81位氨基酸的表位：Cyr61/CCN175-81GLECNFG。这一表位在Cyr61/CCN1序列中的位置(粗体字体标出的部位)：实施例2Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽的合成本实施例中，Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽合成是由上海强耀公司合成。基本原理全自动固相合成法。其基本过程如下：基于Fmoc化学合成，先将所要合成的目标多肽的C-端氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这一氨基酸的氨基作为多肽合成的起点，同其它的氨基酸已经活化的羧基作用形成肽键，不断重复这一过程，即可得到多肽。所合成的多肽纯化采用HPLC纯化，纯度达95％以上。根据筛选得到的结合表位，分别合成了线性和环状多肽，其中，所合成的多肽分别为：线性多肽(编号114)，其序列为GLECNFG；环状多肽(编号111)，其序列为CGLECNFG。实施例3Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽的构象与化学结构采用Cassion分子模拟计算机软件，将本发明Cyr61/CCN1蛋白抗原表位肽段在纯水溶液中进行拟合，以得到可能在体内的溶液环境中最为可能形成的构象，获得具有立体观察效果的分子结构。如图1(a)和(b)所示的Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽的立体构象，其中，图1(a)表示多肽114，为线性构象；图1(b)表示多肽111，为环状构象；图1(c)表示多肽111的化学结构。实施例4Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽刺激滑膜细胞体外增殖类风关滑膜细胞培养与增殖实验临床样本：研究中所有样本均来自于临床骨科行膝关节置换或滑膜切除术的RA患者，所有病例的诊断符合国际诊断标准。患者滑膜组织用于细胞的体外培养。本研究中所用临床样本，均对患者进行知情告知。滑膜细胞的制备及原代培养：将无菌获取滑膜组织，PBS清洗后用无菌手术剪刀剪切成约1mm×1mm×1mm的碎块；用2-3倍体积0.5mg/ml的胶原酶I或胶原酶II，37℃，消化2小时；经200目纱网过滤后，离心去上清后，将细胞重悬于DMEM培养液，置于培养皿中，37℃，5％CO2培养。之后待FLS生长成片＞80％时，消化传代。显微镜下观察，3-5代的RAFLS生长迅速，细胞形态趋向于长梭形，排列整齐，取向一致。用特异性淋巴细胞分化抗原如CD3，CD14，CD19，CD11C等标记后用流式细胞仪检测发现上述分子表达为阴性(＜2％CD1Ib，＜2％CD14+，＜1％CD3+，and＜5％CD19+)，表明所培养的细胞为均一的FLS，极少有淋巴细胞污染。滑膜细胞的增殖实验：取对数生长期的FLS，经0.25％的胰蛋白酶消化后调整细胞浓度1×104细胞/毫升，接种于96孔细胞培养板中，加入不同浓度的上述肽段(肽段终浓度为：2.5ug/ml，5.0ug/ml10ug/ml)。同时采用Cyr61/CCN1完整蛋白作为阳性对照(Proptech公司，美国，SanDiego)。也设培养液对照。将肽段或者纯Cyr61/CCN1蛋白与FLS共同培养，在培养结束前16个小时加入1μCi的3H(每孔)，收集细胞，β液闪仪检测增殖。II型胶原诱导小鼠关节炎(CIA)模型实验：肽段免疫预防CIA小鼠发生关节炎实验：将肽段与CFA完全混匀，DBA1小鼠背部皮下免疫3次：第一次：肽+CFA，第二次和第三次：肽+IFA(不完全佐剂)，免疫剂量：100ug肽/mouse，背部免疫2-3点，每次间隔1个月，第三次免疫后7天，尾部采血，用ELISA检测是否产生抗血清；同时用CII100ug加等量IFA免疫小鼠，观察小鼠的发病情况、发病速度和炎症强度。肽段治疗或者冲击CIA小鼠：即先制备CIA小鼠模型，待炎症达到4分时用肽段进行粘膜给药。方法：肽段2500ug/ml，10ul/mouse，终浓度为25ug/mouse/day。采用溶剂为阴性对照。将本发明Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽的上述肽段分别加入类风关原代培养的滑膜细胞中，于48小时后检测其对于滑膜细胞增殖的刺激能力，实验结果表明，肽段111能够明显刺激滑膜细胞增生，并呈剂量依赖性，如图2所示。这一实验结果表明，位于Cyr61/CCN1的75-81位置的肽段111，在水溶液中可能形成的环状构象能够模拟Cyr61/CCN1蛋白刺激滑膜细胞增殖的作用。实施例5Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽刺激Cyr61/CCN1高表达乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)体外增殖将1×104个MDA-MB-231细胞接种至96孔板中，然后加入不同浓度(2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml)的肽段，4小时后加入3H-TdR，继续孵育16小时，收集细胞，Beta闪烁仪检测c.p.m.值，用于判断细胞增殖状态。结果如图3所示，肽段111有明显的刺激细胞增殖作用。实施例6筛选得到与环肽111结合并抑制其活性的小分子化合物(SC1-15)根据肽段构象表位(环状多肽CGLECNFG，编号111)设计具有模拟和抑制该肽段生物学功能的化学小分子(SC)，其中，能够阻断该肽段化学小分子(SC)具有抑制Cyr61/CCN1分子病理生物学的作用。这对于进一步发展成为先导化合物及其在制备抗滑膜增生和骨破坏、抗Cyr61/CCN1高表达乳腺癌细胞增殖、以及抗纤维化(如肝纤维化)的药物中，有重要的用途。本发明采用开发新药中常用的虚拟筛选方法，通过计算法筛选出可能有治疗效用的化学分子。目前应用较为广泛的是对药物的标靶利用X-ray绕射或核磁共振(NMR)的实验，或运用生物信息结构预测的方法，得到标靶的三维高分辨率结构后，再进行虚拟筛选。本实施例中，药物虚拟筛选成功的要件包括：(1)足够大的化学空间(chemicalspace)，(2)准确的评分函数(scoringfunction)，(3)高效率的搜寻演算法(searchingalgorithm)。化学空间，即所用的化学数据库；广义来讲，化学空间则包括配体(ligand)和受体较可能存在的构形(conformation)；评分函数，其设计主要是从蛋白质结构数据库(ProteinDatabank，http://www.pdb.org)中寻找分辨率较好的配体与受体的结合体(complex)，运用能量的计算，加上诸如多变量线性回归(multivariatelinearregression)的统计方法，建立一个准确的数学函数，并可快速有效地推测未知的配体对一给定的受体是否可稳定地结合，甚至预测结合强度(bindingaffinity)或结合的自由能(bindingfreeenergy)。上述评分函数是根据配体分子相对于受体做平移(translation)、旋转(rotation)、或者是构形变化(conformationalchanges)时十分复杂的能量变化情形，寻找具有最佳评分值的结合模式。本实施例在对靶标环状多肽CGLECNFG(编号111)能有效模拟Cyr61/CCN1蛋白的生物学作用的研究基础上，筛选得到具有结构实体的靶向环肽111的先导化合物，这些小分子结构的化合物能与环肽111结合并抑制其活性。根据环状多肽111的化学结构，采用本方法筛选到能够和这一环状多肽结合的小分子化合物SC有15个，其结构和名称如下表1中所示的SC-1至SC-15化合物。这些小分子化合物SC的结构及合成方法均为现有技术。实施例7能与肽段111结合的化学小分子(SC)1-15在体外抑制由环肽111刺激滑膜细胞增殖的作用本实施例中临床样本、滑膜细胞制备及原代培养均与实施例4中所述相同。滑膜细胞的增殖实验：取对数生长期的FLS，经0.25％的胰蛋白酶消化后调整细胞浓度1×104细胞/毫升，接种于96孔细胞培养板中，分别加入10ug/ml的肽段111和2.5ug/ml的Cyr61/CCN1蛋白(Proptech公司，美国，SanDiego)。然后分别加入按实施例6方法筛选得到的10μM化学小分子SC-1～SC-15，详见下表1，共同培养48小时。在培养结束前16个小时加入1μCi的3H(每孔)，收集细胞，β液闪仪检测增殖，实验结果如图4所示，15个化学小分子(SC-1～SC-15)分别对肽段111(如图4A所示)和Cyr61/CCN1蛋白(如图4B所示)刺激的滑膜细胞增殖有明显抑制作用。实施例8能与肽段111结合的化学小分子1-15在体外抑制由环肽111和Cyr61/CCN1刺激乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖的作用将1×104个MDA-MB-231细胞接种至96孔板中，加入10ug/ml的肽段111和2.5ug/ml的Cyr61/CCN1蛋白(Proptech公司，美国，SanDiego)。然后分别加入按实施例6方法筛选得到的10μM化学小分子SC-1～SC-15，详见下表1，共同培养4小时后加入1μCi的3H(每孔)，继续孵育16小时，收集细胞，Beta闪烁仪检测c.p.m.值，用于判断细胞增殖状态。实验结果如图5所示，所述15个化学小分子(SC1-15)对肽段111(如图5A所示)和Cyr61/CCN1蛋白(如图5B所示)刺激的乳腺癌细胞株MDA-MB-231体外增殖有明显抑制作用。