一种快速鉴定烟草抗性基因的有效方法与流程

本发明属于抗性基因的功能鉴定领域，尤其涉及一种快速鉴定烟草抗性基因的有效方法。

背景技术：
本发明采用的农杆菌GV3101是属于根癌农杆菌，它能在自然条件下感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位，将其Ti质粒上的T-DNA转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌侵染植物伤口，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物基因组中，可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。这成为农杆菌介导植物转基因的理论基础，也是将目的基因导入植物细胞采用最多的方法。农杆菌Ti质粒转化系统与其它转化体系相比，具有许多突出的优点：①农杆菌Ti质粒转化系统的机理研究得最清楚，方法最成熟，应用也最广泛；②该转化系统是模仿或利用天然的转化载体体系，成功率高，效果好；③该转化系统转化的外源基因以单拷贝为多数，遗传稳定性好；④该转化系统操作比较容易，需要的仪器设备简单，易于推广。农杆菌浸润瞬时共表达方法是一个可靠的和灵活的工具来研究植物抗性基因和TMV复制酶基因相互作用诱导细胞产生防御反应，使植物获得系统抗性。农杆菌浸润法不仅在基因功能鉴定、蛋白质互作及基因沉默抑制子鉴定等研究方面得到广泛应用，目前还应用在小RNA的研究中。本发明首先将目的基因和病毒复制酶基因分别连接到双元表达载体，再导人农杆菌GV3101后浸润三生烟或本生烟。根据能否产生过敏性反应（HR）来判断其是否具有抗性，可以快速、稳定地对目的基因进行功能鉴定。

技术实现要素：
本发明的目的是提拱一种快速、简便、有效的在烟草叶片上瞬时共表达目的基因和TMV复制酶基因产生过敏性反应的抗性基因的鉴定方法。为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：一种快速鉴定烟草抗性基因的有效方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）、将含有目的基因和TMV复制酶基因的两个表达载体分别通过电击法导入农杆菌GV3101(pMP90)感受态细胞；（2）、加1mL左右SOC培养基或LB培养基，在28℃左右恒温培养箱中培养1h左右；（3）、将所得培养物涂布于含有25mg/mL左右卡那霉素和50mg/mL左右利福平的LB固体平板培养基上，在28℃左右过夜培养2晚；(4)、挑取单菌落于含有25mg/mL左右卡那霉素和50mg/mL左右利福平的5mLLB液体培养基中，在28℃左右的摇床上震荡培养1-2天至对数生长期，得过夜培养物；（5）、取0.3mL左右过夜培养物置于含50mg/mL左右卡那霉素、10mmol/L左右pH5.6的MES和20mmol/L左右乙酰丁香酮的5mL左右LB液体培养基中，28℃左右培养3-4h；（6）、在室温、3000rpm条件下将所得产物离心30min左右，沉淀物用含10mmol/L左右氯化镁、10mmol/L左右pH5.6的MES和150mmol/L左右乙酰丁香酮的5mL左右浸润缓冲液重悬至OD600约为0.5的农杆菌悬浊液；（7）、等体积两种农杆菌悬浊液混和在一起，放置室温下静置培养2-3h，得实验用农杆菌悬浊液；(8)、选用6-8周龄健壮烟草为材料，用针尖轻轻在叶片背腹面划一小口；(9)、用1mL无针注射器将实验用农杆菌悬浊液浸润到烟草叶片，在20-28℃光照培养箱中培养，进行抗性反应观察；(10)、如果出现过敏性反应，则表明该目的基因对其相应的病毒具有抗性；如果不出现过敏性反应，则说明其不具有抗性。所述的一种快速鉴定烟草抗性基因的有效方法，其特征在于：步骤（1)的电击法使用伯乐公司的电转化仪，其转化条件为0.1cm电击杯、输出25mF、电压1.8kV和抗性200W。所述的一种快速鉴定烟草抗性基因的有效方法，其特征在于：步骤（3）的培养基是常规的LB培养基，所加抗生素卡那霉素和利福平的浓度分别为25mg/mL和50mg/mL。所述的一种快速鉴定烟草抗性基因的有效方法，其特征在于：步骤（5）的培养基中含有50mg/mL卡那霉素、10mmol/LpH5.6MES和20mmol/L乙酰丁香酮。所述的一种快速鉴定烟草抗性基因的有效方法，其特征在于：步骤（6）的浸润缓冲液5mL中含有10mmol/L氯化镁、10mmol/LpH5.6MES和150mmol/L乙酰丁香酮，且最终OD600为0.5。所述的一种快速鉴定烟草抗性基因的有效方法，其特征在于：步骤（8）的含有目的基因和TMV复制酶基因的农杆菌悬浊液按1:1混和。所述的一种快速鉴定烟草抗性基因的有效方法，其特征在于：步骤（9）的农杆菌浸润法用1mL无针注射器将农杆菌悬浊液浸润到活体烟草叶片。所述的一种快速鉴定烟草抗性基因的有效方法，其特征在于：步骤（10）的抗性反应观察中，所述的过敏性反应（HR）指的是烟草感染部位局部的细胞死亡形成坏死斑。本发明的原理为：1、本发明的有益效果：本发明所用的农杆菌株系为GV3101(pMP90),属根癌农杆菌，在烟草的遗传转化中效果比较好。采用的转化方法是电击转化法，而不是常用的冻融法或热激法，使用伯乐公司的电转化仪，其转化参数为0.1cm电击杯、输出25mF、电压1.8kV和抗性200W，提高了转化效率；2、本发明所用的培养基是最常用的LB培养基，而不是较复杂的YEP或YEB培养基，且所加抗生素分别为25mg/mL卡那霉素和50mg/mL利福平，可以有效的杀死没有转化成功的农杆菌，节省了筛选时间；3、本发明使用了农杆菌的再培养过程，将处于对数生长期的农杆菌置于含50mg/mL卡那霉素、10mmol/LMES(pH5.6)和20mmol/L乙酰丁香酮的LB液体培养基中再培养3-4小时，提高农杆菌的浸染力；4、本发明所用的浸润缓冲液中含有10mmol/L氯化镁、10mmol/LMES(pH5.6)和150mmol/L乙酰丁香酮，且最终OD600约为0.5，提高的农杆菌共表达效果；5、本发明所用的浸润方法是用针尖轻轻在烟草叶片背腹面划一小口，然后用无针注射器将农杆菌混和悬浊液浸润到烟草叶片，提高浸润效率。这种方法操作简便，根据是否出现HR现象快速、有效地鉴定该基因是否对相应的病毒具有抗性。附图说明图1为农杆菌浸润法鉴定抗性基因的模式图。图2为在Nicotianatabacum叶片上农杆菌共浸润诱导HR。（左图为对照，右图为抗性基因与病毒复制酶基因互作引起过敏性反应。）图3为在Nicotianabenthamiana叶片上农杆菌共浸润诱导HR。（左图为对照，右图为抗性基因与病毒复制酶基因互作引起过敏性反应。）具体实施方式、一种快速鉴定烟草抗性基因的有效方法，包括以下步骤：（1）、将含有目的基因和TMV复制酶基因的两个表达载体分别通过电击法导入农杆菌GV3101(pMP90)感受态细胞；（2）、加1mLSOC培养基或LB培养基，在28℃恒温培养箱中培养1h；（3）、将培养物涂布于含25mg/mL卡那霉素和50mg/mL利福平的LB固体平板培养基上，在28℃下过夜培养2晚；(4)、挑取单菌落于含25mg/mL卡那霉素和50mg/mL利福平的5mLLB液体培养基中，在28℃摇床上震荡培养1-2天至对数生长期；（5）、取0.3mL过夜培养物置于含50mg/mL卡那霉素、10mmol/LMES(pH5.6)和20mmol/L乙酰丁香酮的5mLLB液体培养基中，28℃培养4h；（6）、在室温、3000rpm条件下离心30min，沉淀物用含10mmol/L氯化镁、10mmol/LMES(pH5.6)和150mmol/L乙酰丁香酮的5mL浸润缓冲液重悬至OD600约为0.5；（7）、等体积两种农杆菌悬浊液混和在一起，放置室温下静置培养2h；(8)、选用7周龄健壮烟草为材料，用针尖轻轻在叶片背腹面划一小口，便于悬浊液浸入叶片；(9)、用1mL无针注射器将农杆菌悬浊液浸润到烟草叶片，在25℃光照培养箱中培养，观察过敏性反应（HR）；(10)、如果出现HR，则表明该目的基因对其相应的病毒具有抗性；如果不出现HR，则说明其不具有抗性。