一种合成双核苷四磷酸以及P2,P3-（双卤代）亚甲基双核苷四磷酸的方法与流程

本发明属于化学合成领域，涉及天然产物类生化试剂的化学制备技术领域，具体涉及一系列双核苷四磷酸以及P2,P3-亚甲基双核苷四磷酸的新型化学合成方法。技术背景双核苷四磷酸（dinucleosidetetraphosphates，Np4N’s）是由两个核苷通过四个磷酸基团连接而成一类特殊的生物分子。该类化合物广泛存在于动物细胞内，参与血小板聚集、神经传递、调节血管舒张和收缩、以及细胞增殖等重要的生命活动。例如，双腺苷四磷酸（Ap4A）可以控制肠系膜血管以及肾血管的舒张和收缩，在临床中被用来降低血压。尿苷腺苷四磷酸（Up4A）是从内覆组织中通过刺激因素而被释放对心血管系统的调节起到了重要作用。双鸟苷四磷酸（Gp4G）和腺苷鸟苷四磷酸（Ap4G）是刺激血管平滑肌细胞的生长因子。另外，双尿苷四磷酸（Up4U）已经作为一种药物用来治疗干眼综合症。虽然双核苷四磷酸具有一定的稳定性，但是多磷酸键仍然容易降解。因此，使用稳定的P-CX2-P（X=H,F,Cl）结构取代双核苷四磷酸中的P-O-P结构可以大幅度提高双核苷四磷酸的药物代谢动力学性质。目前，文献报道的双核苷四磷酸以及P2,P3-（双卤代）亚甲基双核苷四磷酸的化学合成方法主要有以下几种。其中应用最广的是以核苷单磷酸和核苷三磷酸为原料，在缩合试剂羰基二咪唑（CDI）或二环己基碳二亚胺（DCC）的作用下反应得到双核苷四磷酸的方法。另一种主要的方法是利用核苷磷酰吗啉前体与核苷三磷酸缩合得到双核苷四磷酸。但是，以上方法产率较低（通常低于30%），反应时间长（通常需要1至2天）。因此，为双核苷四磷酸以及P2,P3-（双卤代）亚甲基双核苷四磷酸建立一种高效的合成方法对研究其生物学功能和相关的药物开发具有重要意义。

技术实现要素：
本发明的目的是为一系列双核苷四磷酸和P2,P3-（双卤代）亚甲基双核苷四磷酸的化学合成提供一种新颖、实用和高效的方法。如图1所示，本发明涉及的双核苷四磷酸合成方法以核苷磷酰哌啶（1-3）为核苷磷酰供体，核苷三磷酸（4-6）为核苷磷酰受体，以4,5-二氰基咪唑（DCI）为活化试剂，在大极性非质子化溶剂中反应。粗产物经过离子交换色谱纯化得到双核苷四磷酸（7-11），产率为35-46%。在本方法中，将核苷磷酰哌啶与核苷三磷酸的摩尔比为1：0.5至1：0.4；核苷磷酰哌啶与4,5-二氰基咪唑（DCI）的摩尔比为1：2.5至1：3.0；反应溶剂可使用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）或N-甲基吡咯烷酮（NMP），反应温度为20℃，反应时间30至32小时。后处理过程中，直接乙醚沉淀或者浓缩反应溶剂再经乙醇沉淀得到的粗产物，再经离子交换柱层析（DEAE-A25）得双核苷四磷酸三乙胺盐。最后，经过钠型732阳离子交换树酯后得到五种双核苷四磷酸四钠盐7-11。如图2所示，本发明涉及的合成方法是以核苷磷酰哌啶（1-3）为核苷磷酰供体，b,g-（双卤代）亚甲基核苷三磷酸（12-16）为核苷磷酰受体，以4,5-二氰基咪唑（DCI）为活化试剂，在大极性非质子化溶剂中反应。粗产物经过离子交换色谱纯化得到双核苷四磷酸（17-23），产率为54-66%。在本方法中，核苷磷酰哌啶与b,g-（双卤代）亚甲基核苷三磷酸的摩尔比为1：0.5至1：0.4之间；核苷磷酰哌啶与4,5-二氰基咪唑（DCI）的摩尔比为1：2.5至1：3.0；反应溶剂为干燥NMP；反应温度为20℃，反应时间为8小时至36小时。后处理过程中，直接乙醚沉淀得到的粗产物，再经离子交换柱层析（DEAE-A25）得P2,P3-（双卤代）亚甲基双核苷四磷酸三乙胺盐。最后，经过钠型732阳离子交换树酯后得到P2,P3-（双卤代）亚甲基双核苷四磷酸四钠盐（17-23）。与以往文献报道的方法相比，本发明专利使用的核苷磷酰哌啶原料简单易得，在活化试剂—4,5-二氰基咪唑的作用下，偶联反应速度快，副产物少，产率高，产物易分离，优于以往文献报道的方法。附图说明图1.双核苷四磷酸新型合成方法图2.P2,P3-（双卤代）亚甲基双核苷四磷酸的合成方法。具体实施方式实施例1:P1,P4-双尿苷-5′,5′-四磷酸四钠盐（7）的合成：将尿苷磷酰哌啶三乙胺盐（1，98mg，0.2mmol），尿苷三磷酸三正丁胺盐（4，98mg，0.1mmol）以及4,5-二氰基咪唑（71mg，0.6mmol）在25mL圆底烧瓶中真空干燥2小时。氩气保护下，加入3.0mL干燥DMF，20℃条件下反应30小时。减压浓缩反应液，加入醋酸钠水溶液（3.0M，1.0mL）和30mL乙醇溶液沉淀离心后得到粗品。用去离子水溶解后，葡聚糖凝胶（DEAE-A25）离子交换柱层析得产物三乙胺盐，再经过钠型732阳离子交换树酯后得到P1,P4-双尿苷-5′,5′-四磷酸四钠盐白色固体37mg，产率42%。实施例2:P1,P4-双腺苷-5′,5′-四磷酸四钠盐（9）的合成：将腺苷磷酰哌啶三乙胺盐（2，129mg，0.25mmol），腺苷三磷酸三正丁胺盐（5，119mg，0.1mmol）以及4,5-二氰基咪唑（83mg，0.7mmol）在25mL圆底烧瓶中真空干燥2小时。氩气保护下，加入4.0mL干燥NMP，20℃条件下反应32小时。加入30mL乙醚溶液沉淀离心后得到粗品。用去离子水溶解后，葡聚糖凝胶（DEAE-A25）离子交换柱层析得产物三乙胺盐，再经过钠型732阳离子交换树酯后得到P1,P4-双腺苷-5′,5′-四磷酸四钠盐白色固体37mg，产率40%。实施例3:P1-腺苷-5′-P4-鸟苷-5′-四磷酸四钠盐（11）的合成：将鸟苷磷酰哌啶三乙胺盐（3，129mg，0.25mmol），腺苷三磷酸三正丁胺盐（5，119mg，0.1mmol）以及4,5-二氰基咪唑（83mg，0.7mmol）在25mL圆底烧瓶中真空干燥2小时。氩气保护下，加入4.0mL干燥NMP，20℃条件下反应32小时。加入30mL乙醚溶液沉淀离心后得到粗品。用去离子水溶解后，葡聚糖凝胶（DEAE-A25）离子交换柱层析得产物三乙胺盐，再经过钠型732阳离子交换树酯后得到P1-腺苷-5′-P4-鸟苷-5′-四磷酸四钠盐白色固体33mg，产率35%。实施例4:P1,P4-双尿苷-5′,5′-P2,P3-亚甲基四磷酸四钠盐（17）的合成：将尿苷磷酰哌啶三乙铵盐（1，98mg，0.2mmol）、尿苷5′-β’γ-亚甲基三磷酸三乙胺盐（12，78mg，0.1mmol）以及4,5–二氰基咪唑（71mg，0.6mmol）在25mL圆底烧瓶中真空干燥2小时。氩气保护下，加入4.0mL干燥NMP，20℃条件下反应8小时。加入30mL乙醚溶液沉淀离心后得到粗品。用去离子水溶解后，葡聚糖凝胶（DEAE-A25）离子交换柱层析得产物三乙胺盐，再经过钠型732阳离子交换树酯后得到P1,P4-双尿苷-5′,5′-P2,P3-亚甲基四磷酸四钠盐白色固体50mg，产率57%。实施例5:P1,P4-双尿苷-5′,5′-P2,P3-双氯亚甲基四磷酸四钠盐（19）合成：将尿苷磷酰哌啶三乙铵盐（1，108mg，0.22mmol）、尿苷5′-β’γ-双氯亚甲基三磷酸三正丁胺盐（14，110mg，0.1mmol）以及4,5-二氰基咪唑（76mg，0.64mmol）在25mL圆底烧瓶中真空干燥2小时。氩气保护下，加入4.0mL干燥NMP，20℃条件下反应10小时。加入30mL乙醚溶液沉淀离心后得到粗品。用去离子水溶解后，葡聚糖凝胶（DEAE-A25）离子交换柱层析得产物三乙胺盐，再经过钠型732阳离子交换树酯后得到P1,P4-双尿苷-5′,5′-P2,P3-双氯亚甲基四磷酸四钠盐白色固体58mg，产率62%。实施例6:P1,P4-双腺苷-5′,5′-P2,P3-双氟亚甲基四磷酸四钠盐（21）合成：将腺苷磷酰哌啶三乙铵盐（2，124mg，0.24mmol）、腺苷5′-β’γ-双氟亚甲基三磷酸三乙胺盐（16，84mg，0.1mmol）以及4,5-二氰基咪唑（80mg，0.68mmol）在25mL圆底烧瓶中真空干燥2小时。氩气保护下，加入4.0mL干燥NMP，20℃条件下反应36小时。加入30mL乙醚溶液沉淀离心后得到粗品。用去离子水溶解后，葡聚糖凝胶（DEAE-A25）离子交换柱层析得产物三乙胺盐，再经过钠型732阳离子交换树酯后得到P1,P4-双腺苷-5′,5′-P2,P3-双氟亚甲基四磷酸四钠盐白色固体54mg，产率56%。