肺组织降解提取肝素新工艺的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种肺组织降解提取肝素新工艺，包括以下步骤：将原料猪肺，牛肺去脂肪和支气管后，捣碎，通过配制复合酶制剂，再加入辅酶成分制得活化酶使用液，酶解猪肺，牛肺。能将猪肺和牛肺组织酶解成水溶性成分。由于降解条件温和，充分保留了猪肺和牛肺中的活性成分，更利于其肝素，蛋白质，多肽等成分的分离。
【专利说明】肺组织降解提取肝素新工艺
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程领域，涉及一种生物组织的降解方法，具体涉及一种肺组织降解提取肝素新工艺。
【背景技术】
[0002]猪肺和牛肺中含有抗凝血成分——肝素。肝素是一种由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成的黏多糖硫酸脂，平均分子量为15KD，呈强酸性。肝素在组织中可与蛋白质结合。国内外一般采取单一蛋白酶降解法，此法仅能部分降解猪肺和牛肺组织，使得原料中肝素，多肽，蛋白质活性成分在后续常规分离中收率降低，提取的肝素钠效价在10-30IU/MG范围，规模生产可能性减小。另外，也有研究者采取较激烈的强酸强碱分离手段，此手段较多破坏了其中的活性成分。
【发明内容】
[0003]本发明为了解决猪肺和牛肺充分降解，同时又不破坏其生理活性成分的问题，提供了一种条件温和的生物降解方法。
[0004]解决上述技术问题的技术方案为:
[0005]首先，进行原料处理:取适量新鲜猪肺和牛肺，去脂肪和支气管，清水浸60分钟，清水洗去红细胞,捣碎成糊状。
[0006]进一步地，酶解:取糊状肺浆，加4?8倍盐水，盐水浓度为1.8% -3.8%，升温至40±2°C，调PH8.0?9.0，加活化酶使用液总量的一半，搅匀，缓慢升温至58±2°C，酶解I小时，加入0.6%。?1%。的十二烷基磺酸钠(SDS)，缓慢搅拌，再加入剩余活化酶使用液，酶解2小时，至体系无固体物。酶解过程中维持酶解温度58±2°C，pH8.5?9.0。
[0007]其中，活化酶使用液的配制方法如下:
[0008]a)按重量百分比称取碱性蛋白酶粉3?5%、果胶酶粉3?5%、纤维素酶粉15?40%、淀粉酶15?20%、木聚糖酶15?20%、β -葡聚糖酶15?20%混合均匀；
[0009]b)按重量百分比取鱼腥草25%、蒲公英16%、丹参4%、野菊花4%、五味子5%、夏枯草15%、海藻5%、海带5%、甘草6%、车前草15%加入至500ml去离子水中，煎煮60分钟后再加入300ml去离子水煎煮30分钟，取上清液；
[0010]c)将步骤b)所得的上清液加入步骤a)所得的混合酶中，搅拌均匀制得复合酶；
[0011]d)取总质量为新鲜猪肺和牛肺总质量的2%。?6%。的复合酶，调pH值在8.5?9.0之间，再加入浓度为75%的食用酒精和辅酶成分，食用酒精的体积比达到6%?10%，辅酶成分质量比达到0.6%。?1%。，搅匀，静置3小时；配制成活化酶使用液。
[0012]进一步地，吸附:将酶解液升温至85?90°C，保温30分钟，80目尼龙网过滤。降温至58?60°C，盐度1.8?2.0,0.5%阴离子交换树脂吸附8小时。
[0013]进一步地，洗脱:共3次，时间分别为5小时，3小时，2小时。洗脱液的浓度分别为:18°?20。盐水，21°?22。盐水，22°?24。盐水，第三次盐水洗脱后，配成24。?25。盐水回收，可供下次第一次洗脱用。
[0014]进一步地，沉淀:集中第一次洗脱液和第二次洗脱液，用85°?88°食用酒精，力口至酒精度为38°?40°，沉淀24小时。
[0015]更进一步地，脱水干燥:用虹吸法弃去上清液，收集沉淀物，用95%酒精，脱水两次，每次酒精的使用量为沉淀物的2?3倍，处理时间不超过30分钟。挥干酒精，干燥得肝素粗品。
[0016]采用了上述方案，由于酶解过程中维持酶解温度58±2°C，pH8.5?9.0，条件温和，在不破坏生理活性成分的情况下，解决了猪肺和牛肺等动物肺组织完全降解的问题，提高了肺组织中肝素、蛋白质多肽等生物活性成分的提取和分离效率，使以猪肺、牛肺等动物肺组织作为原料规模化生产肝素、蛋白质多肽等生物活性成分的成本大大降低，收益率显著提高。并且充分保留了肺组织中的生理活性成分，提取的肝素钠效价较单一蛋白酶降解法显著提高，一次提取出的肝素钠效价大于60IU/MG。
【具体实施方式】
[0017]下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0018]实施例1
[0019]首先，进行原料处理:取I份新鲜猪肺和牛肺，去脂肪和支气管，清水浸60分钟，清水洗去红细胞,捣碎成糊状。
[0020]进一步地，酶解:取糊状肺浆，加4倍盐水，盐水浓度为1.8%?3.8%，升温至40±2°C，调pH8.0?9.0，加活化酶使用液总量的一半，搅匀，缓慢升温至58±2°C，酶解I小时，加入0.6%。的十二烷基磺酸钠(SDS)，缓慢搅拌，再加入剩余活化酶使用液，酶解2小时，至体系无固体物。酶解过程中维持酶解温度58±2°C，pH8.5?9.0。
[0021]其中，活化酶使用液的配制方法如下:a)按重量百分比称取碱性蛋白酶粉3%、果胶酶粉3%、纤维素酶粉34%、淀粉酶20%、木聚糖酶20%、β -葡聚糖酶20%混合均匀；
[0022]b)按重量百分比取鱼腥草25%、蒲公英16%、丹参4%、野菊花4%、五味子5%、夏枯草15%、海藻5%、海带5%、甘草6%、车前草15%加入至500ml去离子水中，煎煮60分钟后再加入300ml去离子水煎煮30分钟，取上清液；
[0023]c)将步骤b)所得的上清液加入步骤a)所得的混合酶中，搅拌均匀制得复合酶；
[0024]d)取总质量为新鲜猪肺和牛肺总质量的2%。?6%。的复合酶，调pH值在8.5?9.0之间，再加入浓度为75%的食用酒精和辅酶成分，食用酒精的体积比达到6%?10%，辅酶成分质量比达到0.6%。?1%。，搅匀，静置3小时；配制成活化酶使用液。
[0025]进一步地，吸附:将酶解液升温至85?90°C，保温30分钟，80目尼龙网过滤。降温至58?60°C，盐度1.8?2.0,0.5%阴离子交换树脂吸附8小时。
[0026]进一步地，洗脱:共3次，时间分别为5小时，3小时，2小时。洗脱液的浓度分别为:18°?20。盐水，21°?22。盐水，22°?24。盐水，第三次盐水洗脱后，配成24。?25°盐水回收，可供下次第一次洗脱用。
[0027]进一步地，沉淀:集中第一次洗脱液和第二次洗脱液，用85°?88°食用酒精，力口至酒精度为38°?40°，沉淀24小时。
[0028]更进一步地，脱水干燥:用虹吸法弃去上清液，收集沉淀物，用95%酒精，脱水两次，每次酒精的使用量为沉淀物的2?3倍，处理时间不超过30分钟。挥干酒精，干燥得肝素粗品。
[0029]实施例2
[0030]首先，进行原料处理:取I份新鲜猪肺和牛肺，去脂肪和支气管，清水浸60分钟，清水洗去红细胞,捣碎成糊状。
[0031]进一步地，酶解:取糊状肺浆，加8倍盐水，盐水浓度为1.8%?3.8%，升温至40±2°C，调PH8.0?9.0，加活化酶使用液总量的一半，搅匀，缓慢升温至58±2°C，酶解I小时，加入1%。的十二烷基磺酸钠(SDS)，缓慢搅拌，再加入剩余活化酶使用液，酶解2小时，至体系无固体物。酶解过程中维持酶解温度58±2°C，pH8.5?9.0。
[0032]其中，活化酶使用液的配制方法如下:
[0033]a)按重量百分比称取碱性蛋白酶粉5%、果胶酶粉5%、纤维素酶粉40%、淀粉酶15%、木聚糖酶15%、β-葡聚糖酶20%混合均匀；
[0034]b)按重量百分比取鱼腥草25%、蒲公英16%、丹参4%、野菊花4%、五味子5%、夏枯草15%、海藻5%、海带5%、甘草6%、车前草15%加入至500ml去离子水中，煎煮60分钟后再加入300ml去离子水煎煮30分钟，取上清液；
[0035]c)将步骤b)所得的上清液加入步骤a)所得的混合酶中，搅拌均匀制得复合酶；
[0036]d)取总质量为新鲜猪肺和牛肺总质量的2%。?6%。的复合酶，调pH值在8.5?9.0之间，再加入浓度为75%的食用酒精和辅酶成分，食用酒精的体积比达到6%?10%，辅酶成分质量比达到0.6%。?1%。，搅匀，静置3小时；配制成活化酶使用液。
[0037]进一步地，吸附:将酶解液升温至85?90°C，保温30分钟，80目尼龙网过滤。降温至58?60°C，盐度1.8?2.0,0.5%阴离子交换树脂吸附8小时。
[0038]进一步地，洗脱:共3次，时间分别为5小时，3小时，2小时。洗脱液的浓度分别为:18°?20。盐水，21°?22。盐水，22°?24。盐水，第三次盐水洗脱后，配成24。?25°盐水回收，可供下次第一次洗脱用。
[0039]进一步地，沉淀:集中第一次洗脱液和第二次洗脱液，用85°?88°食用酒精，力口至酒精度为38°?40°，沉淀24小时。
[0040]更进一步地，脱水干燥:用虹吸法弃去上清液，收集沉淀物，用95%酒精，脱水两次，每次酒精的使用量为沉淀物的2?3倍，处理时间不超过30分钟。挥干酒精，干燥得肝素粗品。
[0041]实施例3
[0042]首先，进行原料处理:取I份新鲜猪肺和牛肺，去脂肪和支气管，清水浸60分钟，清水洗去红细胞,捣碎成糊状。
[0043]进一步地，酶解:取糊状肺浆，加6倍盐水，盐水浓度为1.8%?3.8%，升温至40±2°C，调PH8.0?9.0，加活化酶使用液总量的一半，搅匀，缓慢升温至58±2°C，酶解I小时，加入0.8%。的十二烷基磺酸钠(SDS)，缓慢搅拌，再加入剩余活化酶使用液，酶解2小时，至体系无固体物。酶解过程中维持酶解温度58±2°C，pH8.5?9.0。
[0044]其中，活化酶使用液的配制方法如下:
[0045]a)按重量百分比称取碱性蛋白酶粉3%、果胶酶粉5%、纤维素酶粉40%、淀粉酶17%、木聚糖酶20%、β-葡聚糖酶15%混合均匀；
[0046]b)按重量百分比取鱼腥草25%、蒲公英16%、丹参4%、野菊花4%、五味子5%、夏枯草15%、海藻5%、海带5%、甘草6%、车前草15%加入至500ml去离子水中，煎煮60分钟后再加入300ml去离子水煎煮30分钟，取上清液；
[0047]c)将步骤b)所得的上清液加入步骤a)所得的混合酶中，搅拌均匀制得复合酶；
[0048]d)取总质量为新鲜猪肺和牛肺总质量的2%。?6%。的复合酶，调pH值在8.5?9.0之间，再加入浓度为75%的食用酒精和辅酶成分，食用酒精的体积比达到6%?10%，辅酶成分质量比达到0.6%。?1%。，搅匀，静置3小时；配制成活化酶使用液。
[0049]进一步地，吸附:将酶解液升温至85?90°C，保温30分钟，80目尼龙网过滤。降温至58?60°C，盐度1.8?2.0,0.5%阴离子交换树脂吸附8小时。
[0050]进一步地，洗脱:共3次，时间分别为5小时，3小时，2小时。洗脱液的浓度分别为:18°?20。盐水，21°?22。盐水，22°?24。盐水，第三次盐水洗脱后，配成24。?25°盐水回收，可供下次第一次洗脱用。
[0051]进一步地，沉淀:集中第一次洗脱液和第二次沈脱液，用85°?88°食用酒精，力口至酒精度为38°?40°，沉淀24小时。
[0052]更进一步地，脱水干燥:用虹吸法弃去上清液，收集沉淀物，用95%酒精，脱水两次，每次酒精的使用量为沉淀物的2?3倍5处理时间不超过30分钟。挥干酒精，干燥得肝素粗品。
[0053]采用了上述方案，由于酶解过程中维持酶解温度58±2°C，pH8.5?9.0，条件温和，在不破坏生理活性成分的情况下，解决了猪肺和牛肺等动物肺组织完全降解的问题，提高了肺组织中肝素、蛋白质多肽等生物活性成分的提取和分离效率，使以猪肺、牛肺等动物肺组织作为原料规模化生产肝素、蛋白质多肽等生物活性成分的成本大大降低，收益率显著提高。并且充分保留了肺组织中的生理活性成分，提取的肝素钠效价较单一蛋白酶降解法显著提高，一次提取出的肝素钠效价大于60IU/MG。
【权利要求】
1.肺组织降解提取肝素新工艺，其特征在于，包括以下步骤: (1)原料处理:取适量新鲜猪肺和牛肺，去脂肪和支气管，清水浸泡60分钟，清水洗去红细胞之后捣碎成糊状； (2)活化酶使用液的配制: a)按重量百分比称取碱性蛋白酶粉3?5%、果胶酶粉3?5%、纤维素酶粉15?40%、淀粉酶15?20%、木聚糖酶15?20%、β -葡聚糖酶15?20%混合均匀； b)按重量百分比取鱼腥草25%、蒲公英16%、丹参4%、野菊花4%、五味子5%、夏枯草15%、海藻5%、海带5%、甘草6%、车前草15%加入至500ml去离子水中，煎煮60分钟后再加入300ml去离子水煎煮30分钟，取上清液； c)将步骤b)所得的上清液加入步骤a)所得的混合酶中，搅拌均匀制得复合酶； d)取总质量为上述步骤(I)所述的新鲜猪肺和牛肺总质量的2%。?6%。的复合酶，调PH值在8.5?9.0之间，再加入浓度为75%的食用酒精和辅酶成分，食用酒精的体积比达到6%~ 10%,辅酶成分质量比达至Ij 0.6%。?1%。，搅勻，静置3小时； (3)酶解:取上述步骤(I)所得的糊状肺浆，按照质量分数1:5的比例加入盐水，所述的盐水浓度为1.8%?3.8%，升温至38?42V’调节pH在8.0?9.0之间，加入上述步骤(2)制得的活化酶液总量的一半，搅匀，缓慢升温至56?60°C，酶解I小时，加入辅酶成分，缓慢搅拌，再加入剩余活化酶使用液，酶解2小时，至体系无固体物； (4)吸附:将上述步骤(3)得到的酶解液升温至85?90°C，保温30分钟，用80目尼龙网对其进行过滤，然后将滤液降温至58?60°C，调节盐度至1.8?2.0,0.5%阴离子交换树脂吸附8小时； (5)洗脱:将上述步骤(4)得到的酶解液用盐水洗脱数次得洗脱液； (6)沉淀:收集上述步骤(5)所得的洗脱液，用85°?88°食用酒精，加至酒精度为38°?40°，沉淀24小时； (7)脱水干燥:用虹吸法弃去上清液，收集沉淀物，用95%的酒精，脱水两次，每次酒精的使用量为沉淀物的2?3倍，处理时间不超过30分钟，待挥干酒精，干燥得肝素粗品。
2.根据权利要求1所述的肺组织降解提取肝素新工艺，其特征在于:步骤(2)和步骤(3)中所述的辅酶成分为:十二烷基磺酸钠(SDS)。
3.根据权利要求2所述的肺组织降解提取肝素新工艺，其特征在于:所述的十二烷基硫酸钠(SDS)的加入量为总量的0.5?1.5%0。
4.根据权利要求1所述的肺组织降解提取肝素新工艺，其特征在于:酶解过程中均维持酶解温度56?60°C，pH8.5?9.0。
5.根据权利要求1所述的肺组织降解提取肝素新工艺，其特征在于:步骤(5)中所述的洗脱次数为三次，时间分别为5小时，3小时，2小时，所述的盐水的浓度分别为18°?20°盐水，21°?22°盐水，22°?24°盐水。
6.根据权利要求1所述的肺组织降解提取肝素新工艺，其特征在于:步骤￠)中所述的洗脱液包括第一次洗脱液和第二次洗脱液。
【文档编号】C08B37/10GK104231115SQ201410554321
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年10月20日 优先权日:2014年10月20日
【发明者】刘初亮, 利光辉, 陈洁辉, 刘佳华 申请人:刘初亮