过表达Dkk-3诱导的肌肉萎缩模型及其应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及过表达Dkk-3诱导的肌肉萎缩模型及其应用。
背景技术：
：目前的肌肉萎縮细胞模型主要通过血清饥饿制备，其模拟的是在营养不良情况下的肌肉萎缩，但是在现代社会由于营养不良造成的肌肉萎缩只占肌肉萎缩症患者中很小的比例，包括衰老相关肌肉萎缩在内的绝大多数肌肉萎缩都不是由营养不良造成的。要制备衰老相关肌肉萎缩的细胞模拟，目前只能从衰老小鼠肌肉中直接分离终末分化的肌纤维。这一方法耗时很长，需将小鼠至少饲养一年。一致性较差，由于小鼠存在个体差异，同样年龄的小鼠，其肌肉萎缩的程度存在比较大的差异。自体内直接分离的肌纤维只能在体外培养3－5天，再次使用必须另取新的小鼠进行分离。而由于小鼠间的个体差异，很难保证从不同个体中分离到的肌纤维的萎缩程度的一致性，因而妨碍采用此系统的实验的一致性。目前常用的肌肉萎缩动物模型主要通过限制进食获得，其模拟的是在营养不良情况下的肌肉萎缩。如上文所述，营养不良造成的肌肉萎缩在现代社会发生率很低，无法模拟衰老相关肌肉萎缩。另一获得衰老相关肌肉萎缩动物模型的方法是经长期饲养等动物衰老后作为模型使用。这一方法耗时很长，如上文所述，由于个体差异造成一致性很差，从而降低药物筛选实验的重复性。Dkk-3是Dickkopf蛋白家族的一员,属于胞外分泌蛋白。目前的研究还没有发现Dkk-3是否与肌肉萎缩的发生存在关联。技术实现要素：为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种Dkk-3的新用途，并将Dkk-3用于诱导肌肉发生萎缩，成功构建了肌肉萎缩细胞模型和肌肉萎缩动物模型。本发明的肌肉萎缩细胞模型和动物模型具有肌肉萎缩的典型特征，可极好地模拟体内肌肉萎缩的发生发展，是肌肉萎缩基础和临床应用研究的理想细胞模型和动物模型，可良好地应用于筛选治疗肌肉萎缩的药物。本发明是通过以下技术方案实现的：本发明的第一方面，提供了Dkk-3在制备诱导肌肉细胞发生萎缩的药物或制剂中的用途。优选的，所述肌肉细胞为终末分化的肌肉细胞。优选的，所述药物或制剂还用于减小肌肉细胞中肌管的直径或横切面积。优选的，所述药物或制剂还用于上调肌肉细胞中Atroign1和Murf1等肌肉萎缩标记基因的表达水平。本发明的第二方面，提供了Dkk-3在构建肌肉萎缩细胞模型或肌肉萎缩动物模型中的用途。本发明的第三方面，提供了一种构建肌肉萎缩细胞模型的方法，所述方法包括以下步骤：在肌肉细胞中过表达有效剂量的Dkk-3；获得肌肉萎缩细胞模型。优选的，所述肌肉细胞为终末分化的肌肉细胞。优选的，所述终末分化的肌肉细胞选自以下任一：(1)由肌肉前体细胞、原代肌肉祖细胞或干细胞分化而成；(2)由体内肌肉分离得到终末分化的肌管细胞。在本发明的优选实例中，所述终末分化的肌肉细胞由肌肉前体细胞分化而成。所述肌肉前体细胞选自肌肉前体细胞系，如C2C12细胞。更优选的，所述终末分化的肌肉细胞是将肌肉前体细胞采用分化培养基培养2～4天，诱导分化而成。最优培养时间为3天。优选的，所述过表达有效剂量的Dkk-3的方法为：采用新鲜的含Dkk-3腺病毒的分化培养基，培养终末分化的肌肉细胞；所述Dkk-3腺病毒能够过表达有效剂量的Dkk-K3。在本发明的优选实例中，Dkk3腺病毒在分化培养基中的最终滴度为6x106～26x106TU；培养时间为24～96小时。最优选Dkk-3腺病毒的终滴度为：26x106TU/ml；培养时间为72小时。本发明的第四方面，提供了由前述方法构建的肌肉萎缩模型在筛选药物中的用途。本发明的第五方面，提供了一种筛选治疗肌肉萎缩的候选药物的方法，所述方法包括以下步骤：将测试候选药物施用于由前述方法构建获得的肌肉萎缩细胞模型，并与未施用测试候选药物的肌肉萎缩细胞模型进行比较，其中施用后导致肌肉萎缩症状改善或治愈的测试化合物就是治疗肌肉萎缩的候选药物。上述筛选出的候选药物可构成一个筛选库，可对这些物质进行进一步的细胞实验、动物实验、和/或临床试验，以进一步确证所述潜在物质的治疗肌肉萎缩作用。由于本发明采用过表达Dkk-K3进行诱导，所构建的模型更类似于人类的发病过程，一致性高，避免了由于个体差异导致的异质性，因而在药物的筛选上以以往的模型更为精准，效率更高。本发明的第六方面，提供了一种构建肌肉萎缩动物模型的方法，所述方法包括以下步骤：给哺乳动物过表达有效剂量的Dkk-3；获得肌肉萎缩动物模型。优选的，所述的哺乳动物是鼠。更优选小鼠。优选的，所述施用的方法为局部肌肉注射。优选的，具体方法为：连续数天，给哺乳动物通过腿胫骨前肌局部注射的方式，施用有效剂量的Dkk-K3腺病毒后，饲养数天。在本发明的优选实例中，具体方法为：通过腿胫骨前肌局部注射的方式，给小鼠施用1x109-6.5x1012Tu/kg体重的Dkk-3腺病毒，每注射一次，共注射连续3～10次后，进行饲养5～15天。更优选的，具体方法为：通过腿胫骨前肌局部注射的方式，给小鼠施用3.5x1010Tu滴度/kg体重的Dkk-3腺病毒，每天注射一次，共连续注射7次后，进行饲养7天。本发明的第七方面，提供了由前述方法所构建的肌肉萎缩动物模型在筛选药物中的用途。本发明的第八方面，提供了一种筛选治疗肌肉萎缩的候选药物的方法，所述方法包括以下步骤：将测试候选药物施用于由前述方法构建的肌肉萎缩动物模型，并与未施用测试候选药物的肌肉萎缩动物模型进行比较，其中施用后导致肌肉萎缩症状改善或治愈的测试化合物就是治疗肌肉萎缩的候选药物。上述筛选出的候选药物可构成一个筛选库，可对这些物质进行进一步的细胞实验、动物实验、和/或临床试验，以进一步确证所述潜在物质的治疗肌肉萎缩作用。由于本发明采用过表达Dkk-3的方式进行诱导，所构建的模型更类似于人类的发病过程，因而在药物的筛选上以以往的模型更为精准，效率更高。本发明的有益效果在于：(1)本发明首次揭示了过表达Dkk-3能够诱导肌肉细胞发生萎缩，更类似于人类的发病过程。(2)本发明的肌肉萎缩细胞模型和动物模型具有肌肉萎缩的典型特征，可极好地模拟体内肌肉萎缩的发生发展，是肌肉萎缩基础和临床应用研究的理想细胞模型和动物模型，从而可良好地应用于筛选治疗肌肉萎缩的药物。附图说明图1：在myotube中过表达Dkk-3造成肌肉萎缩。图1A：与空白对照组相比，过表达带有Flag标签的Dkk-3后，myotube的直径显著减小。图1B：统计学分析显示，过表达Dkk-3后myotube直径的显著减小。图1C：通过Westernblot检测带有Flag标签的Dkk-3在myotube中的过表达水平。图2：实时定量荧光PCR表明，过表达Dkk-3后，肌肉萎缩的标记基因Atroign1(左)和MuRF1(右)的表达量较对照组明显上调，表明过表达Dkk-3后造成了肌肉萎缩。图3：在myotube中过表达Dkk-3不同时间后肌肉萎缩的程度。图3A：在分化完成的C2C12myotube中过表达Dkk-3不同时间对肌肉萎缩的影响程度：在过表达2天后，实验组myotube开始变细，在过表达3天后，与对照组相比，myotube直径明显变细。图3B：过表达后不同时间统计myotube直径。可以看到，与对照组相比，第一天无明显变化；第二天实验组略微变细；第三天明显变细。Scalebar：200μm。图4：体内过表达Dkk-3造成肌肉萎缩。图4A：小鼠TA肌肉连续注射7天过表达Dkk-3的腺病毒后，再饲养7天后。取TA肌肉，做冰冻横切切片，荧光显微镜下拍照，结果表明与对照组相比，实验组肌纤维直径明显变小。图4B：通过统计肌纤维直径，表明实验组肌纤维与对照组相比明显更小。Saclebar：100μm。具体实施方式本发明经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现，过表达Dkk-3能够用于成功建立肌肉萎缩细胞模型和肌肉萎缩动物模型。所述肌肉萎缩细胞模型和肌肉萎缩动物模型具有肌肉萎缩的典型特征，可作为模型，良好地模拟肌肉萎缩的发生发展。同时，所述细胞模型和动物模型还可应用于筛选选治疗肌肉萎缩的候选药物。在此基础上完成了本发明。所述的肌肉萎缩是一种哺乳动物的疾病，其主要表现为以下的部分或全部特征：Myotube直径明显变小，Atroign1和Murf1的mRNA表达水平上调。具体而言，本发明人使用过表达Dkk-3的方式建立肌肉萎缩细胞和动物模型，对细胞模型和动物模型进行相关生物学测试，最终筛选到一种Myotube直径明显变小，Atroign1和Murf1的mRNA表达水平上调的肌肉萎缩细胞模型和动物模型。所述肌肉萎缩细胞模型表型稳定，并且在光镜、电镜下的形态特征与肌肉萎缩组织一致。光镜下显示，具有Myotube直径明显变小的特征。免疫组化分析显示，Atroign1和Murf1的mRNA高表达。动物学实验表明，其组织病理形态与肌肉萎缩组织一致。Dkk-3是属于Dickklof蛋白家族的成员，是细胞内产生，分泌到胞外的蛋白分子。Dkk-3的新用途本发明提供Dkk-3在制备诱导肌肉细胞发生萎缩的药物或制剂中的用途。所述肌肉细胞为终末分化的肌肉细胞。所述药物或制剂还用于减小肌肉细胞中肌管的直径或横切面积。所述药物或制剂还用于上调肌肉细胞中Atroign1和Murf1的表达水平。本发明还提供了Dkk-3在构建肌肉萎缩细胞模型或肌肉萎缩动物模型中的用途。肌肉萎缩细胞模型的构建及其用途本发明的肌肉萎缩细胞模型构建方法，包括以下步骤：在肌肉细胞中过表达有效剂量的Dkk-3；获得肌肉萎缩细胞模型。所述肌肉细胞为终末分化的肌肉细胞。所述终末分化的肌肉细胞选自以下任一：(1)由肌肉前体细胞、原代肌肉祖细胞或干细胞分化而成；(2)由体内肌肉分离得到终末分化的肌管细胞。在本发明的优选实例中，所述终末分化的肌肉细胞由肌肉前体细胞分化而成。所述肌肉前体细胞选自肌肉前体细胞系，如C2C12细胞。更优选的，所述终末分化的肌肉细胞是将肌肉前体细胞采用分化培养基培养2～4天，诱导分化而成。最优培养时间为3天。所述过表达有效剂量的Dkk-3的方法为：采用新鲜的含Dkk-3腺病毒的分化培养基，培养终末分化的肌肉细胞；所述DKkk-3腺病毒能够过表达有效剂量的Dkk-3。在本发明的优选实例中,Dkk-3腺病毒的在分化培养基中的终滴度为6x106～26x106TU；培养时间为24～96小时。最优选Dkk-3腺病毒的最终滴度为：26x106TU/ml；培养时间为 72小时。在过表达Dkk-3进行诱导后，本发明人利用肌肉萎缩疾病相关的指标来验证建立模型成功与否。验证发现，采用过表达Dkk-3进行诱导后，Myotube肌管直径明显变小，Atroign1和Murf1的mRNA表达水平上调。综合这些指标可知，本发明人过表达Dkk-3进行诱导后成功构建了肌肉萎缩细胞模型。本发明过表达Dkk-3进行诱导后成功构建了肌肉萎缩细胞模型，所述模型具有多方面的应用。例如，可以用于研究和阐述肌肉萎缩的细胞乃至分子水平上的发病机制。还可应用于治疗肌肉萎缩的药物的筛选。筛选新药因此，本发明提供了一种筛选治疗肌肉萎缩的候选药物的方法，所述方法包括以下步骤：将测试候选药物施用于由前述方法构建的肌肉萎缩细胞模型，并与未施用测试候选药物的肌肉萎缩细胞模型进行比较，其中施用后导致肌肉萎缩症状改善或治愈的测试化合物就是治疗肌肉萎缩的候选药物。上述筛选出的候选药物可构成一个筛选库，可对这些物质进行进一步的细胞实验、动物实验、和/或临床试验，以进一步确证所述潜在物质的治疗肌肉萎缩作用。由于本发明采用过表达Dkk-3进行诱导，所构建的模型更类似于人类的发病过程，因而在药物的筛选上比以往的模型更为精准，效率更高。肌肉萎缩动物模型的构建及其用途本发明的肌肉萎缩动物模型构建方法，包括以下步骤：给哺乳动物过表达有效剂量的Dkk-3；获得肌肉萎缩动物模型；本发明中，所述的“哺乳动物”包括但不限于：小鼠、大鼠、兔、狗、猿猴。所述的哺乳动物在基因的组成、器官解剖、个体的发育、代谢方式、疾病发病机制等方面和人类接近，可良好地应用于人类疾病发病机制、药物药理学研究等方面。优选的，所述的哺乳动物是鼠(如小鼠)。优选的，所述施用的方法，包括(但不限制于)：肌肉注射，静脉注射，腹腔注射等。在本发明的优选实例中，具体方法为：连续数天，给哺乳动物通过胫骨前肌局部注射的方式，施用有效剂量的Dkk-3腺病毒后，饲养数天。在本发明的优选实例中，具体方法为：通过腿胫骨前肌局部注射的方式，给小鼠施用1x109-6.5x1012Tu/kg体重的Dkk-3腺病毒，每天注射一次，共注射连续3～10次后，进行饲 养5～15天。更优选的，具体方法为：通过胫骨前肌局部注射的方式，给小鼠施用3.5x1010Tu滴度/kg体重的Dkk-3腺病毒，每天注射一次，共连续注射7次后，饲养7天。在利用过表达Dkk-3诱导后，本发明人利用肌肉萎缩疾病相关的指标来验证建立模型成功与否。验证发现，采用过表达Dkk-3诱导后，Myotube直径明显变小或者横切面积变小，Atroign1和Murf1的mRNA表达水平上调。综合这些指标可知，本发明人利用过表达Dkk-3诱导并成功构建了肌肉萎缩动物模型。本发明的肌肉萎缩动物模型，，所述模型具有多方面的应用。例如，可以用于研究和阐述肌肉萎缩的细胞乃至分子水平上的发病机制。还可应用于治疗肌肉萎缩的药物的筛选。筛选新药本发明利用过表达Dkk-3诱导成功构建了肌肉萎缩模型，所述模型可应用于治疗肌肉萎缩的药物的筛选。因此，本发明提供了一种筛选治疗肌肉萎缩的候选药物的方法，所述方法包括以下步骤：将测试候选药物施用于由前述方法构建的肌肉萎缩动物模型，并与未施用测试候选药物的肌肉萎缩动物模型进行比较，其中施用后导致肌肉萎缩症状改善或治愈的测试化合物就是治疗肌肉萎缩的候选药物。上述筛选出的候选药物可构成一个筛选库，可对这些物质进行进一步的细胞实验、动物实验、和/或临床试验，以进一步确证所述潜在物质的治疗肌肉萎缩作用。由于本发明采用过表达Dkk-3的方式进行诱导，所构建的模型更类似于人类的发病过程，因而在药物的筛选上以以往的模型更为精准，效率更高。本发明的有益效果在于：(1)本发明首次揭示了过表达Dkk-3的能够诱导肌肉细胞发生萎缩，更类似于人类的发病过程。(2)本发明的肌肉萎缩细胞模型和动物模型具有肌肉萎缩的典型特征，可极好地模拟体内肌肉萎缩的发生发展，是肌肉萎缩基础和临床应用研究的理想细胞模型和动物模型，从而可良好地应用于筛选治疗肌肉萎缩的药物。以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发 明的精神下进行各种修饰或改变。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
技术领域：
的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
技术领域：
常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECμLARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECμLARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECμLARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。实施例1过表达Dkk-3诱导的肌肉萎缩细胞模型的建立本实施例的主要内容为对肌肉前体细胞系C2C12进行培养、分化并构建肌肉细胞萎缩模型：(1)配置生长培养基：DMEM高糖培养基加入10％胎牛血清后混匀备用。(2)配置分化培养基：DMEM高糖培养基中加入2％马血清后混匀备用。(3)包装能够表达Dkk-3的腺病毒(滴度：1.3x1010Tu/ml)，具体方法如下：首先从NCBI上获取Dkk-K3CDS序列(NM_015814)，并设计PCR引物：primer-F：GGGGTACCATGGACTACAAAGACCATGAC(SEQIDNO.7)；primer-R：GCTCTAGACTAAATCTCCTCCTCTCCGCC(SEQIDNO.8)；取一个10cm培养皿的C2C12细胞，吸弃培养液，加入1mlTrizol裂解细胞；加入200μl氯仿，充分震荡混匀，12000转/分钟4℃离心15分钟，取上层清亮液体，转入到新的EP管中；加入500μl异丙醇，充分混匀，12000转/分钟4℃离心15分钟，弃上清，向沉淀中加入1ml75％乙醇洗一次，弃上清后室温晾10分钟；加入40μl无RNA酶的水溶解，获得总的mRNA。分光光度法测mRNA浓度后，取1ug总RNA，加入1μl(200units)NEB公司MμlV反转录酶及其1x反应缓冲液，0.5mMdNTP混合物，4μMOligodT,1μlRNaseinhibitor42℃孵育1小时，反转录为cDNA。将cDNA在75℃灭活10分钟，作为PCR模板。用设计的PCR引物，加入1μlKOD聚合酶，1μl(10mM)的dNTP，PCR获得表达Dkk-3的基因。(1.95℃5min；2.95℃变性30s；3.58℃退火30s；4.68℃延伸2min；5.68℃10min。第2-4步循环30次)PCR产物琼脂糖凝胶电泳回收后，用1μlNEB的Kpn1和Xbal1限制性内切酶37℃酶切2小时，1ug载体padTrack-GFP也用1μlNEB的Kpn1和Xbal1限制性内切酶37℃酶切2小时，琼脂糖凝胶电泳回收后，用1μlNEB的T4DNA连接酶室温连接5小时后，转化感受态细胞BJ5183，用Kpn1和Xbal1限制性内切酶酶切鉴定后，转染DH5α感受态细胞扩增质粒，提取质粒后，用Pac1限制性内切酶线性化，胶回收后即可用于转染包装病毒的细胞293A。取10ug线性化好的表达质粒，磷酸钙沉淀法转染293A细胞(10ug质粒加入到250μl水中，加入250μl氯化钙溶液，充分混匀备用；取一个50ml离心管，加入500μl的2xHBS溶液，将备好的质粒-钙溶液逐滴加入到HBS溶液中，边加边充分震荡；加完后室温放置20分钟备用；长到约60％底面积的293A细胞取出，吸弃旧培养液，加入10ml生长培养(DMEM+10％FBS)，将前面备好的质粒钙沉淀悬液缓慢加入到培养基中，轻轻摇匀后置于37度，5％二氧化碳培养箱中培养；转染后16小时，更换新的生长培养基，继续培养。从48小时后，每日在荧光显微镜下观察，直至镜下所有的细胞都表达绿色荧光(一般需要7-10天)。收集所有的细胞及细胞培养液，1500转/分钟离心室温离心5分钟，弃上清，留细胞沉淀。用PBS洗两次后，加入500μμlPBS重悬，用液氮-37℃反复冻融法裂解细胞(冻融3次)，2000转/分钟室温离心5分钟，上清转到新的管子备用(即P1代病毒)。培养40盘(10cm培养皿)293A细胞至长到60％底面积，每盘加入10μlP1代病毒感染，24小时后每日镜下观察，直至所有细胞表达绿色荧光(一般需要2-3天)后，按照收P1代病毒同样的方法收取并裂解释放病毒(一般加入2mlPBS裂解细胞获得病毒)，至此即获得P2代病毒。测滴度后即可使用(后续如若需要更多的病毒，即按照获取P2代病毒的方法扩增即可)。(4)细胞系培养：C2C12细胞从液氮中取出后迅速置于37℃水浴锅中溶解，加入到9ml生长培养基中，1500rpm/min室温离心5分钟后，弃掉上清，加入1ml生长培养基重悬后转入10cm培养皿中，补加9ml生长培养基，在37℃，5％二氧化碳条件下培养。C2C12细胞系分化为myotube：待C2C12细胞长至完全铺满整个培养皿之后，用PBS洗3次，加入10ml分化培养基，在37℃，5％二氧化碳条件下诱导分化3天。(5)过表达Dkk-3诱导由C2C12分化而来的myotube发生肌肉萎缩：更换新鲜10ml分化培养基，在对照组中加入2.6x107TU的GFP腺病毒(MOI:1:5)，在实验组中加入2.6x107TU的Dkk-3腺病毒(MOI:1:5)。37℃，5％二氧化碳条件下培养72h。在Zeiss荧光显微镜下观察拍照，并测量myotube的直径(结果如图1所示)。同时收集细胞，提取总蛋白，取40μg总蛋白进行SDS－PAGE电泳，转膜后用Flag抗体杂交(1：2000稀释，室温1小时)，检测带有Flag标签的过表达的Dkk-3。PBS洗3次(10分钟/次)后，加入1：1000稀释的驴抗鼠二抗，室温孵育1小时。PBS洗3次(10分钟/次)后，显色，检测过表达Flag标记的Dkk-3的表达(图1C)。结果，如图1A所示：与空白对照组相比，过表达带有Flag标签的Dkk-3后，myotube的直径显著减小。如图1B：统计学分析显示，过表达Dkk-3后myotube直径的显著减小。如图1C：通过Westernblot检测，带有Flag标签的Dkk-K3在myotube中的确过表达。(6)取加入Dkk-3腺病毒的实验组和对照组各一盘细胞，加入1mlTrizol后提取总RNA，各取1μg总RNA加入1μl(200units)NEB公司MuLV反转录酶及其1x反应缓冲液，0.5mMdNTP混合物，4μMOligodT,1μlRNaseinhibitor42℃孵育1小时，反转录为cDNA。将cDNA在90℃灭活10分钟，作为PCR模板。使用上面列出的正向和反向引物，进行实时荧光定量PCR检测目的基因的表达量。PCR条件为95℃10分钟，95℃30秒，60℃60秒，第二和第三步反复循环40次。采用GAPDH作为内参，所用引物序列为：GAPDHforward:ACCCAGAAGACTGTGGATGG(SEQIDNO.1)GAPDHreverse:ACACATTGGGGGTAGGAACA(SEQIDNO.2)同时检测肌肉中肌肉萎缩特异性基因Atrogin1(NM_026346.3)和Atrogin1(NM_026346.3)的表达作为肌肉萎缩的标记。所用引物序列为：Atrogin-1forward:AGAGAGGCAGATTCGCAAGCGT(SEQIDNO.3)Atrogin-1reverse:TGCAAAGCTGCAGGGTGACCC(SEQIDNO.4)MuRF-1forward：acctgctggtggaaaacatc(SEQIDNO.5)MuRF-1reverse：cttcgtgttccttgcacatc(SEQIDNO.6)采用NEB的MuLv反转录酶反转录为cDNA，通过实时荧光定量PCR检测肌肉萎缩标记物Atroign1和MuRF1的mRNA表达水平。结果如图2所示，过表达Dkk-3能上调Atrogin1(左)和MuRF1(右)的表达水平，造成肌肉萎缩。此外，还进行了如下优化考察实验：(a)固定分化诱导的天数为3天，作用时间72小时，对Dkk-3腺病毒的有效剂量进行考察，亦即，上述步骤(5)中，加入不同滴度的Dkk-3腺病毒，使其在分化培养基中的终浓度分别为0、6、13、26、60、130x106Tu，观察终末分化肌肉细胞直径的变化情况，结果如表1所示：表1.不同量的Dkk-3病毒感染肌管细胞后的效果病毒量(x106Tu)肌管直径(μm)死亡率(％)015.7±1.730614.4±1.593137.5±0.657263.81±0.429603.7±0.48851304.1±0.4795由上述结果可知，如果病毒的量过小，感染效率较低，过表达程度低，诱导肌肉萎缩的效果不明显；病毒的量过大，细胞被过度感染造成严重的细胞死亡。具体的，当Dkk-3腺病毒在分化培养基中终浓度为(6～26)x106Tu时，均可使得终末分化肌肉细胞直径明显减小。但是，当Dkk-3腺病毒在分化培养基中终浓度高于60x106Tu时，会导致多数细胞死亡。下述实验优选采用Dkk-3腺病毒在分化培养基中终浓度为26x106Tu。(b)固定分化培养基中的Dkk-3腺病毒终浓度为26x106Tu，诱导分化时间3天，对作用时间进行了考察，亦即，上述步骤(5)中，培养12～96小时，观察终末分化肌肉细胞直径的变化情况，结果如表2和图3所示：表2.在肌肉细胞中过表达Dkk-3后不同时间肌管细胞的直径作用(培养)时间(小时)平均肌管细胞直径(μm)014.7±1.511215.3±1.622414.64±1.553614.82±1.384811.57±1.06605.38±0.61723.81±0.42964.05±0.48由表2和图3结果可知，在过表达2天后，实验组myotube开始变细，在过表达3天后，与对照组相比，myotube直径明显变细。因此，优选作用时间为72h。实施例2过表达Dkk-3诱导的肌肉萎缩动物模型的建立表达带有GFP标签的Dkk-3腺病毒，滴度为1.3x1010TU/ml。包装能够表达Dkk-3的腺病毒(滴度：1.3x1010TU/ml)的具体方法如下：首先从NCBI上获取Dkk-3CDS序列(NM_015814)，设计PCR引物：primer-F：GGGGTACCATGGACTACAAAGACCATGAC(SEQIDNO.7)；primer-R:GCTCTAGACTAAATCTCCTCCTCTCCGCC(SEQIDNO.7)。取一个10cm培养皿的C2C12细胞，吸弃培养液，加入1mlTrizol裂解细胞；加入200μl氯仿，充分震荡混匀，12000转/分钟4度离心15分钟，取上层清亮液体，转入到新的EP管中；加入500μl异丙醇，充分混匀，12000转/分钟4度离心15分钟，弃上清，向沉淀中加入1ml75％乙醇洗一次，弃上清后室温晾10分钟；加入40μl无RNA酶的水溶解，获得总的mRNA。测浓度后，取1ug总RNA，加入1μl(200units)NEB公司MuLV反转录酶及其1x反应缓冲液，0.5mMdNTP混合物，4μMOligodT,1μlRNaseinhibitor42℃孵育1小时，反转录为cDNA。将cDNA在75℃灭活10分钟，作为PCR模板。用设计的PCR引物PCR获得表达Dkk-3的基因，Kpn1和Xbal1限制性内切酶37℃酶切2小时，载体padTrack-GFP也用Kpn1和Xbal1限制性内切酶37℃酶切2小时，琼脂糖凝胶电泳回收后，用T4DNA连接酶室温连接5小时后，转化感受态细胞BJ5183，用Kpn1和Xbal1限制性内切酶酶切鉴定后，转染DH5α感受态细胞扩增质粒，提取质粒后，用Pac1限制性内切酶线性化，胶回收后即可用于转染包装病毒的细胞293A。取10ug线性化好的表达质粒，磷酸钙沉淀法转染293A细胞(10ug质粒加入到250μl水中，加入250μl氯化钙溶液，充分混匀备用；取一个50ml离心管，加入500μl的2xHBS溶液，将备好的质粒-钙溶液逐滴加入到HBS溶液中，边加边充分震荡；加完后室温放置20分钟备用；长到约60％底面积的293A细胞取出，吸弃旧培养液，加入10ml生长培养(DMEM+10％FBS)，将前面备好的质粒钙 沉淀悬液缓慢加入到培养基中，轻轻摇匀后置于37度，5％二氧化碳培养箱中培养；转染后16小时，更换新的生长培养基，继续培养。从48小时后，每日在荧光显微镜下观察，直至镜下所有的细胞都表达绿色荧光(一般需要7-10天)。收集所有的细胞及细胞培养液，1500转/分钟离心室温离心5分钟，弃上清，留细胞沉淀。用PBS洗两次后，加入500μlPBS重悬，用液氮-37度反复冻融法裂解细胞(冻融3次)，2000转/分钟室温离心5分钟，上清转到新的管子备用(即P1代病毒)。培养40盘(10cm培养皿)293A细胞至长到60％底面积，每盘加入10μlP1代病毒感染，24小时后每日镜下观察，直至所有细胞表达绿色荧光(一般需要2-3天)后，按照收P1代病毒同样的方法收取并裂解释放病毒(一般加入2mlPBS裂解细胞获得病毒)，至此即获得P2代病毒。测滴度后即可使用(后续如若需要更多的病毒，即按照获取P2代病毒的方法扩增即可)。方法：取成年小鼠(6-8周)，首先用只表达GFP的空载体腺病毒做预实验，筛选最佳的注射时间和注射后饲养时间。通过连续注射不同次数后，饲养不同天数后处死小鼠后取胫骨前肌，包埋于包埋剂OCT中，制成冰冻切片。在Zeiss荧光显微镜下观察拍照，筛选出表达绿色荧光最多的实验组进行后续试验。如图4所示，我们筛选出连续注射7次后饲养7天为最佳条件。将50μl滴度为1.3x1010TU/ml的表达Dkk-3的腺病毒通过肌肉注射，注射进小鼠左腿胫骨前肌中，右腿胫骨前肌注射50μl滴度为1.3x1010TU/ml的空载体腺病毒作为对照，每天注射一次，连续注射7天后，等待10天。然后取小鼠胫骨前肌，包埋于包埋剂OCT中，制成冰冻切片。通过苏木精-伊红染色(HE染色)显示肌纤维轮廓，比较肌纤维直径大小。染色方法如下：将冰冻切片用PBS洗两次，5分钟/次；苏木精染色1分钟，自来水冲洗20分钟；30％乙醇中孵育5分钟；50％乙醇中孵育5分钟；70％乙醇中孵育5min；95％乙醇中孵育5min；在伊红染料中染色10秒；95％乙醇中孵育5分钟；100％乙醇中孵育5分钟；100％乙醇中孵育5分钟；二甲苯：EtOH＝1:1溶液中孵育10分钟；二甲苯中孵育10分钟；晾干后用树脂胶封片。显微镜下拍照，统计肌纤维的直径(图4)。具体的，如图4A所示，在小鼠肌肉中过表达带有GFP标签的Dkk-3诱导肌肉萎缩；如图4B所示，统计学分析显示，过表达带有GFP标签的Dkk-3比只表达GFP的肌肉的直径明显要小。此外，还进行了如下优化考察实验：(a)考察了在体内连续注射Dkk-3病毒不同天数对小鼠肌纤维面积的影响，结果如表3所示：表3.在体内连续注射Dkk-3病毒不同天数的肌纤维面积注射天数(天)平均肌纤维面积(μm2)09461±76419245±54729852±84539425±81549210±68358788±65267254±68476435±55486341±61796784±648106421±663由上述结果可知，当Dkk-3腺病毒注射为3～10天时，均能够使得小鼠肌肉细胞直径明显减小。但是，当注射天数为7天时，已经取得很好的效果。(b)考察了不同Dkk-3病毒注射浓度对小鼠肌纤维面积的影响，结果如表4所示：表4.在体内注射不同数量病毒的肌纤维面积病毒滴度(x109Tu/kg体重)肌纤维面积(μm2)1.39251±9056.58735±817136145±487655942±6781306082±6476506175±72413006253±63765006217±715由上述结果可知，当Dkk-3腺病毒注射浓度为(1.3～6500)x109Tu/kg体重时，均能够使得小鼠肌肉细胞直径明显减小。(c)考察了不同饲养时间对小鼠肌肉直径的影响，结果如表5所示：表5.在体内在注射Dkk-3病毒后等待不同天数的肌纤维面积等待天数(天)肌纤维面积(μm2)09264±61419317±74229230±84539325±67549283±73459246±84269295±91478343±76188651±81597624±572106245±437116387±523126145±487136284±518146495±495156642±467由上述结果可知，当Dkk-3腺病毒作用时间为5～15天时，均能够使得小鼠肌肉细胞直径明显减小。但是，当作用天数为7天时，已经取得很好的效果。实施例3药物筛选以实施例1制备的肌肉萎缩细胞模型或实施例2制备的肌肉萎缩动物模型为受试对象，检测候选药物施用前后，Myotube直径变化，从而判断候选药物是否对于治疗肌肉萎缩是有效的。测试组：给予候选药物的模型；对照组：不给予候选药物或给予安慰剂的模型。如果与对照组相比，测试组中的Myotube直径变大，Atroign1和Murf1的mRNA表达水平下降，则说明该候选药物可治疗肌肉萎缩。可利用患肌肉萎缩动物，对上述经筛选能够治疗肌肉萎缩的候选药物，进行进一步的动物试验，进一步验证治疗效果。以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。当前第1页1 2 3