本发明属人工肝技术领域，涉及一种脂肪间充质干细胞诱导成肝脏样细胞的方法。
背景技术：
目前研究者建立了多种体系将间充质干细胞诱导为成肝脏样细胞，联合使用多种生长因子和营养物质，如成纤维细胞生长因子(FGF)，肝细胞生长因子(HGF)，胰岛素转铁硒(ITS)，和地塞米松(Dex)等诱导BMMSCs将转化为具有多角形态的，具有干细胞功能的细胞。此外，一些化学因子如胰岛素样生长因子1、烟酰胺、肝细胞核因子(HNF-4α)和丙戊酸可以显著提高人BMMSCs的向肝脏样细胞分化的比率，以及增强肝特异性的表达水平。Lu等人用HGF和FGF-4诱导BMMSCs七天后，随即在含有抑制剂p38，ERK1/2和MSK1诱导培养基中继续培养，发现诱导后的BMMSCs显示出肝脏样细胞的特征。
而在ADSCs向肝脏样细胞诱导方面，同样采用了FGF、HGF、EGF、OSM等生长因子，及Dex、烟酰胺等化学因子，发现诱导后的ADSCs也能够显示出肝脏样细胞的特征。在诱导方法上，大部分研究者采用一步法诱导，诱导时间不定，而Agnieszka和Sellamuthu等采用的两步诱导法也能获得较为理想的诱导效果。上述的诱导方案，大多需要2周的时间，向成肝脏样细胞诱导的时间较长。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是如何将脂肪间充质干细胞诱导成肝脏样细胞，以及提高诱导成肝的效率，本发明提供了脂肪间充质干细胞诱导成肝脏样细胞的方法。
本发明在诱导时采用了一步诱导法，联合使用HGF、FGF4、OSM、EGF、aFGF以及Dex、ITS、Vpp等化学因子建立一种新的诱导体系，在第7天即取得了较好的诱导效果。在成肝诱导的鉴定方面，比较了成体干细胞诱导的肝脏样细胞的PCR、Western和免疫荧光的表达，显示本发明在成肝方面无明显的异常。
本发明的脂肪间充质干细胞诱导成肝脏样细胞的方法，包括以下步骤：
(1)脂肪间充质干细胞的原代培养与传代；
将脂肪间充质干细胞原代接种培养，待接种后细胞密度达90％以上，则传代；
(2)细胞培养；
进行传代后接种，并恒温培养；培养基为a-MEM+10～20v/v％FBS或DMEM+10～20v/v％FBS；
(3)成肝脏样细胞诱导培养；
细胞贴壁后，将培养基更换为成肝诱导培养基，每隔3～4天换一次成肝诱导培养基；
所述成肝诱导培养基为含有20-50ng/mL FGF4、50-150ng/mL HGF、20-40ng/mL OSM、20-50ng/mL aFGF、1-20μmol/L Dex、50-200μmol/L VPP、1-10mmol/L Vc和1X胰岛素转铁蛋白硒的基础培养基；
所述基础培养基为含5～10v/v％FBS的DMEM培养基；
细胞贴壁后，将培养基更换为成肝诱导培养基，每隔3～4天换一次成肝诱导培养基；
(4)成肝脏样细胞诱导；
成肝脏样细胞诱导培养7～15天，即诱导成肝脏样细胞。
目前国内外有很多种方案可以将成体干细胞在体外诱导分化为肝脏样细胞。很多研究表明，如果想要获得具有成熟肝细胞功能的诱导细胞，必须由多种细胞因子和生长因子的共同作用，在肝脏再生过程中起重要作用的细胞因子很多，目前应用最广泛的是HGF和FGF4。
HGF主要在肝脏枯否细胞与肝窦内皮细胞中产生，当其浓度小至1ng/mL时就对肝细胞有促进有丝分裂作用，是正常肝细胞最强的促有丝分裂剂，它的另一重要作用就是能增加细胞的能动性，目前研究认为FGF4也许在内皮特化方面起重要作用，而HGF则能诱导非活跃增生状态的肝细胞分化，通过二者的共同调控间充质干细胞向肝脏样细胞分化。除两种细胞因子以外，也有文献采用OSM、aFGF、EGF因子等辅助诱导不同间充质干细胞向肝脏样方向分化，认为可缩短诱导时间。OSM是一种多功能细胞因子，属于白介素6(IL-6)家族成员，研究显示OSM在肝脏再生中起重要作用。表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)是一种强有丝分裂原，它与受体EGFR结合后能诱导组织细胞的增殖、分化、成熟，是目前已知的能够促进肝脏再生的一个主要生长因子。辅助营养因子Vc和Vpp等都能在一定程度上促进细胞的增殖与分化。目前应用的研究方案大多采用了其中两种或者四种以内细胞因子，我们采用了多种细胞因子和生长因子共同诱导脂肪间充质干细胞向肝脏样细胞方向分化，我们的诱导体系包含了目前报道的几乎所有的细胞因子及生长因子，不仅明显提高了成肝脏样细胞诱导的比例，而且大大缩短了诱导时间，短期内能够迅速提供大量的高质量的肝脏样细胞。
Vpp(nicotinamide烟酰胺)常应用于多种实验研究，研究主要集中在抗氧化衰老及对细胞凋亡的保护作用领域，在1989年有研究证实Vpp能够提高分离培养的肝细胞的存活率，新的研究显示Vpp在能够促进肝损伤动物模型肝功能及肝细胞的修复，此外，研究显示Vpp在体外能够促进肝细胞集落的形成及促进干细胞向肝细胞方向的分化。Vc在多种诱导分化体系中均能发挥促分化作用，Vc能够促进细胞的增殖及维持细胞分化后细胞的表型，Dex(地塞米松)在多种诱导体系均有促诱导分化作用，三种生长因子相结合，不仅加强了脂肪间充质干细胞向肝脏样细胞诱导分化能力，提高诱导分化后的细胞存活率，而且有助于诱导后肝细胞表型及功能的维持。
成纤维生长因子(FGF)是一个多基因家族，FGFs对培养细胞的作用具有多样性,可以是促有丝分裂活性和非促有丝分裂活性，FGFs能刺激细胞的增殖,并伴有促细胞分化。aFGF(酸性生长因子)是最早发现的FGF成员之一，是一种有广泛促分裂作用的微量活性物质，在aFGF受体最多，结合能力更强：aFGF是目前已知FGF中，唯一能与所有受体蛋白有高度亲和力的FGF，目前主要应用于骨髓及其它间充质的成肝脏样细胞诱导及其它诱导分化体系，在脂肪间充质干细胞的成肝诱导体系中应用较少。bFGF(碱性生长因子)研究应用广泛，有促进细胞增殖及向多种细胞表型诱导分化，促细胞增殖作用在骨髓间充质干细胞、脐带间充质研究较为广泛，而促诱导作用的研究多集中于成骨诱导及成心肌样诱导，bFGF有研究显示用于骨髓间充质干细胞成肝脏样细胞的诱导，而关于bFGF在脂肪间充质干细胞向成肝脏样细胞的诱导中的作用的研究无具体阐述，且较少的研究将bFGF与其它诱导因子相结合提高成肝的效率。FGF4与HGF联合诱导间充质干细胞向成肝脏样细胞诱导体系中最为常用的诱导因子组合，FGF4和HGF通过MAPK途径启动骨髓间充质干细胞向肝脏样细胞的诱导分化，而在脂肪间充质干细胞成肝样诱导分化的作用途径未见有文献记载。FGF4在成肝脏样细胞诱导过程中的作用研究较为广泛，然而目前未有研究将三种成纤维细胞因子与HGF联合应用，组成脂肪间充质干细胞的成肝脏样诱导体系，三种成纤维细胞因子单独作用，互相加成，取得了意想不到的技术效果：最终缩短了诱导时间，提高了诱导的效率。
目前将其中几种因子相组合用于肝脏样细胞的诱导的研究较多，但基本无研究将这10种生长因子同时用于肝脏样细胞的诱导，这10种因子协调作用，发挥了单独使用某种因子或其中几种因子达不到的作用。提高了诱导的肝脏样细胞诱导率及生存率。
作为优选的技术方案：
如上所述的脂肪间充质干细胞诱导成肝脏样细胞的方法，所述原代接种时间为72小时。
如上所述的脂肪间充质干细胞诱导成肝脏样细胞的方法，所述传代按1:2～3传代。
如上所述的脂肪间充质干细胞诱导成肝脏样细胞的方法，步骤(1)中，若细胞密度未达90％，则半量换液，延长培养一天传代。
如上所述的脂肪间充质干细胞诱导成肝脏样细胞的方法，所述传代后接种是指：取对数生长的第2～4代细胞，以1×104/cm2的浓度进行传代后接种。
如上所述的脂肪间充质干细胞诱导成肝脏样细胞的方法，所述恒温培养是指：于5v/v％CO2和37℃条件下恒温培养。
如上所述的脂肪间充质干细胞诱导成肝脏样细胞的方法，所述细胞贴壁是指细胞培养24h后见细胞贴壁生长。
如上所述的脂肪间充质干细胞诱导成肝脏样细胞的方法，所述成肝诱导培养基中还含有20ng/mL EGF和/或10ng/mL bFGF。
本发明还提供了一种成肝诱导培养基，为细胞诱导成肝脏样细胞的培养基；为含有20-50ng/mL FGF4、50-150ng/mL HGF、20-40ng/mL OSM、20-50ng/mL aFGF、1-20μmol/L Dex、50-200μmol/L VPP、1-10mmol/L Vc和1X胰岛素转铁蛋白硒的基础培养基；
所述基础培养基为含5～10v/v％FBS的DMEM培养基；
本发明的成肝诱导培养基联合采用多种诱导因子与化学因子，比单独使用其中一种因子或几种因子，诱导时间缩短，细胞成肝比率升高。
如上所述的成肝诱导培养基，所述细胞为脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐血干细胞或脐带干细胞；本发明通过实验证实了脂肪间充质干细胞能很好地诱导成肝脏样细胞，其他的干细胞均可依照本发明的方法进行诱导而得到肝脏样细胞，特别是骨髓间充质干细胞、脐血干细胞和脐带干细胞。
所述成肝诱导培养基中还含有20ng/mL EGF和/或10ng/mL bFGF。在成肝诱导培养基中，再加入一些相互之间没有负面影响的细胞因子、生长因子会更有助于成肝诱导。
有益效果：
本发明为生物人工肝筛选理想的种子细胞，为临床进行干细胞移植治疗急慢性肝脏衰竭提供理想的移植供体细胞。
本发明成肝效率高，一周即能取得较好的诱导效果，诱导时间短，细胞成肝比例高。
附图说明
附图为ADSCs成肝脏样诱导前后的形态变化图(100×)；
其中：A为ADSCs诱导前细胞呈长梭形；
B为诱导后第3天，部分细胞开始由长梭形变为长椭圆形，多角形；
C为诱导后第7天，类圆形，多角形细胞数目增多；
D为诱导后第10天，诱导细胞呈圆形。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明的一种成肝诱导培养基，为含有20-50ng/mL FGF4、50-150ng/mL HGF、20-40ng/mL OSM、20-50ng/mL aFGF、1-20μmol/L Dex、50-200μmol/L VPP、1-10mmol/L Vc和1X胰岛素转铁蛋白硒的基础培养基；
所述基础培养基为含5～10v/v％FBS的DMEM培养基。
实施例1
1、小鼠ADSCs的分离、提取与原代培养：
(1)取BALB/c雄性3天乳鼠5只，颈椎脱臼法处死后，浸泡于75％酒精中消毒3min后转移入超净台中；
(2)在超净台中，用已灭菌的眼科剪、眼科镊自脐以下开始剥离小鼠皮肤，暴露腹股沟脂肪组织，完整分离腹股沟脂肪组织，加入5v/v％双抗的PBS洗涤3min，转移入无血清培养基中待处理；
(3)剔除小鼠脂肪组织周围的皮下与筋膜组织，用眼科剪剪碎小于1cm3，转移入15mL离心管中，加入三倍体积的含1mg/mL的胶原酶I的PBS，室温摇床1h；
(4)等体积含血清培养基终止消化，室温孵育5min，300g离心15min；
(5)弃上清，5mL基础培养基重悬，过150目滤网，300g离心10min；
(6)接种于2个6cm培养皿，置于5v/v％CO2，37℃恒温培养箱中培养；
2、传代与细胞培养；
原代分离的细胞接种72小时后，观察细胞生长状况，待细胞密度为90.1％以后，按1:2传代；
然后进行传代后接种，取对数生长的第2代细胞，以1×104/cm2的浓度进行传代后接种，置于5v/v％CO2、37℃恒温培养箱中培养；培养液为含有a-MEM+10v/v％FBS的培养基；
3、成肝脏样细胞诱导培养；
接种后24h观察细胞贴壁后，将培养基更换为成肝诱导培养基，每隔3天换一次成肝诱导培养基；成肝诱导培养基为含有25ng/mL FGF4、50ng/mL HGF、20ng/mL OSM、20ng/mL aFGF、1μmol/L Dex、50μmol/L VPP、1mmol/L Vc和1X胰岛素转铁蛋白硒的含5v/v％FBS的DMEM培养基；另外肝诱导培养基中还含有20ng/mL EGF；
4、成肝脏样细胞诱导；
成肝脏样细胞诱导培养7天，即诱导成肝脏样细胞。
附图为ADSCs成肝脏样诱导前后的形态变化图(100×)；A：ADSCs诱导前细胞呈长梭形，B：诱导后第3天，部分细胞开始由长梭形变为长椭圆形，多角形；C：诱导后第7天，类圆形，多角形细胞数目增多；D：诱导后第10天，诱导细胞呈圆形。
经诱导后的成肝脏样细胞，进行RT-PCR检测、Western检测和免疫荧光染色，成肝脏样诱导至第10天，在成肝脏样诱导的ADSCs中检测到ALB、AFP、CK18、CK19和CYP1A1的表达，两种成体干细胞成肝脏样诱导后，Western Blot结果显示：未诱导的细胞和诱导的两种成肝脏样细胞均有ALB、AFP、CK18和CYP1A1的表达，但成肝脏样诱导后的两种细胞表达升高；免疫荧光染色显示，ADSCs在诱导第7天，诱导细胞在具有肝脏样细胞形态的同时表达肝细胞标志物ALB、CK-18、CK-19、AFP和CYP1A1，而未诱导细胞不表达肝细胞标志物。
实施例2
1、小鼠ADSCs的分离、提取与原代培养：
具体步骤同实施例1中该步骤；
2、传代与细胞培养；
原代分离的细胞接种72小时后，观察细胞生长状况，待细胞密度达91％以后，按1:3传代；
然后进行传代后接种，取对数生长的第4代细胞，以1×104/cm2的浓度进行传代后接种，置于5v/v％CO2、37℃下恒温培养箱中培养；培养基为含有a-MEM+20v/v％FBS的培养基；
3、成肝脏样细胞诱导培养；
接种后24h观察细胞贴壁后，将培养基更换为成肝诱导培养基，每隔4天换一次成肝诱导培养基；成肝诱导培养基为含有50ng/mL FGF4、150ng/mL HGF、40ng/mL OSM、50ng/mL aFGF、20μmol/L Dex、200μmol/L VPP、10mmol/L Vc和1X胰岛素转铁蛋白硒的含10v/v％FBS的DMEM培养基；另外肝诱导培养基中还含有10ng/mL bFGF；
4、成肝脏样细胞诱导；
成肝脏样细胞诱导培养15天，即诱导成肝脏样细胞。
经诱导后的成肝脏样细胞，进行RT-PCR检测、Western检测和免疫荧光染色，成肝脏样诱导至第10天，在成肝脏样诱导的ADSCs中检测到ALB、AFP、CK18、CK19和CYP1A1的表达，两种成体干细胞成肝脏样诱导后，Western Blot结果显示：未诱导的细胞和诱导的两种成肝脏样细胞均有ALB、AFP、CK18和CYP1A1的表达，但成肝脏样诱导后的两种细胞表达升高；免疫荧光染色显示，ADSCs在诱导第7天，诱导细胞在具有肝脏样细胞形态的同时表达肝细胞标志物ALB、CK-18、CK-19、AFP和CYP1A1，而未诱导细胞不表达肝细胞标志物。
实施例3
1、小鼠ADSCs的分离、提取与原代培养：
具体步骤同实施例1中该步骤；
2、传代与细胞培养；
原代分离的细胞接种72小时后，观察细胞生长状况，若细胞密度未达90％，则半量换液，延长培养一天后按1:2.5传代；
然后进行传代后接种，取对数生长的第4代细胞，以1×104/cm2的浓度进行传代后接种，置于5v/v％CO2、37℃下恒温培养箱中培养；培养基为含有DMEM+10v/v％FBS的培养基；
3、成肝脏样细胞诱导培养；
接种后24h观察细胞贴壁后，将培养基更换为成肝诱导培养基，每隔4天换一次成肝诱导培养基；成肝诱导培养基为含有30ng/mL FGF4、100ng/mL HGF、30ng/mL OSM、40ng/mL aFGF、10μmol/L Dex、150μmol/L VPP、8mmol/L Vc和1X胰岛素转铁蛋白硒的含8v/v％FBS的DMEM培养基；另外肝诱导培养基中还含有20ng/mL EGF和10ng/mL bFGF；
4、成肝脏样细胞诱导；
成肝脏样细胞诱导培养10天，即诱导成肝脏样细胞。
经诱导后的成肝脏样细胞，进行RT-PCR检测、Western检测和免疫荧光染色，成肝脏样诱导至第10天，在成肝脏样诱导的ADSCs中检测到ALB、AFP、CK18、CK19和CYP1A1的表达，两种成体干细胞成肝脏样诱导后，Western Blot结果显示：未诱导的细胞和诱导的两种成肝脏样细胞均有ALB、AFP、CK18和CYP1A1的表达，但成肝脏样诱导后的两种细胞表达升高；免疫荧光染色显示，ADSCs在诱导第7天，诱导细胞在具有肝脏样细胞形态的同时表达肝细胞标志物ALB、CK-18、CK-19、AFP和CYP1A1，而未诱导细胞不表达肝细胞标志物。
实施例4
1、小鼠ADSCs的分离、提取与原代培养：
具体步骤同实施例1中该步骤；
2、传代与细胞培养；
原代分离的细胞接种72小时后，观察细胞生长状况，若细胞密度未达90％，则半量换液，延长培养一天后按1:2.5传代；
然后进行传代后接种，取对数生长的第4代细胞，以1×104/cm2的浓度进行传代后接种，置于5v/v％CO2、37℃下恒温培养箱中培养；培养基为含有DMEM+20v/v％FBS的培养基；
3、成肝脏样细胞诱导培养；
接种后24h观察细胞贴壁后，将培养基更换为成肝诱导培养基，每隔4天换一次成肝诱导培养基；成肝诱导培养基为含有40ng/mL FGF4、120ng/mL HGF、35ng/mL OSM、40ng/mL aFGF、15μmol/L Dex、180μmol/L VPP、6mmol/L Vc和1X胰岛素转铁蛋白硒的含7v/v％FBS的DMEM培养基；另外肝诱导培养基中还含有10ng/mL bFGF；
4、成肝脏样细胞诱导；
成肝脏样细胞诱导培养12天，即诱导成肝脏样细胞。
经诱导后的成肝脏样细胞，进行RT-PCR检测、Western检测和免疫荧光染色，成肝脏样诱导至第10天，在成肝脏样诱导的ADSCs中检测到ALB、AFP、CK18、CK19和CYP1A1的表达，两种成体干细胞成肝脏样诱导后，Western Blot结果显示：未诱导的细胞和诱导的两种成肝脏样细胞均有ALB、AFP、CK18和CYP1A1的表达，但成肝脏样诱导后的两种细胞表达升高；免疫荧光染色显示，ADSCs在诱导第7天，诱导细胞在具有肝脏样细胞形态的同时表达肝细胞标志物ALB、CK-18、CK-19、AFP和CYP1A1，而未诱导细胞不表达肝细胞标志物。
实施例5
1、小鼠ADSCs的分离、提取与原代培养：
具体步骤同实施例1中该步骤；
2、传代与细胞培养；
原代分离的细胞接种72小时后，观察细胞生长状况，若细胞密度未达90％，则半量换液，延长培养一天后按1:2.5传代；
然后进行传代后接种，取对数生长的第4代细胞，以1×104/cm2的浓度进行传代后接种，置于5v/v％CO2、37℃下恒温培养箱中培养；培养基为含有DMEM+15v/v％FBS的培养基；
3、成肝脏样细胞诱导培养；
接种后24h观察细胞贴壁后，将培养基更换为成肝诱导培养基，每隔3.5天换一次成肝诱导培养基；成肝诱导培养基为含有25ng/mL FGF4、80ng/mL HGF、28ng/mL OSM、40ng/mL aFGF、18μmol/L Dex、160μmol/L VPP、8mmol/L Vc和1X胰岛素转铁蛋白硒的含7v/v％FBS的DMEM培养基；另外肝诱导培养基中还含有20ng/mL EGF；
4、成肝脏样细胞诱导；
成肝脏样细胞诱导培养13天，即诱导成肝脏样细胞。
经诱导后的成肝脏样细胞，进行RT-PCR检测、Western检测和免疫荧光染色，成肝脏样诱导至第10天，在成肝脏样诱导的ADSCs中检测到ALB、AFP、CK18、CK19和CYP1A1的表达，两种成体干细胞成肝脏样诱导后，Western Blot结果显示：未诱导的细胞和诱导的两种成肝脏样细胞均有ALB、AFP、CK18和CYP1A1的表达，但成肝脏样诱导后的两种细胞表达升高；免疫荧光染色显示，ADSCs在诱导第7天，诱导细胞在具有肝脏样细胞形态的同时表达肝细胞标志物ALB、CK-18、CK-19、AFP和CYP1A1，而未诱导细胞不表达肝细胞标志物。
实施例6
1、小鼠ADSCs的分离、提取与原代培养：
具体步骤同实施例1中该步骤；
2、传代与细胞培养；
原代分离的细胞接种72小时后，观察细胞生长状况，若细胞密度未达90％，则半量换液，延长培养一天后按1:3传代；
然后进行传代后接种，取对数生长的第4代细胞，以1×104/cm2的浓度进行传代后接种，置于5v/v％CO2、37℃下恒温培养箱中培养；培养基为含有DMEM+15v/v％FBS的培养基；
3、成肝脏样细胞诱导培养；
接种后24h观察细胞贴壁后，将培养基更换为成肝诱导培养基，每隔4天换一次成肝诱导培养基；成肝诱导培养基为含有45ng/mL FGF4、120ng/mL HGF、35ng/mL OSM、30ng/mL aFGF、10μmol/L Dex、120μmol/L VPP、7mmol/L Vc和1X胰岛素转铁蛋白硒的含6v/v％FBS的DMEM培养基；另外肝诱导培养基中还含有10ng/mL bFGF；
4、成肝脏样细胞诱导；
成肝脏样细胞诱导培养9天，即诱导成肝脏样细胞。
经诱导后的成肝脏样细胞，进行RT-PCR检测、Western检测和免疫荧光染色，成肝脏样诱导至第10天，在成肝脏样诱导的ADSCs中检测到ALB、AFP、CK18、CK19和CYP1A1的表达，两种成体干细胞成肝脏样诱导后，Western Blot结果显示：未诱导的细胞和诱导的两种成肝脏样细胞均有ALB、AFP、CK18和CYP1A1的表达，但成肝脏样诱导后的两种细胞表达升高；免疫荧光染色显示，ADSCs在诱导第7天，诱导细胞在具有肝脏样细胞形态的同时表达肝细胞标志物ALB、CK-18、CK-19、AFP和CYP1A1，而未诱导细胞不表达肝细胞标志物。
实施例7
1、小鼠ADSCs的分离、提取与原代培养：
具体步骤同实施例1中该步骤；
2、传代与细胞培养；
原代分离的细胞接种72小时后，观察细胞生长状况，若细胞密度未达90％，则半量换液，延长培养一天后按1:2传代；
然后进行传代后接种，取对数生长的第4代细胞，以1×104/cm2的浓度进行传代后接种，置于5v/v％CO2、37℃下恒温培养箱中培养；培养基为含有a-MEM+15v/v％FBS的培养基；
3、成肝脏样细胞诱导培养；
接种后24h观察细胞贴壁后，将培养基更换为成肝诱导培养基，每隔4天换一次成肝诱导培养基；成肝诱导培养基为含有30ng/mL FGF4、120ng/mL HGF、30ng/mL OSM、30ng/mL aFGF、15μmol/L Dex、150μmol/L VPP、6mmol/L Vc和1X胰岛素转铁蛋白硒的含8v/v％FBS的DMEM培养基；另外肝诱导培养基中还含有20ng/mL EGF；
4、成肝脏样细胞诱导；
成肝脏样细胞诱导培养8天，即诱导成肝脏样细胞。
经诱导后的成肝脏样细胞，进行RT-PCR检测、Western检测和免疫荧光染色，成肝脏样诱导至第10天，在成肝脏样诱导的ADSCs中检测到ALB、AFP、CK18、CK19和CYP1A1的表达，两种成体干细胞成肝脏样诱导后，Western Blot结果显示：未诱导的细胞和诱导的两种成肝脏样细胞均有ALB、AFP、CK18和CYP1A1的表达，但成肝脏样诱导后的两种细胞表达升高；免疫荧光染色显示，ADSCs在诱导第7天，诱导细胞在具有肝脏样细胞形态的同时表达肝细胞标志物ALB、CK-18、CK-19、AFP和CYP1A1，而未诱导细胞不表达肝细胞标志物。