一种降低小麦花药白苗率的培养基及其农杆菌转化方法与流程

本发明涉及遗传转化技术，特别是一种降低小麦花药白苗率的培养基及农杆菌转化方法。

背景技术：

农杆菌介导的遗传转化法是目前植物基因工程的常用方法，与基因枪转化等方法比较，农杆菌介导法具有简单易行，不需要昂贵的仪器设备，转基因多以单低拷贝整合进受体染色体，转基因植物后代的遗传较为稳定等特点，该方法在植物转基因研究方面一直受到普遍的重视和应用。迄今为止，媒介农杆菌法获得的转基因植物占转基因植物总数的85％左右。同时，将一些有利用价值的外源基因导入植物，并逐渐将转基因植物应用到农业生产中，转基因大豆、玉米、棉花、油菜等作物新品种在生产上的产业化面积逐年增加。

在粮食作物中，小麦属于遗传转化最为困难的作物，加上转基因研究起步较晚，基因工程育种进程明显落后于其他作物。自1992年Vasil等将GUS/Bar基因导入小麦获得首例转基因小麦以来，转基因小麦研究有了长足进展，农杆菌介导法一直被认为是小麦遗传转化的一道难关，然而Cheng等于1997年首次利用农杆菌介导法获得了正常的转基因小麦，随后国内外其它几个实验室例如Xia等、叶兴国等、王永勤等、Khanna等、夏光敏等也相继报告了农杆菌介导的小麦遗传转化。

目前为止，虽然对农杆菌法介导小麦遗传转化的研究有很多，大多以小麦幼胚、成熟胚为受体材料，以幼胚、成熟胚为受体材料获得的转基因株是一个外源基因杂合体，须经再自交2代选择才能获得外源基因纯合的个体，育种程序复杂。而以花药为受体材料进行遗传转化，不仅愈伤组织再生特型好，而且再生苗直接加倍后就可成为基因型纯合的稳定双倍体。尽管农杆菌介导小麦花药遗传转化具有其独特的优点，但是再生植株的白化现象极为普遍，白苗率一般约为40％，高的达80-90％，甚至全部为白苗，使得农杆菌介导的小麦花药不能获得足够数量的再生植株，远远不能满足依靠该遗传转化方法改良小麦的实际要求，限制了转基因小麦的规模化生产和小麦功能基因组研究的发展。因此，优化小麦花药愈伤组织诱导培养基，降低白苗率和初步建立的农杆菌转化方法，将对小麦转基因研究将有巨大的推动作用。

技术实现要素：

基于上述领域的空白和需求，本发明的目的是提供一种降低小麦花药白苗率的培养基及 小麦遗传转化方法。技术方案如下：

一种降低小麦花药白苗率的培养基，其特征在于配方如下：无水氯化钙150mg/L、硝酸钾1400mg/L、七水硫酸镁150mg/L、硝酸铵300mg/L、磷酸二氢钾400mg/L；硫酸锰8.5mg/L、硫酸锌8.6mg/L、硼酸6.2mg/L、碘化钾0.83mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L；硫酸亚铁27.85mg/L、乙二胺四乙酸钠37.25mg/L；甘氨酸1mg/L、VB1 0.5mg/L、VB6 0.25mg/L、烟酸0.25mg/L、生物素1mg/L、亮氨酸1mg/L、2，4-D 2mg/L、KT 0.5mg/L、水解乳蛋白500mg/L、PAA 0.5-10mg/L、秋水仙碱0.005-0.1mg/L、麦芽糖30-100g/L，琼脂3.7g/L。

上述培养基中，PAA的浓度优选为1mg/L、秋水仙碱的浓度优选为0.01mg/L、麦芽糖的浓度优选为90g/L。

一种农杆菌介导的小麦花药遗传转化方法，包括下述步骤：

(1)诱导培养：获得小麦花药愈伤组织，

(2)侵染：采用携带目标基因的农杆菌侵染步骤(1)获得的小麦花药愈伤组织，

其特征在于：所述诱导培养采用的培养基为权利要求1或2所述的培养基。

所述诱导培养的条件为：培养温度为27～30℃，黑暗条件下培养40-60天。

所述诱导培养采用的小麦花药采自发育至单核中-晚期的小麦幼穗,用10％的次氯酸钙消毒15min,然后用无菌蒸馏水冲洗。

所述浸染采用的侵染培养液配方为：硝酸钾190mg/L、硝酸铵165mg/L、磷酸二氢钾17mg/L、无水氯化钙44mg/L、七水硫酸镁37mg/L；碘化钾0.083mg/L、四水硫酸锰2.23mg/L、硼酸0.62mg/L、七水硫酸锌0.86mg/L、六水氯化钴0.0025mg/L、五水硫酸铜0.0025mg/L、二水钼酸钠0.025mg/L；硫酸亚铁2.785mg/L、乙二胺四乙酸钠3.725mg/L；甘氨酸2mg/L、VB1 0.4mg/L、VB6 0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L；麦芽糖40g/L、乙磺酸(MES)1.95g/L、谷氨酰胺0.1g/L、水解酪蛋白0.1g/L、葡萄糖10g/L、维生素C 100mg/L、4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸(Picloram)1mg/L、乙酰丁香酮(AS)39mg/L、pluronic F68 1ml/L。

所述侵染之后，还包括共培养、抗性愈伤组织恢复、分化培养、生根培养步骤；抗性愈伤组织恢复采用的培养基如下：硝酸钾1900mg/L、硝酸铵1650mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、无水氯化钙440mg/L、七水硫酸镁370mg/L；碘化钾0.83mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、硼酸6.2mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L；硫酸亚铁27.85mg/L、乙二胺四乙酸钠37.25mg/L；甘氨酸2mg/L、VB1 0.4mg/L、VB6 0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L；蔗糖30g/L,Phytagel 2.7g/L,Dicamba 2mg/L、羧苄青霉素250mg/L、PPT 3mg/L；

培养条件为：25℃黑暗条件下培养15-20天。

所述分化培养采用的培养基配方为：硝酸钾1900/L mg、硝酸铵1650mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、无水氯化钙440mg/L、七水硫酸镁370mg/L；碘化钾0.83mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、硼酸6.2mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L；硫酸亚铁27.85mg/L、乙二胺四乙酸钠37.25mg/L；甘氨酸2mg/L、VB1 0.4mg/L、VB6 0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L；维生素C 100mg/L、2，4-D 0.5mg/L、蔗糖30g/L、Phytagel 2.7g/L、羧苄青霉素250mg/L、PPT 3mg/L；

培养条件为：25℃条件下，每天光照12-14小时进行分化培养。

所述生根培养采用的生根培养基配方为：硝酸钾950/L mg、硝酸铵825mg/L、磷酸二氢钾85mg/L、无水氯化钙220mg/L、七水硫酸镁185mg/L；碘化钾0.83mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、硼酸6.2mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L；硫酸亚铁27.85mg/L、乙二胺四乙酸钠37.25mg/L；甘氨酸2mg/L、VB1 0.4mg/L、VB6 0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L；萘乙酸(NAA)1mg/L、多效唑3mg/L、蔗糖80g/L、Phytagel 2.7g/L、羧苄青霉素250mg/L；

培养条件为：愈伤组织分化出的抗性再生芽长至2-3cm左右时,将其转入所述生根培养基上进行壮根培养，当不定根长到3-4cm时，将试管苗转移至2-4℃冰箱中进行春化处理。

本发明通过对用于小麦花药的愈伤组织诱导培养基进行改进，从而使得愈伤组织诱导率和抗性植株的获得率得到提高，白苗率降低。试验数据表明，在其它培养条件完全一样的情况下，采用本发明的愈伤组织诱导培养基，小麦石4185的愈伤组织诱导率为83.4％，小麦冀5265的愈伤组织诱导率为78.2％；小麦石4185抗性植株的平均获得率为39.0％，小麦冀5265抗性植株的平均获得率为36.3％；小麦石4185的白苗率为25.4％，小麦冀5265的白苗率为23.5％。而采用现有技术中采用的C17为愈伤组织诱导培养基的，小麦冀5265的愈伤组织诱导率为49.7％，抗性植株获得率为20.3％，白苗率为46.5％。实验数据说明，本发明中，改良的愈伤组织诱导培养基在提高愈伤组织诱导率和抗性植株的获得率及降低白苗率方面起着决定性作用，因此，本发明请求保护改良的愈伤组织诱导培养基配方。

基于上述改良的愈伤组织诱导培养基，本发明进一步请求保护农杆菌介导的小麦花药遗传转化方法。该方法除采用的培养基为上述改良愈伤组织诱导培养基之外，其它步骤和产生可以是本领域技术人员采用的现有技术中常规的农杆菌介导的小麦花药遗传转化方法的步骤和参数。本发明实施例中所列的这些步骤和参数只是一种优选实施方式，对本发明的不具有限定作用。

本发明中，愈伤组织诱导率是指愈伤组织数占接种花药数的百分率，抗性植株的平均获得率是指抗性苗占愈伤组织数的百分率，白苗率是指白苗占愈伤组织数的百分率。

附图说明

图1为采用现有文献中的小麦花药愈伤组织诱导培养基对小麦冀5265的花药进行诱导培养的效果。

图2为采用本发明的小麦花药愈伤组织诱导培养基对小麦冀5265的花药进行诱导培养的效果。

图3为本发明培养基和转化方法对小麦冀5265的花药愈伤组织进行农杆菌侵染后的诱导抗性愈伤组织的培养效果。

图4为本发明培养基和转化方法转化小麦冀5265后的抗性愈伤组织的分化情况。

图5为本发明培养基和转化方法转化小麦冀5265后生根培养情况。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的实验方法如无特殊说明均为常规方法。

实施例1、农杆菌转化法转化小麦花药

一、培养基的配制和灭菌

1.MC17培养基，配方为每1000ml含：无水氯化钙150mg、硝酸钾1400mg、七水硫酸镁150mg、硝酸铵300mg、磷酸二氢钾400mg；硫酸锰8.5mg、硫酸锌8.6mg、硼酸6.2mg、碘化钾0.83mg、五水硫酸铜0.025mg、六水氯化钴0.025mg；硫酸亚铁27.85mg、乙二胺四乙酸钠37.25mg；甘氨酸1mg、VB1 0.5mg、VB6 0.25mg、烟酸0.25mg、生物素1mg、亮氨酸1mg、2，4-D 2mg、KT 0.5mg、PAA 1mg、秋水仙碱0.01mg、水解乳蛋白500mg、麦芽糖90g，琼脂3.7g。

配制方法如下：无水氯化钙150mg、硝酸钾1400mg、七水硫酸镁150mg、硝酸铵300mg、磷酸二氢钾400mg；硫酸锰8.5mg、硫酸锌8.6mg、硼酸6.2mg、碘化钾0.83mg、五水硫酸铜0.025mg、六水氯化钴0.025mg；硫酸亚铁27.85mg、乙二胺四乙酸钠37.25mg；甘氨酸1mg、VB1 0.5mg、VB6 0.25mg、烟酸0.25mg、、生物素1mg、亮氨酸1mg、2，4-D 2mg、KT 0.5mg、水解乳蛋白500mg、麦芽糖90g，定容1000ml，调节PH至5.8，再加入琼脂3.7g，以上成分采用121℃高压灭菌20分钟，待灭菌后的培养基温度降至65℃左右时加入过滤灭菌后的PAA 1mg、秋水仙碱0.01mg。

MC17培养基的特点是添加了PAA和秋水仙碱，用麦芽糖取代了蔗糖。

2.侵染培养基，配方为每1000ml含：硝酸钾190mg、硝酸铵165mg、磷酸二氢钾17mg、无水氯化钙44mg、七水硫酸镁37mg；碘化钾0.083mg、四水硫酸锰2.23mg、硼酸0.62mg、七水硫酸锌0.86mg、六水氯化钴0.0025mg、五水硫酸铜0.0025mg、二水钼酸钠0.025mg；硫酸亚铁2.785mg、乙二胺四乙酸钠3.725mg；甘氨酸2mg、VB1 0.4mg、VB6 0.5mg、烟酸0.5mg、肌醇100mg；麦芽糖40g、乙磺酸(MES)1.95g、谷氨酰胺0.1g、水解酪蛋白0.1g、葡萄糖10g、维生素C 100mg、4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸(Picloram)1mg、乙酰丁香酮(AS)39mg、pluronic F68 1ml。

配制方法如下：硝酸钾190mg、硝酸铵165mg、磷酸二氢钾17mg、无水氯化钙44mg、七水硫酸镁37mg；碘化钾0.083mg、四水硫酸锰2.23mg、硼酸0.62mg、七水硫酸锌0.86mg、六水氯化钴0.0025mg、五水硫酸铜0.0025mg、二水钼酸钠0.025mg；硫酸亚铁2.785mg、乙二胺四乙酸钠3.725mg；麦芽糖40g、乙磺酸(MES)1.95g，定容950ml,调节PH至5.4，以上成分采用121℃高压灭菌20分钟；均匀混合下面的几种成分：100×MS维生素 10ml(含VB1 0.4mg、VB6 0.5mg、烟酸0.5mg、肌醇100mg)、谷氨酰胺0.1g、水解酪蛋白0.1g、葡萄糖10g、维生素C 100mg、4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸(Picloram)1mg、乙酰丁香酮(AS)39mg、pluronic F68 1ml，定容50ml，过滤灭菌后加入上述高压灭菌后的培养基中。

3.抗性愈伤组织恢复培养基，配方为每1000ml含：硝酸钾1900mg、硝酸铵1650mg、磷酸二氢钾170mg、无水氯化钙440mg、七水硫酸镁370mg；碘化钾0.83mg、四水硫酸锰22.3mg、硼酸6.2mg、七水硫酸锌8.6mg、六水氯化钴0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、二水钼酸钠0.25mg；硫酸亚铁27.85mg、乙二胺四乙酸钠37.25mg；甘氨酸2mg、VB1 0.4mg、VB6 0.5mg、烟酸0.5mg、肌醇100mg；蔗糖30g,Phytagel 2.7g,Dicamba 2mg、羧苄青霉素250mg、PPT 3mg。

配制方法如下：硝酸钾1900mg、硝酸铵1650mg、磷酸二氢钾170mg、无水氯化钙440mg、七水硫酸镁370mg；碘化钾0.83mg、四水硫酸锰22.3mg、硼酸6.2mg、七水硫酸锌8.6mg、六水氯化钴0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、二水钼酸钠0.25mg；硫酸亚铁27.85mg、乙二胺四乙酸钠37.25mg；甘氨酸2mg、VB1 0.4mg、VB6 0.5mg、烟酸0.5mg、肌醇100mg、蔗糖30g,定容1000ml,调节PH至5.8，再加入Phytagel 2.7g,以上成分采用121℃高压灭菌20分钟，待灭菌后的培养基温度降至65℃左右时加入过滤灭菌后的Dicamba 2mg、羧苄青霉素250mg、PPT 3mg。

4.愈伤组织分化培养基，配方为每1000ml含：硝酸钾1900mg、硝酸铵1650mg、磷酸二氢钾170mg、无水氯化钙440mg、七水硫酸镁370mg；碘化钾0.83mg、四水硫酸锰22.3mg、 硼酸6.2mg、七水硫酸锌8.6mg、六水氯化钴0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、二水钼酸钠0.25mg；硫酸亚铁27.85mg、乙二胺四乙酸钠37.25mg；甘氨酸2mg、VB1 0.4mg、VB6 0.5mg、烟酸0.5mg、肌醇100mg；维生素C 100mg、2，4-D 0.5mg、蔗糖30g、Phytagel 2.7g、羧苄青霉素250mg、PPT 3mg。

配制方法如下：硝酸钾1900mg、硝酸铵1650mg、磷酸二氢钾170mg、无水氯化钙440mg、七水硫酸镁370mg；碘化钾0.83mg、四水硫酸锰22.3mg、硼酸6.2mg、七水硫酸锌8.6mg、六水氯化钴0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、二水钼酸钠0.25mg；硫酸亚铁27.85mg、乙二胺四乙酸钠37.25mg；甘氨酸2mg、VB1 0.4mg、VB6 0.5mg、烟酸0.5mg、肌醇100mg、维生素C 100mg、2，4-D 0.5mg、蔗糖30g,定容1000ml,调节PH至5.8，再加入Phytagel 2.7g,以上成分采用121℃高压灭菌20分钟，待灭菌后的培养基温度降至65℃左右时加入过滤灭菌后的羧苄青霉素250mg、PPT 3mg。

5.生根培养基，配方为每1000ml含：硝酸钾950mg、硝酸铵825mg、磷酸二氢钾85mg、无水氯化钙220mg、七水硫酸镁185mg；碘化钾0.83mg、四水硫酸锰22.3mg、硼酸6.2mg、七水硫酸锌8.6mg、六水氯化钴0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、二水钼酸钠0.25mg；硫酸亚铁27.85mg、乙二胺四乙酸钠37.25mg；甘氨酸2mg、VB1 0.4mg、VB6 0.5mg、烟酸0.5mg、肌醇100mg；萘乙酸(NAA)1mg、多效唑3mg、蔗糖80g、Phytagel 2.7g、羧苄青霉素250mg。

配制方法如下：硝酸钾950mg、硝酸铵825mg、磷酸二氢钾85mg、无水氯化钙220mg、七水硫酸镁185mg；碘化钾0.83mg、四水硫酸锰22.3mg、硼酸6.2mg、七水硫酸锌8.6mg、六水氯化钴0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、二水钼酸钠0.25mg；硫酸亚铁27.85mg、乙二胺四乙酸钠37.25mg；甘氨酸2mg、VB1 0.4mg、VB6 0.5mg、烟酸0.5mg、肌醇100mg；、萘乙酸(NAA)1mg、多效唑3mg、蔗糖80g，定容1000ml,调节PH至5.8，再加入Phytagel 2.7g,以上成分采用121℃高压灭菌20分钟，待灭菌后的培养基温度降至65℃左右时加入过滤灭菌后的羧苄青霉素250mg。

二、农杆菌转化法转化小麦花药

1、诱导培养

4月下旬小麦抽穗以前取材镜检。选取小麦花粉细胞发育至单核中—晚期的小麦幼穗,用10％的次氯酸钙消毒15min,然后用无菌蒸馏水冲洗3次,每次3min。在超净台上接种花药于MC17培养基上，28℃条件下暗培养诱导小麦花药愈伤组织。

小麦冀5265的花药进行诱导培养的效果如图2所示。小麦石4185的愈伤组织诱导率为 83.4％(愈伤组织诱导率是指愈伤组织数占接种花药数的百分率)，小麦冀5265的愈伤组织诱导率为78.2％。

2、侵染

将目的农杆菌的单菌落接种到YEP培养液中，28℃黑暗条件下250rpm震荡培养至OD值在0.6-1.0之间。然后将OD值在0.6-1.0之间的农杆菌于室温条件下4500rpm离心10min，收集沉淀重悬于侵染培养液中。将小麦花药的愈伤组织放入到重悬菌液中浸泡30min.期间轻轻晃动。

3、共培养

取出目的农杆菌侵染后的花药愈伤组织，置于无菌滤纸(少许侵染液)上，25℃黑暗条件下共培养2天。

4、诱导抗性愈伤组织

将共培养后的小麦花药愈伤组织置于抗性愈伤组织诱导培养基上，25℃黑暗条件下培养15-20天诱导抗性愈伤组织。

小麦冀5265的花药愈伤组织进行农杆菌侵染后的诱导抗性愈伤组织的培养效果如图3所示。

5、愈伤组织分化

将小麦花药的抗性愈伤组织转移到愈伤组织分化培养基上，25℃条件下，每天光照12-14小时进行分化培养。小麦冀5265后的抗性愈伤组织的分化情况如图4所示。

6、生根培养

从小麦花药抗性愈伤组织分化出的抗性再生芽长至2-3cm左右时,将其转入生根培养基上,进行壮根培养，当不定根长到3-4cm时，将试管苗转移至2-4℃冰箱中进行春化处理。小麦冀5265后生根培养情况如图5所示。

7、染色体加倍

将春化好的植株取出，彻底清除根部培养基，转移至土壤中培养，将小麦花粉植株移栽成活生长到分孽盛期时，在显微镜下通过保卫细胞长度来鉴别小麦花粉植株倍性，保卫细胞在65u以上的认为是双倍体无需加倍，65u以下的植株用0.75-1％的秋水仙碱与1.5％二甲基亚砜混合液在25℃条件下浸泡分蘖节4-5小时，花粉植株经染色体加倍后得到加倍纯合个体。

8、分子检测

用常规的分子检测技术对加倍纯合个体进行分子检测，筛选稳定的转基因纯合株。

试验结果：小麦石4185抗性植株的平均获得率为39.0％，小麦冀5265抗性植株的平均 获得率为36.3％；小麦石4185的白苗率为25.4％，小麦冀5265的白苗率为23.5％。

实施例2

本实施例与实施例1的步骤相同，区别在于本实施例的步骤1)诱导小麦花药愈伤组织的黑暗培养温度为30℃。

小麦冀5265的愈伤组织诱导率为87.4％，抗性植株获得率为25.1％，白苗率为35.2％。

实施例3

本实施例与实施例1的步骤相同，区别在于本实施例的步骤1)诱导小麦花药愈伤组织的培养基为已发文献中的常规诱导培养基C17(王培，陈玉蓉，提高冬小麦花粉植株诱导率的研究，华北农学报，1986，1(1)：20-25)。小麦冀5265的愈伤组织诱导率为49.7％，抗性植株获得率为20.3％，白苗率为46.5％。

本发明采用PAA取0.5-2mg/L、秋水仙碱0.005-0.05mg/L、麦芽糖30-100g/L的MC17作为愈伤组织诱导培养基进行了类似实施例1，2，3的试验，得出基本相同的结果，即本发明请求保护范围内的愈伤组织诱导培养基相对于常规诱导培养基C17，具有提高愈伤组织诱导率，抗性植株获得率，以及降低白苗率的效果。