一种获得胡麻转基因单倍体愈伤组织的高效方法与流程

技术领域

本发明涉及遗传转化方法技术领域，具体涉及一种获得胡麻转基因单倍体愈伤组织的高效方法。

背景技术：

胡麻（Linum usitatissimum L.）是油用和油纤兼用亚麻的俗称，属亚麻科亚麻属一年生草本植物，是我国西北和华北地区的重要油料作物。胡麻籽粒中富含多种不饱和脂肪酸，其中α- 亚麻酸含量达45～60%，是α-亚麻酸含量最高的油料作物。现有技术中，农杆菌介导的胡麻转基因研究多以下胚轴为受体，获得的转基因材料为杂合体，稳定慢，容易形成嵌合体。以胡麻花药为转基因受体，得到的转基因单倍体材料经染色体人工加倍，直接得到基因型纯合的个体，减少了嵌合体的产生几率，缩短育种周期。

技术实现要素：

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种获得胡麻转基因单倍体愈伤组织的高效方法。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种获得胡麻转基因单倍体愈伤组织的高效方法，包括以下步骤：

1）转化受体的建立：

采集单核靠边期的胡麻花药，通过花药培养诱导胚性愈伤组织，作为农杆菌侵染的受体，花药培养诱导胚性愈伤组织的方法为：取胡麻花蕾，置于4～6℃低温预处理3～7天，首先进行消毒，然后剥开花蕾，剥离花药接种于含YI固液培养基的三角瓶中，30℃黑暗条件下培养1天后，移至25℃光照条件下，培养20～25天，诱导胚性愈伤组织作为农杆菌侵染的受体；

2）农杆菌工程菌液的制备及侵染：

将含有外源基因的农杆菌C58c1单菌落接种于YEP液体培养基中，28℃、260 rpm 振荡培养18小时；然后以1:100 的比例用YEP液体培养基进行扩大培养；待菌液的浓度达到OD₆₀₀＝0.5～0.6 后，4℃、5000 rpm 离心5分钟收集菌体，将菌体重悬于1/2 MS液体培养基至OD₆₀₀＝0.5～0.6，将步骤1）得到的花药愈伤组织浸泡于上述制备的菌液中浸染15～30min；

3）受体与农杆菌共培养：

将步骤2）中经过农杆菌侵染后的受体用无菌滤纸吸干表面多余的菌液，然后平铺于共培养基上，25℃黑暗培养3～5天，以在培养基上看见农杆菌单个菌斑为止结束共培养；

4）转基因愈伤组织的诱导培养：

将步骤3）中共培养结束后的转化愈伤组织转接到选择诱导培养基， 25℃、光照强度100μEm^-2s^-1 16h与20℃、黑暗8h交替培养，每隔15d继代一次或转接至分化培养基。

进一步的，上述的一种获得胡麻转基因单倍体愈伤组织的高效方法，所述步骤1）中，所述YI固液培养基的组成由 MS + 6-BA 1.0～2.0 mg/L + 2,4-D 2.0～3.0 mg/L + 硫胺素1.0～10.0 mg/L + 6%蔗糖 + 200 mg/L水解酪蛋白 + 0.5 %琼脂的固体培养基（PH=5.8）30毫升与不含琼脂、其他成份相同的液体培养基（PH=5.8）5ml组成固液培养基。。

进一步的，上述的一种获得胡麻转基因单倍体愈伤组织的高效方法，所述步骤2）中，农杆菌C58c1菌株含有pCAMBIA3301表达载体，有35S:GUS基因和bar植物选择标记基因。

进一步的，上述的一种获得胡麻转基因单倍体愈伤组织的高效方法，所述步骤3）中，所述共培养基的组成为MS + 6-BA 1.0～2.0 mg/L + 2,4-D 2.0～3.0 mg/L + 硫胺素1.0～10.0 mg/L + 6%蔗糖 + 200 mg/L水解酪蛋白 + 0.5%琼脂，PH=5.8。

进一步的，上述的一种获得胡麻转基因单倍体愈伤组织的高效方法，所述步骤4）中，所述选择诱导培养基的组成为MS + 6-BA 1.0～2.0 mg/L + 2,4-D 2.0～3.0 mg/L + 硫胺素1.0～10.0 mg/L + 6%蔗糖 + 200 mg/L水解酪蛋白 + 0.5 % 琼脂+ 草铵膦（PPT）10 mg/L + 羧苄青霉素 250～500 mg/L，PH=5.8；分化培养基组成为MS + 6-BA 0.1～1.0 mg/L + 2 %蔗糖 + 0.5 % 琼脂+ 草铵膦（PPT）10 mg/L + 羧苄青霉素 250～500 mg/L，PH=5.8。

本发明的第二个目的是提供了采用上述的方法获得的胡麻转基因单倍体愈伤组织在功能蛋白的定位、启动子活性的检测、胡麻基因工程、细胞工程、代谢工程以及遗传转化体系相关研究中的应用。

本发明公开了一种以小孢子来源的胚性愈伤组织为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，通过本方法可以高效获得胡麻转基因单倍体愈伤组织。该方法具有以下特点：一、转化率很高。由于小孢子来源的胚性细胞接受外源DNA能力很强，是理想的基因转化的感受态细胞，而且这些细胞繁殖量大，同步性好，因此具有很高的转化率；二、小孢子来源的胚性细胞为受体获得的转化细胞为单细胞起源，遗传背景一致，转化获得的转基因植株嵌合体少，加倍后直接可作为纯系使用。

本发明的有益效果为：本发明建立了一种高效获得胡麻转基因单倍体愈伤组织的方法，发明实例中选用陇亚杂3号品种为例，对受体的制备、农杆菌侵染浓度、侵染时间和共培养时间、以及草铵膦选择压力都进行了系统研究，从而建立了一个简单、高效地获得胡麻转基因愈伤组织的转化体系。该体系适用于我国主栽胡麻优良品种，对杂交品种的效果更好。该体系与以往以下胚轴为受体的转化体系相比具有转化率高、转化受体背景一致，在功能蛋白的定位、启动子活性的检测、胡麻基因工程、细胞工程、代谢工程以及遗传转化体系的建立等相关领域有广泛的应用价值。

附图说明

图1为单核靠边期的胡麻花药。

图2为胡麻花药培养获得的胚性愈伤组织。

图3为胡麻花药愈伤组织与根癌农杆菌共培养。

图4为转化愈伤组织的草铵膦抗性筛选。

图5为转化愈伤组织的GUS染色结果（左：对照；右：转化愈伤组织）。

具体实施方式

实施例1：

实施例中，使用的MS基本培养基（Murashige and Skoog,1962）的构成和标准配方为（单位：mg/L）：NH₄NO₃ 1650, KNO₃1900, CaCl₂·2H₂O 440, MgSO₄·7H₂O 370, KH₂PO₄ 170, KI 0.83, H₃BO₃ 6.2, MnSO₄·4H₂O 22.3, ZnSO₄·7H₂O 8.6, Na₂MoO₄·2H₂O 0.25, CuSO₄·5H₂O 0.025, CoCl₂·6H₂O 0.025, FeSO4·7H2O 27.8, Na2-EDTA·2H2O 37.3, 肌醇100, 烟酸0.5, 盐酸吡哆醇（维生素B6）0.5, 盐酸硫胺素（维生素B1）0.1, 甘氨酸 2.0。

YEP 固体培养基配方：10 g/L Yeast extract，10 g/L Tryptone，5 g/L NaCl，琼脂7g/L，PH=7.0 。

YEP 液体培养基配方：10 g/L Yeast extract，10 g/L Tryptone，5 g/L NaCl，PH=7.0。

本实验所用农杆菌C58c1携带的质粒pCAMBIA3301为澳大利亚pCAMBIA公司馈赠，其中含有CaMV35S启动子驱动的GUS基因。

一、转化受体的建立：

如图1、2所示，采集陇亚杂3号（胡麻品种名）小孢子处于单核靠边期的花蕾，用无菌湿纱布包好，装入自封袋内放置于4～6℃预处理3～7 d。预处理结束后，用流水冲洗花蕾10～15分钟，75%乙醇清洗1分钟，2%次氯酸钠消毒10分钟，无菌水冲洗3～5次。剥开花蕾，取花药接种于含YI培养基的三角瓶中，30℃、暗培养1天后，移至25℃/20℃、16 h / 8 h培养20～30天，诱导胚性愈伤组织，作为农杆菌侵染的受体。

上述YI培养基组成为MS + 6-BA 1.0～2.0 mg/L + 2,4-D 2.0～3.0 mg/L + 硫胺素1.0～10.0 mg/L + 6%蔗糖 + 200 mg/L水解酪蛋白 + 0.5 %琼脂的固体培养基30毫升，不含琼脂、其他成份相同的液体培养基5ml， PH=5.8

二、农杆菌菌液制备：

将-70℃保存的带有pCAMBIA3301质粒的C58c1菌液在冰上融化，用接种环蘸取少量菌液，接种到含有适量抗生素（卡那霉素50 mg/L，利福平50 mg/L ，链霉素50 mg/L）的YEP 培养基上，将其置于28℃恒温培养箱中培养。

待其长出单菌落后，用灭过菌的枪头挑取单菌落接种到含有10 mL 加有适量抗生素的YEP 液体培养基的三角瓶中，28℃、260 rpm 振荡培养18 h左右。

吸取上述农杆菌菌液2mL，接种到含有50 mL加有适量抗生素（卡那霉素50mg/L，利福平50 mg/L ，链霉素50 mg/L）的YEP 培养基的三角瓶中，28℃、260 rpm 振荡培养。

待上述农杆菌培养到OD₆₀₀ 为0.5～0.6 时，取菌液于50 mL 离心管中，于5000 rpm，4℃离心5min，去除上清，收集菌体。

用含100μM乙酰丁香酮的 1/2 MS 液体继代培养基重悬上一步中收集的菌体两次后，将菌液浓度稀释至OD₆₀₀ 为0.5 左右。

三、侵染：

将上述稀释好的菌液摇匀，取培养的小孢子来源的胚性愈伤组织至于50 ml无菌烧杯中，吸取20 mL 稀释的菌液加入含有愈伤组织的烧杯中，静置15～30 min。吸出菌液，将侵染过的愈伤组织置于无菌滤纸吸干菌液，接种于共培养基，25℃暗培养3～5 d，以在培养基上看见农杆菌单个菌斑为止结束共培养，如图3所示。

上述步骤中共培养基配方为：MS+6-BA 1.0～2.0 mg/L +2，4-D 2.0～3.0 mg/L +VB1 1.0 mg/L～10.0 mg/L +蔗糖 60 g/L+水解酪蛋白200mg/l+琼脂5 g/L+ 100 μM乙酰丁香酮。

四、转基因愈伤组织的诱导：

将上述步骤中共培养结束后的愈伤组织转接至转化愈伤组织选择诱导培养基，25℃/20℃、16 h/8 h条件下培养，每隔15d继代一次。

上述步骤中转化愈伤组织选择诱导培养基配方为：MS+6-BA 1.0～2.0 mg/L +2,4-D 2.0～3.0 mg/L +VB1 1.0 mg/L～10.0 mg/L +蔗糖 60 g/L+水解酪蛋白200 mg/L+琼脂5 g/L+草铵膦（PPT） 10 mg/L +羧苄青霉素 250～500 mg/L。

转化愈伤组织的草铵膦抗性筛选结果如图4所示。

五、GUS 细胞学检测：

取上述抗性愈伤组织作为GUS染色材料，浸泡在染液中，于37℃保温2 h至过夜。

上述步骤中GUS 染液配方：

（1）50mmol/L 磷酸钠缓冲溶液（pH7.0）：A 液：称取NaH₂PO₄·2H₂O 3.12g 溶于无菌水，定容至100ml；B 液：称取NaH₂PO₄·12H₂O 7.17g 溶于无菌水，定容至100ml；取39ml A液与61ml B 液混合；

（2）染色液：7.1ml 50mmol/L 磷酸钠缓冲溶液，0.2ml 10mmol/L Na₂EDTA，0.2ml 5mmol/L K₄[Fe（CN）₆]，0.2ml K₃[Fe（CN）₆]，0.05ml 0.05%（v/v）Triton-100，2ml 20% 甲醇，0.25ml 0.5mg/ml X-Gluc。

取上述步骤中经过染色的抗性愈伤组织，肉眼或显微镜下观察，材料中的蓝色即为GUS 表达位点如图5所示，可见，外源基因已被高效转化。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。