一种小麦整体遗传转化的方法与流程

本发明涉及一种小麦遗传转化的方法，属于遗传工程技术领域，具体涉及一种小麦种子整体侵染转化的方法。

背景技术：

小麦（Triticun aestivum L.）是世界上最重要的粮食作物之一，也是人类重要的植物蛋白质来源，小麦的蛋白质含量约占谷物蛋白质的39%。小麦的种植面积和产量约占谷物种植面积的30%。小麦面粉约含70%-80%的淀粉、10%-15%的蛋白质、1%-2%的脂类及其他成分，小麦的蛋白质含量和质量在面粉加工和氨基酸营养品质方面起着重要作用。我国的小麦较国外的小麦蛋白质总量不低，但是在加工品质上有较大差别，只要是因为我国小麦蛋白亚基含量低。所以不论是从解决人类温饱问题还是提高小麦贮藏蛋白中的蛋白亚基含量，都迫切需要小麦品质改良。近几年来，基因工程技术的发展和完善，为小麦品种改良提供了一条新的途径。虽然单子叶植物遗传转化起步较晚，但是进展客观。相对水稻、玉米等单子叶植物，小麦的遗传转化一直相对落后。在1992年，Vasil等奖GUS/Bar基因导入到小麦中，获得了抗除草剂Basta的再生植株，宣告世界上首例转基因小麦问世，从这之后，单子叶植物的遗传转化成为了讨论和研究的热点。

育种亲本资源匮乏、周期长限制了通过传统育种培育性状优良的植物新品种。近年来植物基因工程的迅速发展为植物遗传育种提供了新手段。植物遗传转化的首次报道是在1983年，自此，转基因技术在植物遗传改良中被广泛应用。目前，通过这种新技术，已成功培育出许多植物新品种，其中很多已推广并投入生产，获得了巨大的经济和社会效益。利用基因工程技术育种，一般需要通过植物组织培养和特定的转基因方法，将外源基因导入目标植物以获得能表现出目的性状的转基因植株，从而培育出优良植物新品种。1985年，Vash第一次提出了在组织培养基础上利用遗传转化技术将特定的外源基因导入牧草的可行性，为利用基因工程技术改良牧草奠定了理论基础。自从1986年首例由农杆菌介导的小麦转化获得成功以来，小麦转基因研究己经取得了一定进展，包括增强对逆境的适应能力，对各种病虫害的抗性，改善营养品质，提高可消化性和产量等。在农杆菌转化法、电击法、微注射法、基因枪法等众多的植物遗传转化方法中，农杆菌介导转化法是目前研究最多、使用频率最高的方法之一。农杆菌所携带的目标基因能否成功转入到植物基因组中对后续实验有着重要影响。常规的农杆菌介导的植物遗传转化常选用的外植体为具有分生能力的细胞、幼嫩的组织、幼胚、茎尖及采取预培养等使细胞处于感受态的技术，这些都有利于转化率的提高。但这些方法转化效率较低、操作过程较繁琐、实验周期也较长。

技术实现要素：

针对上述不足，本发明的目的在于克服现有小麦遗传转化效率低、转化周期长及操作过程繁琐的难点，提供一种小麦种子整体侵染的方法，以提高小麦的转化效率。

本发明是按以下技术方案实现的：

一种小麦整体遗传转化的方法，该方法是采用小麦种子整体侵染的方法实现的，步骤包括：① 测成熟小麦种子的生理吸胀曲线，② 含有目标基因的根癌农杆菌培养，③ 小麦种子消毒灭菌，④ 结合小麦种子的生理吸胀曲线，将经灭菌的成熟小麦种子转入到A₆₀₀值为0.75-1.0的根癌农杆菌的菌液中振荡侵染10-12小时，⑤ 在25℃黑暗条件下共培养3天，⑥ 抗性植株的筛选，⑦ 抗性植株的生根培养，⑧ 转化植株炼苗及移栽。

以上所述的一种小麦整体遗传转化的方法，其中：

步骤① 所述的成熟小麦种子的生理吸胀曲线的方法是：取8份等量的成熟小麦种子，每隔2小时取1份浸泡到水中，分别浸泡0、2、4、6、8、10、12、14小时，记录小麦种子不发生损伤的吸胀停滞点为10-12小时；

步骤② 所述含有目标基因的根癌农杆菌培养的方法是：将根癌农杆菌接种于LB固体培养基平板上活化2次，之后挑取该菌株的单菌落接种到5 ml 含有 20 ug·ml^-1利福平和50 ug·ml^-1卡那霉素的LB液体培养基中，在温度26^oC、振荡转速160-200 rpm 的条件下，培养5-8小时，然后取1 ml 转接于50 ml 含有20 ug·ml^-1 利福平、50 ug·ml^-1卡那霉素和110 umol·L^-1乙酰丁香酮的LB液体培养基中，在温度26^oC、振荡转速160-200 rpm 的条件下，培养12-16小时后，A₆₀₀值为0.75-1.0备用；

步骤③ 小麦种子消毒灭菌的方法是：挑选饱满的小麦种子，纱布包裹，自来水快速冲洗干净后，用70%乙醇浸泡2分钟，再用0.1%升汞浸泡3-5分钟，期间不断搅拌，保证所有种子表面均达到灭菌效果，然后用无菌水洗涤5-6次，准备侵染用；

步骤④ 所述结合小麦种子的生理吸胀曲线，侵染小麦种子10-12小时的方法是：结合小麦种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟小麦种子转入到装有步骤 ② 制备好的根癌农杆菌菌液的无菌三角瓶中，农杆菌菌液量以刚浸没小麦种子为准，用封口膜封住瓶口，置于摇床中，在温度26^oC、振荡转速160-200 rpm 的条件下，振荡培养10-12小时；

步骤 ⑤ 所述的共培养的方法是：待步骤④ 侵染10-12小时后，从摇床中取出置于超净工作台内，倒掉菌液，加入无菌水冲洗3次，25℃黑暗条件下，共培养3天；共培养是在无菌水中加入110 umol·L^-1 乙酰丁香酮，pH值5.83-5.85组成；

步骤 ⑥ 所述筛选抗性植株的方法是：将经步骤⑤ 共培养的种子，转接到压力筛选培养1个月，获得抗性植株；压力筛选培养是由无菌水中加入250mg·L^-1 Cef和75-100 mg·L^-1 Kan组成；

步骤 ⑦ 所述抗性植株的生根培养的方法是：待步骤⑥ 筛选之后成活的抗性植株接种于生根培养基上进行生根及扩繁，置于光照强度为2000 lx，光照时间为12 day / 8 night 的人工气候箱中培养30-40天；生根培养基由1/2MS固体培养基加入 0.4 g·L^-1 活性炭和 250 mg·L^-1 Cef 和0-100 mg·L^-1 Kan组成；

步骤 ⑧ 所述转化植株炼苗及移栽的方法是：当步骤⑦ 获得的植株的根长达10 cm左右时，用镊子将苗夹出，移栽到花土中，移栽之后第1-2周内保持土壤湿度80%左右，且置于有一定光照的阴凉处，不可被阳光直射，2周后，栽入花盆中，温室培养。

以上所述的一种小麦整体遗传转化的方法中，各步骤中采用的培养基均用蒸馏水按常规方法配制。其中：

固体LB培养基是由：10g·L^-1 NaCl ，10g·L^-1 蛋白胨 ， 5g·L^-1 酵母浸膏和 15g·L^-1 琼脂组成，pH值7.0；液体LB培养基不加琼脂；

无菌水：将蒸馏水放在高压灭锅中，121℃，灭菌20min。

共培养培养：组成见步骤⑤。

压力筛选培养：组成见步骤⑥。

生根培养：组成见步骤⑦。

以上所述的一种小麦整体遗传转化的方法中：

步骤 ② 所述的根癌农杆菌为含有目标基因gus的根癌农杆菌菌株EHA105，该菌株在国家微生物菌种资源库的菌株保藏编号为NKCCMR NK 14.EHA105；

该菌株用于侵染小麦种子的菌液浓度优选A₆₀₀值为1.0。

步骤 ④ 所述的小麦种子吸胀的时间段为0-10小时，农杆菌浸泡侵染小麦种子时间优选9-10小时。

本发明具有以下积极的效果：

1、本发明首次采用成熟小麦种子作为实验材料、结合小麦种子生理吸胀不发生损伤的吸胀停滞点为10-12小时，所以在种子吸胀阶段用根癌农杆菌菌液侵染10-12小时，大大提高了转化效率，和转化植株的获得数量。

2、经过采用压力筛选培养基对抗性植株进行筛选，缩短了实验周期2-3个月，简化了实验过程，减少了转化后的鉴定工作量。

3. 本发明的方法操作简单实用，与显微注射法、电击法和其它农杆菌介导的方法相比，具有明显优势和突破性特点，对小麦基因工程的理论研究及遗传育种实践均具有重要意义。

附图说明

图1是转化的小麦经压力筛选培养基培养后，全部白化，确定为转化未成功的小麦植株，见白化苗。

图2是转化的小麦经压力筛选培养基培养后，有绿色苗存活，初步确定为转化成功的小麦植株，见绿色苗。

图3是转基因小麦经压力筛选获得的抗性植株，移栽后的正常生长。

图4是转基因的小麦植株叶片的gus基因检测结果，有蓝色斑点，证明小麦转化植株含gus基因。

图5是未转基因小麦叶片的gus基因检测结果，无蓝色斑点，证明为小麦原种，无基因转入。

具体实施方式

下面结合实施案例对本发明作进一步说明：

一、培养基的配制和灭菌

1、LB液体培养基的配制：分别称量10 g NaCl、10 g 蛋白胨和5 g 酵母浸膏放入到1 L三角瓶中，加入蒸馏水定容到1 L，溶解，调pH值到7.0，用封口膜封口，之后采用121^oC高压湿热灭菌20分钟，冷却后放在4^oC冰箱中，备用；

2、 LB固体培养基的配制：分别称量10 g NaCl、10 g 蛋白胨、5 g 酵母浸膏和15 g 琼脂放入到1 L三角瓶中，加入蒸馏水定容到1 L，溶解，调pH值到7.0，用封口膜封口，之后采用121^oC高压湿热灭菌20分钟，倒入无菌培养皿中，冷却后放在4 ^oC冰箱中，备用；

3、无菌水的制备：将蒸馏水加入到1 L三角瓶中，用封口膜封口，之后采用121^oC高压湿热灭菌20分钟，冷却，备用。

二、小麦种子的遗传转化

1、测成熟小麦种子的生理吸胀曲线

植物材料为紫花小麦种子，取8份（每份 200粒）的成熟小麦种子，每隔2小时取1份浸泡到水中，分别浸泡0、2、4、6、8、10、12、14小时，记录小麦种子不发生损伤的吸胀停滞点为10-12小时；

2、含有目标基因的根癌农杆菌培养

挑选含有目标基因gus的根癌农杆菌EHA105菌株，接种于LB固体培养基平板上活化2次；之后挑取该菌株的单菌落接种到5 ml 含有 20 ug·ml^-1 利福平和50 ug·ml^-1 卡那霉素的LB液体培养基中，在温度26^oC、振荡转速160-200 rpm 的条件下，培养5小时；然后取1 ml 转接于50 ml 含有20 ug·ml^-1 利福平、50 ug·ml^-1 卡那霉素和110 umol·L^-1 乙酰丁香酮的LB液体培养基中，在温度26^oC、振荡转速160-200 rpm 的条件下，培养12小时，至A₆₀₀值为1.0备用；

3、小麦种子灭菌

挑选饱满的小麦种子，纱布包裹，自来水快速冲洗干净后，用70%乙醇浸泡2分钟，再用0.1%升汞浸泡3-5分钟，期间不断搅拌，保证所有种子表面均达到灭菌效果，然后用无菌水洗涤5-6次，准备侵染用；

4、侵染

结合小麦种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟小麦种子转入制备好的根癌农杆菌菌液中，农杆菌菌液量以刚浸没小麦种子为准，用封口膜封住瓶口，置于摇床中，于温度26^oC、转速166 rpm的条件下振荡培养10小时；

5、共培养

浸泡侵染10-12小时后的小麦种子，从摇床中取出置于超净工作台内，倒掉菌液，加入无菌水冲洗3次，置于共培养培养基上，25℃黑暗条件下，共培养3天；

6、抗性植株的筛选

共培养3天后，取萌发的种子转接到压力筛选培养基（无菌水中加 250mg·L^-1 Cef 加75mg·L^-1 Kan ）上培养1.5-2个月，获得抗性植株，如附图1、2所示，图1中白化苗为无抗性植株，绿色苗有抗性植株；

7、抗性植株的生根培养

筛选之后成活的抗性植株长到2-3 cm时，将其进行切段扩繁，接种于生根培养基（无菌水中加 250 mg·L^-1 Cef加 0-100 mg·L^-1 Kan）上进行生根培养，置于光照强度为2000 lx，光照时间为12 day / 8 night 的人工气候箱中培养10天。

8、转化植株炼苗及移栽

当抗性植株的根长达到10 cm左右时，然后用镊子将苗夹出，移栽到花土中，移栽之后第1-2周内保持土壤湿度80%左右，且置于有一定光照的阴凉处，不可被阳光直射，2周后，栽入花盆中，在温室中培养，见附图3。

9、转基因植株的检测

通过Gus活性测定检测gus基因是否转化进入植物细胞。

配Gus染色液。

取阴性对照组和转化组的叶片浸泡在染色液中，抽真空5分钟，37^oC保温18小时。

取出材料，FAA固定液、95%乙醇各脱色2次，至阴性对照呈白色，见附图4。

肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为Gus表达位点，见附图5。

Gus染色液组成为：0.5 mM K₃[Fe(CN)₆]，0.5 mM K₄[Fe(CN)₆]，10 mM Na₂EDTA，0.1% Triton X-100，0.5 mg·mL^-1 氯霉素，0.5 mg·mL^-1 X-Gluc，50 mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）定容，0.22 um滤膜抽滤除菌。

FAA固定脱色液组成为：5% 甲醛，5% 乙酸，5% 乙醇，蒸馏水定容。