一种小麦整体遗传转化的方法与流程

技术特征：

1.一种小麦整体遗传转化的方法，该方法是采用小麦种子整体侵染的方法实现的，其特征在于：

所述方法的步骤为：

①称量浸泡不同时间段的成熟小麦种子的重量，测出成熟小麦种子的生理吸胀曲线；

② 含有目标基因的根癌农杆菌培养；

③ 小麦种子消毒灭菌；

④ 根据小麦种子的生理吸胀曲线，确定用根癌农杆菌菌液浸泡成熟小麦种子的时间为10-12小时；

⑤ 在25℃黑暗条件下，用无菌水培养3天；

⑥ 抗性植株的筛选，筛选抗性植株的压力筛选条件是：无菌水和250mg·L^-1 Cef和75-100 mg·L^-1 Kan组成；

⑦ 抗性植株的生根培养，抗性植株的生根培养是在加入250 mg·L^-1 Cef 和0-100 mg·L^-1 Kan组成；

⑧ 转化植株炼苗及移栽。

2.根据权利要求1所述的小麦整体遗传转化的方法，其特征在于：步骤①所述测成熟小麦种子的生理吸胀曲线的方法是：取8份等量的成熟小麦种子，每隔2小时取1份浸泡到水中，分别浸泡0、2、4、6、8、10、12、14小时，从水中取出种子，吸干种子表面的多余水分，称量各个浸泡时间对应的种子的重量，统计不同浸泡时间下小麦种子的重量变化，从而绘制出成熟小麦种子的生理吸胀曲线图，记录小麦种子吸胀时间段为0-10小时、不发生损伤的吸胀停滞点为10-12小时。

3.根据权利要求1所述的小麦整体遗传转化的方法，其特征在于：步骤②所述含有目标基因的根癌农杆菌培养的方法是：将发狠农杆菌接种于LB固体培养基平板上活化2次之后，挑取该菌株的单菌落接种到5 ml 含有 20 ug·ml^-1利福平和50 ug·ml^-1卡那霉素的LB液体培养基中，在温度26^oC、振荡转速160-200 rpm 的条件下，培养5-8小时，然后取1 ml 转接于50 ml 含有20 ug·ml^-1 利福平、50 ug·ml^-1卡那霉素和110 umol·L^-1乙酰丁香酮的LB液体培养基中，在温度26^oC、振荡转速160-200 rpm 的条件下，培养12-16小时后，至A₆₀₀值为0.75-1.0备用。

4.根据权利要求1所述的小麦整体遗传转化的方法，其特征在于：从步骤 测出的成熟小麦种子的生理吸胀曲线中可以直观看到成熟小麦种子的吸胀时间段（0-10小时）与吸胀停滞点（10-12小时处），因此，确定吸胀时间就是根癌农杆菌菌液浸泡侵染成熟小麦种子的时间（浸泡10-12小时），具体的实验操作是将经消毒灭菌的成熟小麦种子转入到装有步骤 ② 制备好的根癌农杆菌菌液的无菌三角瓶中，农杆菌菌液量以刚浸没小麦种子为准，用封口膜封住瓶口，置于摇床中，在温度26^oC，166 rpm的条件下，振荡培养10-12小时。

5.根据权利要求1所述的小麦整体遗传转化的方法，其特征在于：步骤 ⑤ 所述的共培养的方法是：待步骤④ 侵染10-12小时后，倒掉菌液，加入无菌水冲洗3次，25℃黑暗条件下，共培养3天。

6.根据权利要求1所述的小麦整体遗传转化的方法，其特征在于：步骤 ⑥ 所述筛选抗性植株的方法是：将经步骤⑤ 共培养的种子，转接到压力筛选溶液中培养1个月，获得抗性植株。

7.根据权利要求1所述的小麦整体遗传转化的方法，其特征在于：步骤 ⑦ 所述抗性植株的生根培养的方法是：待步骤⑥ 筛选之后成活的抗性植株，重新移到新的培养皿中，加入无菌水、250 mg·L^-1 Cef 和0-100 mg·L^-1 Kan；置于光照强度为2000 lx，光照时间为12 day / 8 night 的人工气候箱中培养7天。

8.根据权利要求1所述的小麦整体遗传转化的方法，其特征在于：步骤 ⑧ 所述转化植株炼苗及移栽的方法是：当步骤⑦ 获得的植株的根长达10 cm左右时，用镊子将苗夹出，移栽到花土中，移栽之后第1-2周内保持土壤湿度80%左右，且置于有一定光照的阴凉处，不可被阳光直射，2周后，栽入花盆中，温室培养。