水稻抽穗期基因HAF1的克隆及应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体是一个介导水稻抽穗期的基因HAF1的分离克隆、功能验证和应用。通过基因工程技术将该基因转化到水稻等植物内，能调控水稻等作物的抽穗期，从而决定水稻的生长习性和产量。

背景技术：

植物由营养生长向生殖生长的转换(水稻上表现为抽穗)是其生命周期中最为重要的生长发育过程之一。由于人们对不同植物的使用器官不一样，就要求植物具有合适的开花时间。如对毛竹而言延迟或避免其开花可以提高有用的营养器官部分的得率，提高经济效益。对水稻而言合适的开花时间对进行成功的有性繁殖进而获得更多的种子是必须的。如水稻引种中的“南种北移”不合适的其主要的原因是南方品种在北方生育期延长，抽穗延迟导致后期不能正常结实，产量下降。因此，通过基因工程手段调控植物的开花时间对指导作物品种的改良及品种推广具有重要的应用意义。

植物的开花时间受到环境因素和自身因素的共同影响。光周期是影响植物开花的重要环境因素之一，根据植物感受光周期的不同可以分为三类：长日照植物、短日照植物和日中性植物。长日照植物和短日照植物分别在长于和短于临界日长的条件下能促进开花，但日中性植物对日照长短不敏感。拟南芥作为一种长日照的模式植物，通过对大量的拟南芥开花突变体的研究鉴定出控制其开花的主要途径分别为：光周期途径、春化途径、自主开花途径和赤霉素途径。光周期途径和春化途径分别受光照时长和温度环境因素的影响，而自主开花途径和赤霉素途径主要决定于植物发育年龄及内源赤霉素水平等(Mouradov等，Control of flowering time:interacting pathways as a basis for diversity，Plant Cell,2002:S111-S130)。

水稻作为短日照的模式植物，其调控开花的途径与拟南芥相比具有保守性和特异性。如水稻中存在的OsGI-Hd1-Hd3a的途径与拟南芥中的GI-CO-FT途径具有保守性，其中Hd1(CO)在这条途径中发挥“承上启下”作用，能将上游节律钟的信号进行整合并传递给下游开花基因。CO蛋白在拟南芥的长日照条件下促进成花素FT的表达，而水稻Hd1基因具有双重功能：即在短日照条件下促进开花、长日照条件下抑制开花。已有研究发现Hd1的蛋白序列在水稻不同品种中广泛的多态性是决定水稻品种地域分布最主要的因素之一。由此可见，蛋白水平调控Hd1是影响水稻的适应性以及品种分布最主要的因素(Yano等，Hd1,a major photoperiod sensitivity quantitative trait locus in rice,is closely related to the Arabidopsis flowering time gene CONSTANS，Plant Cell 2000:2473-2483；Kojima等，Hd3a,a rice ortholog of the Arabidopsis FT Gene,promotes transition to flowering downstream of Hd1under short-day conditions.Plant Cell Physiol,2002:1096-1105；Hayama等，Adaptation of photoperiodic control pathways produces short-day flowering in rice,Nature,2003:719-722；Takahashi等，

Variations in Hd1proteins,Hd3a promoters,and Ehd1expression levels contribute to diversity of flowering timein cultivated rice,PNAS,2009:106:4555-4560)。除此之外水稻中还存在其特异调 控开花的基因，如Ehd1、Ghd7、RID1、Hd16等，它们在调控水稻抽穗期及决定品种地域分布亦有重要功能(Doi等，Ehd1,a B type response regulator in rice,confers short-day promotion of flowering and controls FT-like gene expression independently of Hd1,Genes Dev,2004:926-936；Xue等，Natural variation in Ghd7is an important regulator of heading date and yield potential in rice,Nature genetics,2008:761-767；Wu等，RID1,encoding a Cys2/His2-type zinc finger transcription factor,acts as a master switch from vegetative to floral development in rice,PNAS,2008:12915-12920；Hori等，Hd16,a gene for casein kinase I,is involved in the control of rice flowering time by modulating the day-length response,The Plant Journal,2013:36-46)。

E3泛素连接酶广泛参与到植物的生长发育、成花转换、激素信号响应、非生物胁迫等生命过程中。其发挥作用的途径在高等生物中具有保守性：即泛素激活酶(E1)在ATP存在时结合泛素分子随后将泛素分子传递到泛素结合酶(E2)，E2直接与泛素连接酶(E3)结合，E3对靶标底物进行泛素化修饰。根据泛素化程度不同可分为单泛素化修饰和多泛素化修饰，单泛素化修饰会影响靶标蛋白的定位，进而发挥调节功能。多泛素化修饰一般会被26S蛋白酶复合体识别并降解(Chen等,Plant E3Ligases:Flexible Enzymes in a Sessile World,Molecular Plant,2013:1388-404)。本发明采用T-DNA标签的技术在水稻中分离获得HAF1基因，该基因编码一个具有E3泛素连接酶活性的锌指蛋白，通过突变体表型分析、基因表达分析和基因功能验证实验表明HAF1基因能调控水稻抽穗期。

技术实现要素：

本发明的目的是分离、克隆一个调控植物开花期或/和抽穗期和的新基因HAF1及其编码蛋白，通过遗传转化方法将所述的基因HAF1转化到水稻植物体内，以调控水稻植物的开花期或/和抽穗期。

申请人将本发明克隆的调控水稻抽穗期的新基因命名为Heading date Associated Factor 1基因(简称HAF1基因)，所克隆的基因的核苷酸酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，也包括与SEQ ID NO：1所示的DNA序列有90％以上同源性的基因序列，也包括因插入、替代或缺失一个或多个碱基而产生的突变体等位基因或衍生物。本发明也包括SEQ ID NO：2所示的HAF1蛋白的氨基酸序列，及与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有90％同源性以上的氨基酸序列，也包括因插入、替代或缺失一个或多个氨基酸而产生的功能改变的蛋白或蛋白类似物。

本发明克隆的水稻HAF1基因的T-DNA插入失活突变体haf1在长短日照条件下表现为晚抽穗的表型(见实施例1)，并且抽穗期突变表型也与在HAF1基因座位的T-DNA插入共分离(见实施例1)。正常功能的HAF1基因转化该突变体后植株恢复正常的表型(见实施例2)。分子水平上已经证实水稻HAF1基因调控了水稻中已鉴定的开花基因如Ehd1、Hd1、Hd3a、RFT1，这些基因共同调控了水稻的开花过程(见实施例3)。生化水平证实水稻HAF1蛋白具有自泛素化活性即E3泛素连接酶活性(见实施例4)。

本发明提供了一种利用HAF1基因进行植物遗传转化从而改变植物开花时间的核苷酸序列和蛋白质序列。具体地说，本发明提供了一种含有所示SEQ ID NO：1序列的基因或该基因的部分类似功能片段的载体，如图3中的A图和图8所示的pC2301-HAF1(其来源参见实施例1所示)。

本发明克隆的水稻HAF1基因可用于与其它调控元件，如组成型启动子(如CaMV35S启动子)或器官特异性启动子融合构建基因表达载体；通过转基因技术、反义RNA、RNAi、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas系统等技术调控植物的开花特性(即提早开花、延迟开花等功能)，运用于改变品种的生育期、提高品种的地域适应范围、提高作物的产量等。

实现本发明的具体技术步骤如下：

1.利用已有的水稻T-DNA插入突变体库(突变体库的创建方法已经公开发表，见论文，Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome.Plant J,2003:418-427；Zhang等，Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels of the genome hierarchy as revealed by analyzing13,804T-DNA flanking sequences from an enhancer-trap mutant library.Plant J,2007:947-959)筛选得到一个晚抽穗的突变体，申请人将该突变体命名为水稻突变体种子HAF1-010001，Oryza Sativa L.HAF1-010001，于2015年6月12日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO：P201509，该突变体的筛选鉴定方法见实施例1的第1部分。

2.统计分析了水稻野生型(中花11)和haf1突变体在长日照(14小时光照/10小时黑暗)和短日照(10小时光照/14小时黑暗)条件下的抽穗期，结果表明在长日照条件下野生型抽穗期为62.54±1.40天，haf1突变体抽穗期为83.40±5.64天，突变体比野生型晚抽穗约21天；在短日照条件下野生型抽穗期为53.73±3.61天，haf1突变体抽穗期为70.62±4.33天，突变体比野生型晚抽穗约17天(实施例1第1部分)。

3.采用TAIL-PCR方法(Zhang等，Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels of the genome hierarchy as revealed by analyzing 13,804T-DNA flanking sequences from an enhancer-trap mutant library.Plant J,2007:947-959)分离haf1突变体的侧翼序列，通过序列分析显示T-DNA插入HAF1基因ATG上游的1,660bp处(实施例1第2部分)。

4.通过T-DNA插入与突变性状的共分离验证(参见实施例1第3和第4部分)及功能互补实验(参见实施例2)证明本发明获得的候选基因HAF1的失活是引起haf1晚抽穗突变表型的原因。

5.利用定量RT-PCR技术分析野生型和haf1突变体植株中HAF1基因及抽穗期相关调控基因的表达(见实施例3)。

6.利用生物信息学(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析HAF1蛋白，含有一个典型的C3HC4型RING finger结构域(见图5中A图，B图)。根据功能预测利用原核表达的HAF1融合蛋白通过体外自泛素化实验证实HAF1具有E3泛素连接酶活性(见实施例4)。

7.通过体外pull-down实验表明HAF1与Hd1存在互作，进一步在蛋白水平证明HAF1对Hd1存在翻译后泛素化降解调控作用(见实施例5)。

附图说明

下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明作限定。

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的HAF1基因组的核苷酸序列，序列长度为3697bp。

序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆的HAF1基因编码的蛋白质序列，编码667个氨基酸。

图1：是不同日照条件下的水稻晚抽穗突变体haf1的突变表型。附图标记说明：

图1中的A图：是长日照条件下水稻haf1突变体和野生型(中花11，又称ZH11,下同)的抽穗期比较：左为野生型，右为haf1突变体。

图1中的B图：是短日照条件下haf1突变体和野生型的抽穗期比较：左为野生型，右为haf1突变体。

图1中的C图：是长短日照条件下haf1突变体和野生型的抽穗期统计结果。

图1中的D图：是长日照条件下haf1突变体和野生型的出叶速率统计结果。

图1中的E图：是短日照条件下haf1突变体和野生型的出叶速率统计结果。

图2：是本发明的水稻HAF1基因的分子鉴定结果。附图标记说明：

图2中的A图：是本发明克隆的HAF1基因的结构和T-DNA插入位点分析图。其中起始密码(ATG)和终止密码(TGA)均标出，黑色方框表示HAF1基因的外显子，方框之间的线条表示内含子，T-DNA插入在ATG前1660bp。LB和RB分别代表插入突变体T-DNA的左边界和右边界：

图2中的B图：根据插入位点设计PCR引物检测共分离示意图。其中P1，P2，P3分别表示用来检测共分离的引物。M代表T-DNA插入位点纯合植株，H代表T-DNA插入位点杂合植株，W代表野生型植株。

图3：是本发明的HAF1基因功能互补实验结果图。

图3中的A图：是互补载体pC2301-HAF1结构示意图。

图3中的B图：是用pCAMBIA2301载体上一段特异的片段做探针检测了部分抽穗期恢复单株的拷贝数。

图3中的C图：挑选了4个单拷贝单株(T1-34、T1-62、T1-94及T1-104)考察其T₁代的抽穗期。

图3中的D图：是T1代互补转基因阳性植株与对照在长短日照条件下的抽穗期结果比较图。

图4：是长日照和短日照条件下haf1突变体和野生型植株中抽穗期基因的表达分析。附图标记说明：UBQ作为内源对照基因，空心圆和实心圆分别代表haf1突变体和野生型，线框黑色和白色分别代表黑暗和光照条件。

图5：是本发明HAF1的蛋白结构、结构域分析及自泛素化实验结果。附图标记说明：

图5中的A图：是HAF1蛋白结构的示意图，在620aa-660aa位置存在RING finger结构域。

图5中的B图：是HAF1的氨基酸序列，红色星号标注出RING finger结构域属于C3HC4类型。

图5中的C图：是HAF1的自泛素化活性检测。

图6：是本发明的HAF1泛素化降解抽穗期基因Hd1。附图标记说明：

图6中的A图：pull-down实验证实HAF1与Hd1互作。

图6中的B图：HAF1对Hd1的体外泛素化检测。

图6中的C图：HAF1通过泛素复合体途径降解Hd1。

图6中的D图：HAF1突变体(haf1)相比野生型(中花11号)中Hd1蛋白累积。

图7：是pCAMBIA2301空载体图谱。

图8：是本发明构建的互补载体pC2301-HAF1图谱。

图9：是本发明构建的表达融合载体MBP-HAF1图谱。

图10：是pMAL-c2X空载体质粒图谱。

图11：是pEASY-T3载体图谱。

图12：是GST-Hd1载体图谱。

具体实施方式

实施例1:HAF1基因的分离克隆

1、晚抽穗突变体的获得

本发明所鉴定的突变体来自水稻T-DNA插入突变体(突变体库的创建方法参见论文：Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome，Plant J(2003)：418-427；Zhang等，Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels of the genome hierarchy as revealed by analyzing 13,804T-DNA flanking sequences from an enhancer-trap mutant library，Plant J(2007)：947-959)。突变体的筛选鉴定方法是：从上述水稻T-DNA插入突变体库(见http://rmd.ncpgr.cn/)中将T0代转基因水稻种子，经过常规的浸种、催芽程序后种植于大田后得到每个T₁代家系共20棵植株，植株按5寸×8寸的间距种植于武汉华中农业大学的试验田(长日照条件，日照长度12-14小时)，按常规的水稻种植方法进行田间管理。正常水稻品种“中花11号，或称ZH11”(为中国农业科学院作物科学研究所培育的常用水稻品种)大约70天左右抽穗(发芽后的天数)，其中鉴定出一个晚抽穗的突变体(见图1中的A图和图1中的B图)，申请人把这个突变体命名为heading date associated factor 1(简称水稻haf1)。为对haf1晚抽穗的表型进行确定，将野生型(中花11号，又称ZH11)和突变体植株分别种植在长日条件(14小时光照/10小时黑暗)和短日条件(10小时光照/14小时黑暗)下统计抽穗期。结果表明，在长日条件下，野生型植株抽穗期为62.54±1.40天，haf1突变体植株抽穗期为83.40±5.64天，突变体比野生型晚抽穗约21天，方差分析显示差异非常显著(p＝6.17×10^-10<0.01)(如图1中的C图)。在短日条件下，野生型抽穗期为53.73±3.61天，haf1突变体抽穗期为70.62±4.33天，突变体比野生型晚抽穗约17天，方差分析显示差异非常显著(p＝3.36×10^-8<0.01)(如图1中的C图)。

同时考察haf1突变体晚抽穗的突变表型是否由生长速率减缓造成的，从发芽到抽穗为止每天记录各单株的叶片数，统计各单株的叶片出叶速率，统计结果显示，野生型在长日和短日条件下总计形成的叶片数分别是12.69±0.75和10.92±0.67片叶片，突变体在长日和短日条件下总计形成的叶片数分别是13.80±0.94和12.14±0.53片叶片。长日条件下，突变体比野生型多长1.1片叶片；短日条件下，突变体比野生型多长1.2片叶片。统计显示在抽穗前突变体和野生型每天生长的叶片数相同，即突变体和野生型生长速率是相同的(见图1中的D图和E图)。表明haf1突变体在两种光周期下的晚抽穗，不是由于植株速率减慢造成的，而是由于成花转化时间延迟造成的。

2、分离haf1突变体T-DNA插入位点的侧翼序列

利用Tail-PCR技术(参照Zhang等，Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels of the genome hierarchy as revealed by analyzing 13,804T-DNA flanking sequences from an enhancer-trap mutant library，Plant J(2007)：947-959所示方法和步骤)分离了haf1突变体T-DNA插入位点的侧翼序列。经过序列分析发现，该侧翼序列定位于水稻第4染色体上，其对应TIGR网站(www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/index.shtml)中的基因(登录号：LOC_Os04g55510)，预测该基因为C3HC4类型锌指蛋白家族的一个成员。本发明将该基因命名为Heading date Associated Factor 1(简称HAF1)。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，它包括七个外显子和六个内含子，T-DNA插入HAF1基因ATG上游的1,660bp处(见图2中的A图)。

Tail-PCR技术分离得到的haf1突变体T-DNA插入位点的侧翼序列如下：

ACCCTTTTATAGAAGGAAAGGTCTTGCGAAGTTTAACTATCAGTGTTTGAAGTGGCTGTTTCAGAGGCGATTTTTTTTCTCTCCATGAGAACAAATTATTTGTGTCATTTGTGTGTTTGTGTGGCCTTTTTTATAGGTCTATGCGGGTGCTTGGAATGCTTTGCCGCTTTACTGATGGAGCTCGTGCTATGTGGAGTACTTGGCAGGAGAATATACGGCTGGAATGCCCTTGGCCCGGCTAGCTATGCCATTTTGCTTTACTTTCCCTCTTCTTCCTCCATCTCAGTTTGGATTGGATTCTCTGATCTTTAGCAACCCTCTTTACCATGGTTGCTTTGGGCTAAATTGCGTAAAGAACCTCGGCTGCAGACTACCTCCTCATTGGGTTCAAATAAAAAAAAAGTGGGCAAATTTCCATCCGGGTCATCAAAAGCCAAGGCGGTTTTTAAAAAACCATATCGTTGGGGGAAGTTAAAGTTCTT ACAGAGTGTATCTAAGGAGACCAAGGAGCGGCCGGAAC

3、T-DNA插入与突变表型的共分离检测

为了检测haf1突变体中的T-DNA插入与其突变表型是否共分离，本发明从23株T₁代单株中抽提总DNA用作PCR反应模板，该DNA抽提的方法为CTAB法(参照Liu等，A genome-wide analysis of wide compatibility in rice and the precise location of the S5locus in the molecular map，Theor Appl Genet(1997)：809-814)。根据haf1突变体T-DNA插入位点的侧翼序列与水稻基因组的匹配情况，确定插入位点，在插入位点的两边设计一对引物：P1(AAGCACCTCAATCCAACACG)和P2(ACCACTGCGCTGCGACATA)，及T-DNA上设计一条引物P3(ATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCAT)(见图2中的A图)。引物P1、P2和P3用于PCR反应。PCR反应条件是：先94℃变性5分钟，然后94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1.5分钟，总共进行30个循环。在T1分离后代群体中，T-DNA插入位点纯合时只有P1和P3配对可以扩增出目标产物，因为P1与P2在插入的T-DNA区段两侧，导致P1与P2配对的扩增产物太大(大于10kb)无法得到扩增片段；没有T-DNA插入的野生型植株由于没有T-DNA的插入，所以P1和P3配对扩增没有产物，但可以利用引物P1与P2配对得到目标产物；而T-DNA插入位点杂合的植株则P1和P2配对以及P1和P3配对时都可以扩增得到产物。实验结果显示，23株T₁代单株中，5株晚抽穗的突变体植株为均为HAF1位点纯合的T-DNA插入突变体植株，而其他18株表型正常的植株基因型为野生型或杂合型(如图2中的B图)。这表明haf1突变体是由于T-DNA插入造成的隐性开花突变体。

4、HAF1基因的分离克隆

用BglII单酶切(BglII购自宝生物工程大连有限公司公司)酶切“日本晴”(一个普遍应用的日本水稻粳稻品种)BAC克隆水稻OSJNBa0010D21(美国亚利桑那大学Rod Wing教授惠赠。http://ag.arizona.edu/pls/faculty/wing.htm)后，回收包括整个HAF1基因区段及ATG前约2877bp和终止密码后约2952bp的总共约11.51kb大小的目标片段，然后与用BamHI(BglII与BamHI为同尾酶)酶切后的载体质粒pCAMBIA2301(购自CAMBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)用T4连接酶连接(T4连接酶购自Promega公司，具体用法与用量参考该公司产品的说明书)。连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，本发明所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自Promega公司)中，加400μl LB培养基复苏45分钟，涂于含50mg/L的卡那霉素、20mg/L的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)及20mg/L的IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)的LA培养基平板上，37℃温箱培养14-16小时(LA与LB配方参考上述《分子克隆实验指南》)。挑取单克隆，扩大培养并抽提质粒，通过PCR筛选阳性克隆、酶切验证及测序验证后的质粒命名为互补载体pC2301-HAF1图(见图3中的A图及图8)。

实施例2：功能互补实验验证

1、互补载体的构建

利用实施例1中构建的互补载体为pC2301-HAF1(见图3中的A图及图8)，把构建好的载体电转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(购自CAMBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)菌株中。

2、遗传转化

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome.2003,Plant J.35:418-427)将互补菌株导入haf1突变体的愈伤组织，经过预培养、侵染、共培 养、筛选具有G418(购自北京原平皓生物技术有限公司)抗性的愈伤组织、分化、生根及炼苗移栽大田得到转基因植株(农杆菌介导的遗传转化试剂及配方见申请人已经公开的专利，专利名称为：水稻木质素合成基因FC1及应用，申请号：200610018105.5；公开号：CN1995346)。按照相同的遗传转化方法将空载体pCAMBIA2301导入haf1突变体的愈伤组织，得到的转基因植株作为阴性对照。

本发明研究结果显示，将本发明构建的互补载体pC2301-HAF1(见图8)通过农杆菌介导的方法转化导入haf1突变体的愈伤组织，共获得独立互补转化苗175株，其中112株阳性植株抽穗期全部恢复正常；获得的转空载体的转化苗18株，全部表现晚抽穗的突变表型(如图3中的B图)。以上结果表明haf1的晚抽穗突变表型是由于HAF1基因突变而造成。为了检测互补苗子的转基因拷贝数，本发明随机选取38份T0代互补转基因植株，利用Southern杂交(具体操作参考：Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome.2003,Plant J,35:418-427)分析了这些互补转基因植株的拷贝数。结果显示，其中有14份互补转基因植株为单拷贝插入(如图3中C)。大田种植随机挑选的4份单拷贝家系的T1代苗子(T1-34、T1-62、T1-94及T1-104)，其中转基因阳性植株育性均为正常，而转基因阴性植株均表现为不育(如图3中的D图)。这些研究结果进一步表明haf1突变体的突变表型确定是由于HAF1基因的突变而造成的。

实施例3:HAF1调控已知的抽穗期相关调控基因

为了分析HAF1基因调控水稻开花的分子机制，本发明利用定量RT-PCR技术检测相关抽穗期调控基因在野生型(中花11号)和haf1突变体植株中的表达。结果如图4所示，无论在长日照(16小时光照/8小时黑暗)还是短日照(8小时光照/16小时黑暗)条件下HAF1基因的表达节律性都是在晚上表达逐渐升高达到峰值，在白天逐渐降低，傍晚时达到低谷但在haf1突变体中，HAF1基因的表达量明显降低(如图4中的A图和B图)。通过检测节律钟基因OsGI(LOC_Os01g08700)的表达，发现在野生型和haf1突变体中OsGI的表达没有差异表明HAF1不受节律钟的调控(如图4中的C图和D图)。随后检测已报道的水稻抽穗期基因Hd1(LOC_Os06g16370)、Ehd1(LOC_Os10g32600)、Hd3a(LOC_Os06g06320)和RFT1(LOC_Os06g06300)在野生型和haf1突变体中的节律性表达。结果表明在长短日条件下，Hd1的转录水平下降，但主要是在晚上表达量明显降低，白天下降不明显(如图4中的E图和F图)。Ehd1的表达水平受到明显的抑制(见图4中的G图和H图)。RFT1、Hd3a不论在长日或短日条件下在haf1突变体背景下表达明显下降(见图4中的I图和J图)，该结果与HAF1突变导致晚抽穗的表型相一致。综上所述，在长短日条件下，HAF1在开花调控相关基因Ehd1、Hd1、Hd3a、RFT1的上游发挥作用。

植物组织总RNA样抽提、反转录和定量RT-PCR实验具体步骤参照Huang等的实验方法进行(Huang等，Down-regulation of a SILENT INFORMATION REGULATOR2-related histone deacetylase gene,OsSRT1,induces DNA fragmentation and cell death in rice，Plant Physiol，2007:1508-1519)。具体步骤如下：(1)RNA材料准备：挑选约500株HAF1家系杂合型单株的种子播种于小钵中。播种10天后，取每个单株约3厘米叶片抽提总DNA，并利用PCR方法检测每份单株的基因型(具体操作方法参见实施例1中3、T-DNA插入与突变表型的共分离检测)。DNA抽提及PCR检测每份单株的基因型方法同实施例1。分别将纯合基因型和野生型(基因型的检测方法参照实施例1中3、T-DNA插入与突变表型的共分离检测)的单株移栽到小钵至播种后28天，然后转移到人工培养生长箱中继续培养。对于短日照处理的水稻植株RNA样品，短日照条件(8小时光照/14小时黑夜；28℃；75％湿度)下生长7天后，然后连续取样2天，每隔4个小时取倒二叶叶片样品，每份RNA样品各取3个生物学重复。对于长日照处理的RNA样品，长日照条件(16小时光照/8小时黑夜；28℃；75％相对湿度)下生长7天后，然后连续取样2天，每隔4个小时取倒二叶 叶片样品，每份RNA样品各取3个生物学重复。(2)抽提样品RNA及反转录，定量RT-PCR在ABI7500定量PCR system(Applied Biosystems,美国)上进行，采用2^-△CT相对定量的方法进行表达量的比较。25μL反应体系包含：1μL反转录产物，12.5μL SYBR○R Premix EX Taq^TM(Takara)，0.5μl Rox Reference Dye II(Takara)及0.2μM引物。反应参数设置如下：95℃/10sec；95℃/5sec，60℃/40sec，50cycles。所有定量RT-PCR引物参见表2。

表2本发明中使用的定量RT-PCR引物

实施例4：HAF1具有自泛素化活性的验证

通过生物信息学(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测分析了HAF1蛋白的结构，表明其含有一个典型的C3HC4型RING finger结构域(见图5中的A图，B图)。为了进一步验证HAF1的生化功能，本发明构建了一个原核诱导表达融合载体命名为MBP-HAF1(见图9)，并通过电转化法(电转化仪为eppendorf公司产品，本发明所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)转入大肠杆菌表达菌株BL21(购自Transgen公司)中，在温度为16℃，转速为160rpm，TPTG浓度为0.1mM诱导表达10小时，收集菌体并纯化融合蛋白(Amylose Beads购自New England Biolabs公司，蛋白纯化操作参照该公司产品的说明书)。体外自泛素化实验具体步骤参照Xia等的实验方法进行(Xia等，The ubiquitin receptor DA1interacts with the E3ubiquitin ligase DA2to regulate seed and organ size in Arabidopsis,Plant Cell,2013:3347-3359)。

载体MBP-HAF1构建方法如下：以HAF1的cDNA克隆AK071468(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)作为模板，通过引物MBP-HAF1-F(5’-aaaGAATTCATGCAAGGACAGAAGAAC-3’)和MBP-HAF1-R(5’-aaaAAGCTTAAGACTTCAGAGCAGTA-3’，下划线表示酶切位点)PCR扩增出HAF1基因的CDS。利用pEASY-T3 Cloning Kit试剂盒(购自Transgen公司)将该目标片段克隆到pEASY-T3载体(见图11)，经测序正确后，用EcoRⅠ和HindⅢ酶切上述新构建的载体和pMAL-c2X(见图10)分别获得外源片段与空载体，用T4连接酶连接(T4连接酶购自Promega公司，具体用法与用量参考该公司产品的说明书)。连 接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，本发明所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自Promega公司)中，挑取单克隆，扩大培养并抽提质粒，酶切验证后的质粒命名为MBP-HAF1(见图9)。将MBP-HAF1质粒和pMAL-c2X(见图10)空载体质粒通过热激法转入到表达菌株BL21中(购自Transgen公司，具体用法与用量参考该公司产品的说明书)。随后挑取单克隆培养至OD(600nm)值为0.5-0.6时，在温度为16℃，转速为160rpm，TPTG浓度为0.1mM诱导表达10小时，收集菌体并纯化融合蛋白(Amylose Beads购自New England Biolabs公司，蛋白纯化参考该公司产品的说明书)。体外自泛素化实验具体步骤参照Xia等的实验方法进行(Xia等，The ubiquitin receptor DA1interacts with the E3ubiquitin ligase DA2to regulate seed and organ size in Arabidopsis,Plant Cell,2013:3347-3359)。结果表明只有在E1，E2，His-ubi都存在的情况下，MBP-HAF1能对自身进行泛素化并且作为阴性对照的MBP蛋白没检测到泛素化活性，即表明HAF1在体外具有自泛素化活性(如图5中的C图)。

实施例5：HAF1对Hd1的泛素化降解过程验证

Hd1的同源基因CO(AT5G15840)在拟南芥中调控开花存在翻译后修饰尤其是泛素化调控过程，并且HAF1具有E3泛素连接酶活性。为了验证HAF1与Hd1的关系，本发明构建了2个原核诱导表达融合载体分别命名为融合载体MBP-HAF1(见图9)(构建过程同实施例4)和融合载体GST-Hd1(见图12)，融合载体GST-Hd1构建方法如下：以水稻叶片的总cDNA作为模板，通过引物GST-Hd1-F(5’-aaaGGATCCATGAATTATAATTTTGGTGGCAACGTG-3’)和GST-Hd1-R(5’-aaaCTCGAGTCAGAACCATGGAACAGTACCATAGCTACC-3’，其中引物序列中的下划线表示酶切位点)PCR扩增出HAF1基因的CDS。利用pEASY-T3 Cloning Kit试剂盒(购自Transgen公司)将该目标片段克隆到pEASY-T3载体，经测序正确后，用BamHⅠ和XhoⅠ酶切上述新构建的载体和pGEX-4T-1分别获得外源片段与空载体，用T4连接酶连接(T4连接酶购自Promega公司，具体用法与用量参考该公司产品的说明书)。连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，本发明所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自Promega公司)中，挑取单克隆，扩大培养并抽提质粒，酶切验证后的质粒命名为GST-Hd1(见图12)。将GST-Hd1质粒和pGEX-4T-1空载体质粒通过热激法转入到表达菌株BL21中(购自Transgen公司，具体用法与用量参照该公司产品的说明书)。随后挑取单克隆培养至OD(600nm)值为0.5-0.6时，在温度为16℃，转速为160rpm，TPTG浓度为0.1mM诱导表达10小时，收集菌体并超声破碎获得上清。体外pull-down实验具体步骤参考Xia等的实验方法进行(Xia等，The ubiquitin receptor DA1interacts with the E3ubiquitin ligase DA2to regulate seed and organ size in Arabidopsis,Plant Cell,2013:3347-3359)。结果表明只有在GST-Hd1和MBP-HAF1共同存在的情况下利用GST beads亲和纯化复合物，用anti-MBP抗体(来源)能检测到MBP-HAF1，说明HAF1与Hd1存在互作(如图6中的A图)。体外泛素化实验具体步骤参考Liu等的实验方法进行(Liu等，COP1-Mediated Ubiquitination of CONSTANS Is Implicated in Cryptochrome Regulation of Flowering in Arabidopsis,2008,20:292-306)，结果表明在随着Hd1蛋白量逐渐增加的情况下能检测到被泛素化的Hd1蛋白，说明在体外环境下Hd1可以被HAF1泛素化(如图6中的C图)。烟草体内蛋白降解实验参考Yu等的实验方法进行(Yu等，COP1 and ELF3 Control Circadian Function and Photoperiodic Flowering by Regulating GI Stability,Molecular Cell,2008,32:617-30)，结果表明：在烟草体内HAF1与Hd1共同存在时促进Hd1的降解并且该降解过程可以被MG132所抑制，说明HAF1降解Hd1是通过26S蛋白酶复合体途径(如图6中的B图)。检测Hd1蛋白含量在野生型(中花11号)，haf1突变体背景下的变化实验具体操作步骤如下：抽提5叶期ZH11、 haf1突变体的叶片总蛋白，用考马斯亮蓝调节上样量，采用anti-Hd1抗体检测Hd1蛋白在中花11、haf1中含量变化，anti-Hd1抗体稀释比例按体积比为1：1000，二抗为耦合HRP的羊抗兔抗体稀释比例按体积比为1:10000反应完后在加入ECL显色剂在暗室用X-光片显影并定影，结果表明在haf1突变体背景下Hd1的蛋白出现积累，说明HAF1在水稻体内能降解Hd1蛋白(如图6中的D图)。

本发明所涉及到的农杆菌介导的遗传转化试剂及配方如下：

(1)试剂和溶液缩写

6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6min(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmin(MS小量成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)N6max母液[10倍浓缩液(10X)]

逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。

2)N6min母液[100倍浓缩液(100X)]

室温下溶解并定容至1000ml。

3)Fe₂EDTA贮存液(100X)

在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)2.78g

在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73g

在它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MSmax母液(10X)

室温下溶解并定容至1000ml。

6)MSmin母液(100X)

室温下溶解并定容至1000ml。

7)2,4-D贮存液(1mg/ml)

2,4-D 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)

6-BA 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

9)NAA贮存液(1mg/ml)

NAA 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。10)IAA贮存液(1mg/ml)

IAA 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)

葡萄糖 125g

蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液

AS 0.392g

DMSO 10ml

分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

氢氧化钾 5.6g

蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。

14)KT贮存液(1mg/ml)

KT 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

(3)培养基配方

1)诱导培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

3)预培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。

使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的G-418(Sulfate)和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的G-418(Sulfate)和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并定容至1000ml，分装到100ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

10)LA培养基(LB培养基不含琼脂粉)

蒸馏水溶解定容至250ml，装于500ml三角瓶，灭菌后室温保存备用。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

愈伤诱导

(1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)15分钟；

(2)灭菌水洗种子4-5次；

(3)将种子放在诱导培养基上；

(4)置于黑暗处培养5周，温度26±1℃。

愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度26±1℃。

预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养4天，温度26±1℃。

农杆菌培养

(1)在带有卡那霉素的LA培养基上预培养含构建好载体的农杆菌EHA105两天，温度28℃；

(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

农杆菌侵染

(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；

(2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；

(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养2天，温度19-20℃。

愈伤洗涤和选择培养

(1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

(2)浸泡在含400ppm头孢霉素的灭菌水中30分钟；

(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次头孢霉素筛选浓度为400ppm，第二次以后为250ppm)

分化

(1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7天；

(2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃，5－7周。

生根

(1)拔出分化好的苗子，剪掉分化时产生的根；

(2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。在温室炼苗约2周左右后，再移载大田。