本发明属于微生物工程领域，具体涉及一种富硒栅藻及其培养应用。
背景技术：
硒对于人体的亚健康有着良好的恢复功能，能够辅助抑制肿瘤的生长、抗氧化和消除体内自由基，解除和降低有毒重金属，如铅、汞、砷的危害。缺硒将导致生长发育停滞，免疫力降低，容易出现老年性白内障和近视眼等症状。而硒元素在地球上分布非常不均匀，我国约有70%以上的土地处于严重缺硒，缺硒的省份多达22个。硒的推荐人均摄食量为50-200微克，人体的低硒状态及硒的营养状况与关节炎、癌症、心血管疾病、白内障、胆汁郁积、克罗恩氏病、婴儿猝死综合症、囊肿性纤维化、糖尿病、甲状腺肿、免疫缺陷、大骨节病、克山病等40余种疾病发病率相关。尤其是恶劣环境和工作压力日益增大的情况下，将诱发癌症、肝病、心脑血管、糖尿病等多种疾病发病率升高，因此科学补硒与人体的健康有着特别重要的意义。
目前，许多食品中含有硒元素，如富硒酵母、富硒小麦、富硒豆芽、富硒水果、富硒蔬菜等，但都存在下述不足之处：a、含硒量过高：如富硒酵母，含硒量达到700-1000mg/kg，如此高的含硒量使其不能具备食品属性；b、含硒量过低：如富硒水果、富硒蔬菜等含硒量很低，一般的食用量很难起到保健效果；c、所有硒元素的形态不明确：含无机态硒的物质，无论作为食品直接食用，或作为食品添加剂而间接食用，都因为硒的一定毒性，而使此种补硒方法具有一定的危险或产生不良后果。各种富硒方法都是通过吸附作用使硒导入物体内部，其中只有一部分转化有机态，其余部分则保持为无机态，因此使补硒应用受到很大的限制。
栅藻又称栅列藻，绿藻门绿球藻目栅藻科的一属，是淡水中常见的浮游藻类，极喜在营养丰富的静水中繁殖，根据形态划分好多种，如斜生栅藻(Scenedesmus obliqnus)、尖细栅藻(S. acuminatus)、弯曲栅藻(S. arcuatus)、被甲栅藻(S. armatus)和四尾栅藻 (S. quadricauda)等。栅藻在水体自净和污水净化中有一定作用，是有机污水氧化塘生物相中的优势种类。它可与细菌同时附着在水中有机物碎片和其他水生植物体上，形成胶质层，吸附有机物。栅藻进行光合作用时，一方面产生氧气供细菌分解有机质的需要，另一方面还可直接利用有机质作为碳源和氮源，使水中有机物迅速降解，从而净化水体。栅藻细胞内含有丰富的蛋白质和维生素，是鱼类很好的饲料，如利用有机污水氧化塘养鱼，可获高产。大量繁殖的藻体也可作家禽的饲料。斜生栅藻等又极易进行大量人工培养，故栅藻又是研究水体污染的一种很好的实验材料。
普通食物中硒含量较低，由于无机硒具有毒性且细胞吸收缓慢，通过食用富硒藻类食物是补硒途径之一。目前已报到的富硒藻类食物有螺旋藻、红球藻、紫球藻等，还未见报道富含有机硒的栅藻。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供了一种能够富集有机硒的四尾栅藻及其培养应用。本发明的四尾栅藻能够耐受和利用培养液中高浓度的无机硒，在光照自养条件下将无机硒转化为有机硒，得到富含有机硒的栅藻生物质。
本发明富含有机硒的栅藻藻株HC-Y2，其分类命名为四尾栅藻（Scenedesmus subspicatus），已于2014年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9237。
本发明提供的栅藻HC-Y2在显微镜下单个藻细胞为长圆形、圆柱形、卵形，由4-8个细胞的群体组成，群体细胞排列成一直线，群体两侧细胞的上下两端，各具1长或直或略弯曲的剌，剌长10-13微米；中间部分细胞的两端及两侧细胞的侧面游离部上，均无棘剌；4细胞的群体宽10-24微米，细胞宽3.5-6微米，长8-16微米，剌长10-13微米。
本发明提供的栅藻HC-Y2藻株的18S rDNA基因测序分析结果见序列表。根据序列比对，HC-Y2藻株与已公布的栅藻的18S rDNA数据存在差异。
本发明四尾栅藻HC-Y2富集有机硒的方法，包括如下步骤：
（1）配制藻株HC-Y2生长的BG11培养基，加入20-30mg/L的含硒化合物；
（2）将藻株HC-Y2的藻液接种到步骤（1）的培养基中进行活化，培养至对数生长期；
（3）将步骤（2）培养的藻液接种到逐级提高含硒化合物的培养液中进行培养，每次硒元素含量提高20-40mg/L，直至提高至100-200mg/L，获得富含有机硒的藻液。
在步骤（1）中，所述的BG11培养基中所添加的含硒化合物为硒酸盐或亚硒酸盐，硒酸盐优选为硒酸钠，亚硒酸盐优选为亚硒酸钠。将配制好的BG11培养基分装在50-250mL的锥形瓶中，每瓶装液量为20-100mL，用透气膜封口，包上牛皮纸进行灭菌，在温度121℃，压力0.1MPa下灭菌20-30分钟。
在步骤（2）中，按藻液与培养基的体积比为1:10-1:5接种，操作在无菌间进行，接种后将培养液摇匀，用透气膜包好；在22-32℃的恒温光照反应摇床中进行，光照强度为1000-5000Lux，光暗反应周期为24h，光暗时间比为14:10，摇床转速为80-160rpm，培养4-7天，获得活化的四尾栅藻藻液。
在步骤（3）中，采用逐级提高培养液含硒化合物含量的方式进行培养，初始硒元素含量为20-30mg/L，每次硒元素含量提高20-40mg/L，每提高一次在相同条件下培养24-96h，获得富含有机硒的藻液。培养条件为在光照生物反应器中，在光照强度1500-10000Lux，PH值为5-10，温度为15-40℃下培养，培养8天以上进入稳定期，结束培养，收获藻细胞，即可得到的富硒四尾栅藻藻粉。
本发明的四尾栅藻在制备富硒栅藻中的应用。该藻株能够耐受和利用培养液中高浓度的无机硒，在光照自养条件下将无机硒转化为有机硒，得到富含有机硒的栅藻生物质。
与现有技术相比，本发明可以带来以下有益效果：
1、本发明所选育的四尾栅藻在培养过程中具有对无机硒化合物适应性和耐受性强的特点，在培养过程中能够吸收利用培养液中的无机硒作为营养元素，将其转化为有机硒，实现栅藻快速富集有机硒。
2、本发明所培养的四尾栅藻作为一种有机硒的来源，可用于保健食品、饲料及医药添加剂，对缺硒引起的疾病具有一定预防和治疗作用。
附图说明
图1是本发明方法选育的HC-Y2藻株的具体形态特征图。
生物材料保藏说明
本发明提供的四尾栅藻(Scenedesmus subspicatus) HC-Y2藻株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No. 9237；保藏日期：2014年5月26日。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1 分离和筛选获得四尾栅藻HC-Y2
本发明原始藻株是2011年11月从吉林省珲春市珲春河中采集的水样中通过平板划线的方式分离出来的野生四尾栅藻藻株，编号为HC-2。对原始藻株HC-2进行紫外诱变和驯化培养选育耐受含硒化合物的四尾栅藻突变株HC-Y2。
本发明筛选四尾栅藻HC-Y2藻株的具体步骤如下：
（1）配制BG11培养基，将配制好的BG11培养基分装在250mL摇瓶中，每瓶装液量为100mL，用透气膜封口，牛皮纸包好，置于121℃，0.1MPa下灭菌30分钟。所述BG11培养基组成如表1、表2所示。
表1 BG11培养基
*表2 表1中A5+Co solution的组成
（2）在无菌条件下，吸取原始四尾栅藻液HC-2约10mL接种到上述灭菌后的摇瓶中，将摇瓶置于恒温光照摇床中培养。摇床的转速设置为120rpm，温度为25℃，设置光暗培养周期为24h，光暗反应时间比为12:12，光照强度为3000Lux。
（3）在光照摇床中培养5天后，藻液进入对数生长期，此时吸取藻液10mL于灭菌后的培养皿中，使藻液在培养皿底部平铺一薄层，在磁力搅拌下放在紫外灯下进行照射，紫外灯功率为30w，照射距离为15cm，照射时间15min，照射完后盖上皿盖，用不透光的纸包好，在25℃下暗培养2天，致死率为76%。
（4）将暗反应培养的藻液用新鲜培养液稀释10000倍，吸取0.2ml涂布到BG11琼脂固体平板（琼脂含量为1.5%，）上进行培养，其中BG11培养基中添加硒元素含量为200mg/L的亚硒酸钠，培养温度为25℃，光照强度为3000Lux，培养在光照培养箱中进行，光暗反应周期为24h，光暗时间比为12:12，培养时间15天。
（5）挑选平板上体积较大、颜色较绿的藻落进行筛选，将其单藻落接种于装有培养体积为20mL、硒元素含量（亚硒酸钠）为30mg/L的BG11的培养基的50mL的摇瓶中进行培养。培养温度为25℃，摇床转速为120rpm，光照强度为3000Lux，光暗周期为24h，光暗时间比为12:12，培养10天后，测定摇瓶中藻液的OD680值，根据OD680的大小，选择出OD值比较大的耐受含硒化合物的藻株进行驯化筛选。
（6）将筛选出的藻株按1:10的比例接入含有100mL的硒元素含量（亚硒酸钠）为60mg/L的BG11培养液的250mL的摇瓶中进行驯化培养，培养温度为25℃，摇床转速为120rpm，光照强度为3000Lux，光暗周期为24h，光暗时间比为12:12，培养10天后，剔出颜色发黄已经死了的藻液，测定剩余摇瓶中藻液的OD680值，根据OD680的大小，选择出OD值比较大的耐受高硒化合物的藻株进一步驯化。将培养基中硒元素含量（亚硒酸钠）提高至90、120、160、200mg/L在上述相同条件下进一步驯化，选择出OD值比较大的藻株，此藻株即耐受高硒化合物的目标藻株HC-Y2。
本发明通过紫外诱变和逐级提高培养液中硒元素含量的方法选育四尾栅藻，避免了一次提高筛选带来藻种的损伤，造成诱变筛选的失败，保证了逐级驯化的可靠性和提高了诱变藻株的遗传稳定性。本发明以OD680值作为生物量和生长速率的衡量指标，具有直观便捷的特征，保证了在较短时间内较高的筛选量。
实施例2 富硒四尾栅藻HC-Y2的培养
（1）配制藻株HC-Y2生长的BG11培养基，加入硒元素含量20mg/L的亚硒酸钠或硒酸钠。将配制好的BG11培养基分装在250mL的锥形瓶中，每瓶装液量为100mL，用透气膜封口，包上牛皮纸进行灭菌，在温度121℃，压力0.1MPa下灭菌30分钟。
（2）将藻株HC-Y2的藻液接种到步骤（1）的培养基中进行活化，按藻液与培养基的体积比为1:5接种，在25℃的恒温光照反应摇床中进行，光照强度为3000Lux，光暗反应周期为24h，光暗时间比为14:10，摇床转速为100rpm，培养7天，获得活化的四尾栅藻藻液。
（3）将步骤（2）培养的藻液接种10L光照反应器中，逐级提高含硒化合物的培养液中进行培养，每次硒元素含量提高20mg/L，直至提高至160mg/L，培养的光照强度5000Lux，PH值为7，温度为30℃下培养，培养8天以上进入稳定期，结束培养，获得富含有机硒的藻液。用自然沉降和离心的方式藻细胞，将获得的藻细胞进行冷冻干燥即得富含有机硒的四尾栅藻藻粉。
表3 不同含量的效果比较
从结果可以看出，经过驯化筛选的栅藻HC-Y2比初始藻株HC-2对无机硒有更好的富集能力，生物量稳定性好。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国石油化工股份有限公司
中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院
<120> 一种富硒栅藻及其培养应用
<130> 新专利申请
<170> PatentIn version 3.5
<211> 1419
<212> DNA
<213> Scenedesmussubspicatus
<400> 1
gtagtcatat gcttgtctca aagattaagc catgcatgtc taagtataaa ctgcttatac 60
tgtgaaactg cgaatggctc attaaatcag ttatagttta tttggtggta ccttcttact 120
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