一种自动化细胞扩增系统的制作方法

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种自动化细胞扩增系统。

背景技术：

T细胞具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等，成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。成功培育T细胞，并将这种细胞大量注入患者体内，以增强免疫系统成为一种可能。

现有技术中对T细胞进行培养主要采用两种方法，一种为使用细胞培养皿，高品位的层流罩和二氧化碳培养箱进行培养，这种方法效率较低，不能满足临床需求；另一种是通过中空纤维反应器对细胞进行培养，其中一种培养装置具体参见图1，通过导流管依次连接的主循环泵1、气体交换管2、培养管3和培养液主库4，所述培养液主库4上设置有与外界连通的排气孔；其中，所述培养管3为中空纤维反应器，所述导流管包括连接所述主循环泵1和所述气体交换管2的第一导流管11、连接所述气体交换管2和所述培养管3的第二导流管12、连接所述培养管3和所述培养液主库4的第三导流管13以及连接所述培养液主库4和所述主循环泵1的第四导流管14，所述第三导流管13通过第五导流管15与废液储罐5连通，其中，所述中空纤维反应器3包括中空纤维管以及安装所述中空纤维管的圆柱形的外壳，所述中空纤维管的内部和外部分别形成培养液通道31和细胞生长腔32，所述培养液通道31内流经所述培养液，所述细胞生长腔32内接种细胞，所述细胞生长腔32与所述第五导流管通过第六导流管16连通，培养液可以经所述中空纤维管的孔径进入所述细胞生长腔32内为所述细胞提供营养对细胞进行培养，细胞培养所产生的废液可经第六导流管16排至废液储罐5中，在此过程中，细胞培养体系为封闭体系，现有技术中还难以对该封闭体系中细胞生长过程中气体的溶解量(例如：氧气、二氧化碳等)进行适当调节，使得细胞难以在适宜稳定的条件下生长，因此，细胞生长环境的调控制约了中空纤维反应器在细胞培养方面的应用。

技术实现要素：

本发明的实施例提供一种自动化细胞扩增系统，能够实现对细胞生长环境中的气体溶解量进行自动化实时调控，为细胞培养提供稳定生长环境。

为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供一种自动化细胞扩增系统，包括：

通过培养液的循环导管连通的培养液输送装置以及中空纤维反应器，所述中空纤维反应器包括培养液通道和细胞生长腔；所述培养液输送装置包括气体溶解器，所述气体溶解器包括壳体以及设置在所述壳体上的气体进口、培养液进口和培养液出口，所述气体溶解器通过所述培养液进口和培养液出口与所述培养液通道形成循环回路；

与所述气体进口连通的气体提供装置，所述气体提供装置与所述气体进口之间设置有气体流量调节阀；

与所述气体流量调节阀电连接的控制系统；

所述培养液输送装置用于向所述培养液通道输送培养液，所述控制系统用于控制所述气体流量调节阀的开度对所述气体提供装置向所述气体溶解器内通入气体的流量进行调节。

优选的，所述气体溶解器的壳体内设置有中空纤维管，所述中空纤维管将所述壳体内空间分隔为培养液流经侧和气体流通侧，所述培养液流经侧与所述培养液进口和所述培养液出口连通，所述气体流通侧与所述气体进口连通。

可选的，所述气体提供装置包括二氧化碳气瓶和氧气气瓶，所述二氧化碳气瓶与所述气体进口之间设置有第一流量调节阀，所述氧气气瓶与所述气体进口之间设置有第二流量调节阀，所述控制系统与所述第一流量调节阀和所述第二流量调节阀电连接，用于对通入所述气体溶解器内的二氧化碳和氧气的流量进行调节。

进一步的，所述控制系统用于获取二氧化碳的消耗模型和氧气的消耗模型，并根据所述二氧化碳的消耗模型对所述第一流量调节阀的开度进行调节，使得培养液的pH值保持在第一预设范围内，根据所述氧气的消耗模型对所述第二流量调节阀的开度进行调节，使得培养液的溶氧量保持在第二预设范围内。

可选的，所述循环导管上设置有pH检测器和溶氧量检测器，所述控制系统与所述pH检测器和所述溶氧量检测器电连接，所述控制系统用于根据所述pH检测器发送的pH信号对所述第一流量调节阀的开度进行调节，使得pH值保持在第一预设范围内；根据所述溶氧量检测器发送的溶氧量信号对所述第二流量调节阀的开度进行调节，使得溶氧量保持在第二预设范围内。

优选的，所述培养液输送装置还包括循环泵，所述循环泵的输出端与所述培养液进口连通，输入端与所述培养液通道的出口连通，所述循环泵与所述控制系统电连接；

所述系统还包括压力扩展箱；所述压力扩展箱内充有气体，所述压力扩展箱的底部与所述培养液通道或者所述细胞生长腔连通，所述控制系统还用于控制所述循环泵将培养液以脉冲波的形式流经所述培养液通道，使得所述培养液通道和所述细胞生长腔的压力差正负交替变化，所述压力扩展箱用于通过气体容积变化使得所述培养液通道和所述细胞生长腔的压力平衡。

进一步的，所述细胞生长腔设置有第一压力传感器，所述气体溶解器的培养液出口与所述培养液通道的进口之间的循环导管上还设置有第二压力传感器，所述控制系统与所述第一压力传感器和所述第二压力传感器电连接，所述控制系统还用于获取所述细胞生长腔的代谢产物浓度增长模型，并根据所述第一压力传感器和所述第二压力传感器发送的压力控制所述循环泵以预设脉冲模型向所述培养液通道输送培养液，使得所述细胞生长腔的代谢产物浓度保持在第三预设范围内。

可选的，所述系统还包括：废液输送泵和废液储罐；

所述培养液输送装置还包括设置在所述中空纤维反应器和所述循环泵之间的培养液缓冲罐，所述培养液缓冲罐的进口与所述培养液通道的出口连通，出口与所述循环泵的输入端连通；

所述废液输送泵的输入端与所述培养液缓冲罐和所述培养液通道之间的管道连通，输出端与所述废液储罐连通，所述控制系统与所述废液输送泵电连接；

所述控制系统还用于获取所述培养液通道的细胞代谢产物的增长模型，若确定细胞代谢产物的预设阈值与所述培养液通道的细胞代谢产物的浓度之间的差值小于等于第一预设阈值时，则控制所述废液输送泵开启，将所述培养液通道的培养液输送至废液储罐中。

优选的，所述系统还包括补液罐和培养液输送泵；

所述细胞生长腔还包括进口，所述补液罐的出口与所述培养液输送泵的输入端连通，所述培养液输送泵的输出端与所述细胞生长腔的进口连通，所述气体溶解器的培养液出口与所述培养液通道连通的循环导管上还设置有温度传感器，所述补液罐与所述培养液输送泵连通的管道上还设置有加热器，所述控制系统与所述培养液输送泵、温度传感器和加热器电连接；

所述控制系统还用于获取所述温度传感器发送的温度信号，并对所述培养液输送泵和所述加热器的开启与关闭进行控制，使得所述培养液通道的温度保持在第四预设范围内。

优选的，所述培养液输送泵和所述细胞生长腔的进口连通的管道上还设置有第三压力传感器，所述控制系统与所述第三压力传感器电连接，所述控制系统还用于根据所述第三压力传感器发送的压力信号对所述培养液输送泵输送培养液的速度进行控制，使得所述培养液输送泵输送培养液的速度保持在第五预设范围内。

本发明实施例提供一种自动化细胞扩增系统，通过设置气体提供装置，并将所述气体提供装置与所述进气口连通，能够为所述气体溶解器的气体流通侧提供所需要的气体，并且，通过控制系统控制所述气体流量调节阀的开度，能够对流经所述气体流通侧的气体的流量进行控制，为细胞培养提供稳定的气体，从而能够对所述培养液中的气体溶解量进行自动化控制，使得培养液适宜细胞培养，为细胞培养提供稳定的生长环境。

附图说明

图1为现有技术提供的一种细胞循环培养系统的结构示意图；

图2为本发明实施例提供的一种自动化细胞扩增系统的结构示意图；

图3为本发明实施例提供的另一种自动化细胞扩增系统的结构示意图；

图4为本发明实施例提供的另一种自动化细胞扩增系统的结构示意图；

图5为本发明实施例提供的另一种自动化细胞扩增系统的结构示意图；

图6为本发明实施例提供的另一种自动化细胞扩增系统的结构示意图；

图7为本发明实施例提供的另一种自动化细胞扩增系统的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明实施例提供的一种自动化细胞扩增系统及其细胞培养方法进行详细描述。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。

需要说明的是，本发明实施例提供的一种自动化细胞扩增系统适用于任何细胞的扩增，尤其适用于悬浮细胞和贴壁细胞的扩增培养。

一方面，本发明实施例提供一种自动化细胞扩增系统，参见图2，包括：

通过培养液的循环导管连通的培养液输送装置以及中空纤维反应器3，所述中空纤维反应器3包括培养液通道31和细胞生长腔32；所述培养液输送装置包括气体溶解器2，所述气体溶解器2包括壳体以及设置在所述壳体上的气体进口、培养液进口和培养液出口，所述气体溶解器2通过所述培养液进口和培养液出口与所述培养液通道31形成循环回路；

与所述气体进口连通的气体提供装置(图中01和02所示)，所述气体提供装置与所述气体进口之间设置有气体流量调节阀(图中a和b所示)；

与所述气体流量调节阀电连接的控制系统100；

所述培养液输送装置用于向所述培养液通道31输送培养液，所述控制系统100用于控制所述气体流量调节阀的开度对所述气体提供装置向所述气体溶解器2内通入气体的流量进行调节。

本发明实施例提供一种自动化细胞扩增系统，通过设置气体提供装置，并将所述气体提供装置与所述进气口连通，能够为所述气体溶解器2的气体流通侧提供所需要的气体，并且，通过控制系统100控制所述气体流量调节阀(a和b)的开度，能够对流经所述气体溶解器2的气体的流量进行控制，为细胞培养提供一定的气体流量，从而能够对所述培养液中的气体溶解量进行自动化控制，使得培养液适宜细胞培养，为细胞培养提供稳定的生长环境。

本发明的一实施例中，参见图3，所述气体溶解器2的壳体内设置有中空纤维管21，所述中空纤维管21将所述壳体内空间分隔为培养液流经侧22和气体流通侧23，所述培养液流经侧22与所述培养液进口和所述培养液出口连通，所述气体流通侧23与所述气体进口连通。

通过设置中空纤维管21，使得气体流通侧23内的气体通过所述中空纤维管21扩散入所述培养液流经侧22，能够与培养液进行充分接触，提高气体的溶解量。

本发明的又一实施例中，所述气体提供装置包括二氧化碳气瓶01和氧气气瓶02，所述二氧化碳气瓶01与所述气体进口之间设置有第一流量调节阀a，所述氧气气瓶02与所述气体进口之间设置有第二流量调节阀b，所述控制系统100与所述第一流量调节阀a和所述第二流量调节阀b电连接，用于对通入所述气体溶解器2内的二氧化碳和氧气的流量进行调节。

通过设置二氧化碳气瓶和氧气气瓶，能够为所述培养液提供二氧化碳气体和氧气，从而能够为所述培养液提供二氧化碳和氧气，满足细胞培养需求，同时，通过所述控制系统对通入所述气体溶解器2中的气体流量进行调节，能够对二氧化碳和氧气的溶解量进行控制。

本发明的一实施例中，所述控制系统100用于获取二氧化碳的消耗模型和氧气的消耗模型，并根据所述二氧化碳的消耗模型对所述第一流量调节阀a的开度进行调节，使得培养液的pH值保持在第一预设范围内，根据所述氧气的消耗模型对所述第二流量调节阀b的开度进行调节，使得培养液的溶氧量保持在第二预设范围内。

由于在细胞培养过程中，二氧化碳主要起到调节pH值的作用，可以根据任意时刻培养液的pH值的变化情况和二氧化碳在所述培养液中的溶解度来控制所述二氧化碳的通入量，从而能够对培养液的pH值进行实时调控；同时，细胞在培氧过程中会消耗少量的氧气，可以根据任意时刻的细胞的耗氧速度和氧气在所述培养液中的溶解度来控制氧气的通入量，从而能够及时溶解氧气，控制溶氧量。

本发明的一实施例中，参见图3，所述循环导管上设置有pH检测器03和溶氧量检测器04，所述控制系统100与所述pH检测器03和溶氧量检测器04电连接，所述控制系统100用于根据所述pH检测器03发送的pH信号对所述第一流量调节阀a的开度进行调节，使得pH值保持在第一预设范围内；根据所述溶氧量检测器04发送的溶氧量信号对所述第二流量调节阀b的开度进行调节，使得溶氧量保持在第二预设范围内。

通过所述pH检测器03与所述溶氧量检测器04对循环体系中的培养液的pH值和溶氧量进行实时检测，并通过所述控制系统100对二氧化碳的流量和氧气的流量进行及时调节，从而能够对循环体系中的培养液的pH值和溶氧量进行实时监控，保证为细胞提供适宜的生长环境。

本发明的一实施例中，参见图4，所述培养液输送装置还包括循环泵1，所述循环泵1的输出端与所述培养液进口连通，输入端与所述培养液通道31的出口连通，所述循环泵1与所述控制系统100电连接；

所述细胞培养循环系统还包括压力扩展箱6；所述压力扩展箱6内充有气体，所述压力扩展箱6的底部与所述培养液通道31或者所述细胞生长腔32连通，所述控制系统100还用于控制所述循环泵1将培养液以脉冲波的形式流经所述培养液通道31，使得所述培养液通道31和所述细胞生长腔32的压力差正负交替变化，所述压力扩展箱6用于通过气体容积变化使得所述培养液通道31和所述细胞生长腔32的压力平衡。

在本发明实施例中，通过设置压力扩展箱6，并通过所述控制系统控制循环泵1以脉冲波的形式输送培养液，使得所述培养液通道31和所述细胞生长腔32的压力差正负交替变化。当所述压力差为正时，所述培养液通道31的培养液进入所述细胞生长腔32，压力扩展箱6的气体容积被压缩，直至压力平衡。当所述压力差为负时，所述细胞生长腔32内的废液进入所述培养液通道31，压力扩展箱6的气体容积增大，直至压力平衡，从而实现培养液和废液的交换，这样，废液中对细胞生长有利的营养物质能够被培养液带入循环体系为细胞所用，还能够不断进行培养液更新，减少培养液的消耗。

针对不同的细胞种类，培养液和废液的交换量也有所不同，并且所施加给所述培养液通道31和所述细胞生长腔32之间的压力差也会有所不同，以所述贴壁细胞与所述悬浮细胞为例进行说明，在对悬浮细胞进行培养时，可以直接将悬浮细胞接种于细胞生长腔32内，细胞呈悬浮状态，而在对贴壁细胞进行培养时，需要对细胞生长腔32的表面进行预处理，例如，当所述中空纤维管的内部为细胞生长腔32时，则在所述中空纤维管的内壁上铺设一层蛋白，使得细胞能够附着于所述中空纤维管的内壁进行贴壁培养。反之亦然。因此，通常贴壁细胞培养时为了实现培养液和废液的交换，所述培养液通道31和所述细胞生长腔32之间的压力差略大于悬浮细胞培养时的压力差。

本发明的又一实施例中，参见图4，所述细胞生长腔32设置有第一压力传感器05，所述气体溶解器2的培养液出口与所述培养液通道31的进口之间的循环导管上还设置有第二压力传感器06，所述控制系统100与所述第一压力传感器05和所述第二压力传感器06电连接，所述控制系统100还用于获取所述细胞生长腔32的代谢产物浓度增长模型，并根据所述第一压力传感器05和所述第二压力传感器06发送的压力控制所述循环泵1以预设脉冲模型向所述培养液通道31输送培养液，使得所述细胞生长腔32的代谢产物浓度保持在第三预设范围内。

通过对培养液和废液实现交换的同时，控制所述循环泵1将培养液以预设脉冲模型流经所述培养液通道31，能够对培养液和废液的交换量以及交换频率进行控制，从而使得所述细胞生长腔内的代谢产物浓度不至于过高而对细胞生长产生负面影响。示例性的，所述预设脉冲模型的脉冲波可以为方形波、正弦波等，所述预设脉冲模型的波峰和波谷之间的差值也可大可小。培养液和废液的单位时间内的交换量与所述预设脉冲模型的波峰和波谷的大小以及脉冲频率均有关系，可以根据经验或者理论计算来确定所述预设脉冲模型的具体形式，只要能够使得培养液和废液进行及时交换，降低所述细胞生长腔32内的代谢产物浓度即可。

还需要说明的是，随着细胞的培养，代谢产物不断增多，使得所述细胞生长腔内的培养液粘稠度增大，为了提高培养液和废液的交换效果，还可以通过逐渐缩短所述脉冲波的时间周期或/和增大所述培养液通道和所述细胞生长腔之间的压力差来实现。

本发明的又一实施例中，所述控制系统100还用于接收所述第二压力传感器06反馈的压力信号，并根据反馈的压力信号对所述循环泵1的脉冲信号进行校正。

在本发明实施例中，通过闭环控制，使得所述循环泵1以稳定的脉冲信号进行运行，并对所述培养液通道31和所述细胞生长腔32的压力差稳定变化。

本发明的一实施例中，参见图5，所述压力扩展箱6的顶部设置有第一管道61，所述第一管道61上设置有第三阀门c；

所述压力扩展箱6外侧从上到下分别在第一高度和第二高度处设置有第一液面传感器07和第二液面传感器08，所述控制系统100分别与所述第一液面传感器07、第二液面传感器08和第三阀门c电连接，所述控制系统100用于在所述第一液面传感器07检测到培养液的液面高度达到第一高度时控制所述第三阀门c开启，向所述压力扩展箱6内气体，在所述第二液面传感器08检测到培养液的液面高度到达第二高度时控制所述第三阀门c开启，从所述压力扩展箱6内放出部分气体，使得所述培养液的液面高度保持在第一高度和第二高度之间。

在本发明实施例中，通过第一液面传感器07和所述第二液面传感器08，能够对所述压力扩展箱6内的气体量进行及时监控，使得所述压力扩展箱6内的气体容积保持在一定的范围内，便于对培养液和废液的交换量进行控制。

本发明的一实施例中，所述系统还包括废液储罐5和废液输送泵51，

所述培养液输送装置还包括设置在所述中空纤维反应器3和所述循环泵1之间的培养液缓冲罐4，所述培养液缓冲罐4的进口与所述培养液通道31的出口连通，出口与所述循环泵1的输入端连通；

所述废液输送泵51的输入端与所述培养液缓冲罐4和所述培养液通道31之间的管道连通，输出端与所述废液储罐5连通，所述控制系统100与所述废液输送泵51电连接；

所述控制系统100还用于获取所述培养液通道31的细胞代谢产物的增长模型，若确定细胞代谢产物的预设阈值与所述培养液通道31的细胞代谢产物的浓度之间的差值小于等于第一预设阈值时，则控制所述废液输送泵51开启，将所述培养液通道31的培养液输送至废液储罐5中。

其中，所述培养液通道31的细胞代谢产物的增长模型可以通过经验获取，也可以通过实验获取，在通过实验获取时，可以绘制细胞代谢产物在任意时间段内的变化曲线，通过该变化曲线，可以根据任意时刻的代谢产物浓度的增长速度和任一时间段计算任意时刻的代谢产物的浓度，若确定所述代谢产物的浓度与预设阈值之间的差值小于等于第一预设阈值时，则控制所述废液输送泵51开启，将培养液输送至所述废液储罐5中。随着细胞生长的进行，培养液和废液的不断交换，当所述培养液通道31的培养液中的代谢产物浓度较高，不适于细胞生长时，可以将其排至所述废液储罐5中。

本发明的又一实施例中，参见图6，所述系统还包括补液罐7和培养液输送泵71；

所述细胞生长腔32还包括进口，所述补液罐7的出口与所述培养液输送泵71的输入端连通，所述培养液输送泵71的输出端与所述细胞生长腔32的进口连通，所述气体溶解器2的培养液出口与所述培养液通道31连通的循环导管上还设置有温度传感器09，所述补液罐7与所述培养液输送泵71连通的管道上还设置有加热器8，所述控制系统100与所述培养液输送泵71、温度传感器09和加热器8电连接；

所述控制系统100还用于获取所述温度传感器09发送的温度信号，并对所述培养液输送泵71和所述加热器8的开启与关闭进行控制，使得所述培养液通道31的温度保持在第四预设范围内。

在循环培养过程中，所述培养液通道31所体现的温度与所述中空纤维反应器3内部的温度基本一致，通过对循环体系的温度进行检测，并根据所检测到的温度通过控制所述培养液输送泵71输送培养液并对其加热或者不加热器，能够对所述培养液输送泵71输送的培养液的温度进行调节，并通过所述培养液通道31和所述细胞生长腔32的培养液的交换，能够对所述循环体系的温度进行调节，使得细胞在温度适宜的环境下生长。

本发明的又一实施例中，所述培养液输送泵71和所述细胞生长腔32的进口连通的管道上还设置有第三压力传感器010，所述控制系统100与所述第三压力传感器010电连接，所述控制系统100还用于根据所述第三压力传感器010发送的压力信号对所述培养液输送泵71输送培养液的速度进行控制，使得所述1培养液输送泵71输送培养液的速度保持在第五预设范围内。

在本发明实施例中，通过第三压力传感器010对所述培养液输送泵72输送培养液的压力进行及时检测，能够通过所述控制系统100对所述培养液通道31和所述细胞生长腔32的压力差进行调节，从而能够对培养液和废液的交换频率和交换量进行控制，实现对所述循环体系的温度的准确调控。

本发明的一实施例中，参见图7，所述系统还包括补液泵72，所述补液泵72的输入端与所述补液罐7连通，输出端与所述培养液缓冲罐4的进口连通，所述培养液缓冲罐4从上到下分别在第三高度和第四高度处设置有第三液面传感器011和第四液面传感器012，所述控制系统100还用于所述第三液面传感器011检测到培养液的液面高度达到第三高度时控制所述补液泵72关闭，停止向所述培养液缓冲罐4中补液；在所述第四液面传感器010检测到培养液的液面高度到达第四高度时控制所述补液泵72开启，向所述培养液缓冲罐4中补液，使得所述培养液缓冲罐4中培养液的液面高度保持在第三高度和第四高度之间。

在通过所述补液罐7向所述培养液通道32和/或所述细胞生长腔33进行补液时，通过对所述培养液缓冲罐4的液面高度进行监控，能够避免所述培养液缓冲罐4内培养液不足造成循环中断，也能够防止所述培养液缓冲罐4内培养液过多而溢出。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。