本发明涉及土壤修复领域，具体地，涉及一种百菌清污染土壤的原位生物修复制剂和修复方法。
背景技术：
：百菌清是由美国钻石制碱公司开发的一种保护性茎叶喷洒取代苯类杀菌剂，化学名称为2,4,5,6-四氯-1,3-苯二甲腈，广泛用于蔬菜、果树、豆类、水稻、小麦等多种作物病害的防治。但由于百菌清的非规范使用和过量喷洒，导致其在农产品表面和农耕土壤中大量残留，不仅严重危及食品安全，还可能破坏土壤的微生态环境，为农耕土壤肥力的丧失和农作物病变埋下隐患。当前，光化学降解是农药主要的降解途径。Penuela等研究发现百菌清在去离子水中的光解半衰期达一百小时以上，添加Fe3+后光解半衰期可缩短至4h左右，然而，受光照条件的限制以及避免化学试剂对耕地的二次污染，光化学降解法并不适用于百菌清残留的农耕土壤的大规模修复。技术实现要素：为了解决在百菌清污染土壤的修复中，光化学降解法易受光照条件的限制和容易造成对耕地的二次化学试剂污染的问题，本发明提出了一种用于原位修复百菌清污染土壤的制剂和一种百菌清污染土壤的原位生物修复方法。本发明的发明人在研究中意外地发现，一些真菌，例如黑曲霉(Aspergillusniger)、多变根毛霉(Rhizomucorvariabilis)、灰色小克银汉霉(Cunninghamellabertholletiae)，和细菌，例如伯克霍尔德氏菌(Burkholderiazhejiangensis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、嗜麦芽寡氧单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)具有降解百菌清的能力，而且不需要光照条件，同时培养上述真菌和细菌的培养基也不含对土壤造成有害的化学污染的物质，从而避免了光化学降解法中的化学试剂对耕地的二次污染问题。而且，发明人还发现，当将真菌和细菌组合使用、或不同的真菌组合使用、以及不同的细菌组合使用时，与单独使用某一种真菌或细菌相比，具有更好的修复效果。此外，发明人还发现，当配合使用微生物生长促进剂和肥料时，能更有利于修复百菌清污染土壤，从而完成了本发明。本发明提供了一种用于原位修复百菌清污染土壤的制剂，该制剂含有具有百菌清降解能力的真菌和/或细菌；其中，所述真菌为保藏编号为CGMCCNo.11113的黑曲霉(Aspergillusniger)、保藏编号为CGMCCNo.11114的多变根毛霉(Rhizomucorvariabilis)和保藏编号为CGMCCNo.11115的灰色小克银汉霉(Cunninghamellabertholletiae)中的至少一种；所述细菌为保藏编号为CGMCCNo.10848的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiazhejiangensis)、保藏编号为CGMCCNo.10842的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和保藏编号为CGMCCNo.10846的嗜麦芽寡氧单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)中的至少一种。本发明还提供了一种百菌清污染土壤的原位生物修复方法，该方法包括使用用于原位修复百菌清污染土壤的制剂对百菌清污染土壤进行原位修复。采用本发明提供的用于原位修复百菌清污染土壤的制剂对百菌清污染的土壤进行原位生物修复时，由于所采用的真菌和/或细菌不需光照条件、不采用污染环境的化学试剂，因而克服了光化学降解法易受光照条件的限制和容易造成对耕地的二次化学试剂污染的问题，同时辅以微生物生长促进剂和肥料，使得可以充分利用真菌和/或细菌分解代谢土壤中残留的百菌清，从而解决了土壤中高残留的百菌清严重危及食品安全的问题，同时改善了土壤的微生态，使土壤更加快速的恢复耕作能力，而且该方法成本较低，从而具有广阔的应用前景。本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。生物保藏本发明的菌株如下：1、黑曲霉(Aspergillusniger)，于2015年7月14日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.11113。2、多变根毛霉(Rhizomucorvariabilis)，于2015年7月14日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.11114。3、灰色小克银汉霉(Cunninghamellabertholletiae)，于2015年7月14日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.11115。4、伯克霍尔德氏菌(Burkholderiazhejiangensis)，于2015年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.10848。5、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，于2015年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.10842。6、嗜麦芽寡氧单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，于2015年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.10846。具体实施方式以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种用于原位修复百菌清污染土壤的制剂，该制剂含有具有百菌清降解能力的真菌和/或细菌；其中，所述真菌为：保藏编号为CGMCCNo.11113的黑曲霉(Aspergillusniger)、保藏编号为CGMCCNo.11114的多变根毛霉(Rhizomucorvariabilis)和保藏编号为CGMCCNo.11115的灰色小克银汉霉(Cunninghamellabertholletiae)中的至少一种；所述细菌为保藏编号为CGMCCNo.10848的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiazhejiangensis)、保藏编号为CGMCCNo.10842的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和保藏编号为CGMCCNo.10846的嗜麦芽寡氧单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)中的至少一种。根据本发明提供的制剂，所述制剂中可以不含细菌，且真菌的总含量为20-90mg干重/mL，优选50-80mg干重/mL。当所述制剂中不含细菌时，所述制剂可以为黑曲霉、多变根毛霉和灰色小克银汉霉三者之中的任意一种、任意两种的组合或三种的组合。在一种优选的实施方式中，所述制剂同时含有黑曲霉、多变根毛霉和灰色小克银汉霉，且黑曲霉、多变根毛霉和灰色小克银汉霉的干重比为1：(0.01-100)：(0.01-100)，优选1：(0.2-5)：(0.2-5)。根据本发明提供的制剂，所述制剂中可以不含真菌，且细菌的总含量为1013-1019个/mL，优选1015-1017个/mL。当所述制剂中不含真菌时，所述制剂可以为伯克霍尔德氏菌、铜绿假单胞菌和嗜麦芽寡氧单胞菌三者之中的任意一种、任意两种的组合或三种的组合。在一种优选的实施方式中，所述制剂同时含有伯克霍尔德氏菌、铜绿假单胞菌和嗜麦芽寡氧单胞菌，且伯克霍尔德氏菌、铜绿假单胞菌和嗜麦芽寡氧单胞菌的数量比为1：(10-6-106)：(10-6-106)，优选1：(10-2-102)：(10-2-102)。根据本发明提供的制剂，所述制剂中可以同时含有真菌和细菌，且真菌的总含量为10-80mg干重/mL，优选40-50mg干重/mL；细菌的总含量为1010-1018个/mL，优选1014-1015个/mL。当所述制剂中同时含有真菌和细菌时，所述制剂中的真菌可以为黑曲霉、多变根毛霉和灰色小克银汉霉三者之中的任意一种、任意两种或三种；所述制剂中的细菌可以为伯克霍尔德氏菌、铜绿假单胞菌和嗜麦芽寡氧单胞菌三者之中的任意一种、任意两种或三种。在一种优选的实施方式中，所述制剂同时含有上述三种真菌和上述三种细菌，且黑曲霉、多变根毛霉和灰色小克银汉霉的干重比为1：(0.01-100)：(0.01-100)，优选1：(0.2-5)：(0.2-5)；伯克霍尔德氏菌、铜绿假单胞菌和嗜麦芽寡氧单胞菌的数量比为1：(10-6-106)：(10-6-106)，优选1：(10-2-102)：(10-2-102)。所述制剂中还可以含有微生物生长促进剂和/或肥料。所述微生物生长促进剂可以为葡萄糖、淀粉、酵母膏、酵母粉、蛋白胨和氯化钠中的至少一种。所述微生物生长促进剂可以促进原位修复百菌清污染土壤的制剂中的微生物在土壤中的生长。所述微生物生长促进剂的含量可以为10-80g/mL，优选30-50g/mL。所述肥料可以为有机肥、尿素、磷酸二铵和硫酸钾中的至少一种。所述肥料可以帮助被污染的土壤恢复肥力，并在一定程度上促进所施加微生物的生长。所述肥料的含量可以为1-10g/mL，优选4-6g/mL。根据本发明的第二个方面，本发明提供了一种百菌清污染土壤的原位生物修复方法，该方法包括使用上述用于原位修复百菌清污染土壤的制剂对百菌清污染土壤进行原位修复。其中，当所述制剂中不含细菌时，真菌的使用量可以为使得百菌清污染土壤中真菌的总含量达到4-18g干重/m3，优选10-16g干重/m3。当所述制剂中不含真菌时，细菌的使用量可以为使得百菌清污染土壤中细菌的总含量达到1015-1021个/m3，优选1017-1019个/m3。当所述制剂中同时含有真菌和细菌时，真菌的使用量可以为使得百菌清污染土壤中真菌的总含量达到2-16g干重/m3，优选8-10g干重/m3，细菌的使用量为使得百菌清污染土壤中细菌的总含量达到1012-1020个/m3，优选1016-1017个/m3。当所述制剂中还含有微生物生长促进剂和/或肥料时，所述微生物生长促进剂的使用量可以为使得百菌清污染土壤中微生物生长促进剂的含量达到20-160g/m3，优选60-100g/m3。所述肥料的使用量为使得百菌清污染土壤中肥料的含量达到2-20g/m3，优选8-12g/m3。根据本发明的百菌清污染土壤的原位生物修复方法，所述原位修复的过程可以在土壤水份含量为5重量％-30重量％、温度为15-40℃下操作5-30天，优选7-14天。根据本发明的百菌清污染土壤的原位生物修复方法，可以采用灌溉和翻耕操作使得土壤水份含量为5重量％-30重量％。其中翻耕操作的周期可以为1-4周1次。采用翻耕操作可以为土壤中微生物的生长提供充足的氧气。可以采用覆盖多孔地膜的操作保持土壤中的温度为15-40℃，水分含量为5重量％-30重量％，以提供真菌和/或细菌生长所需的温度和湿度，从而为微生物的生长繁殖提供适宜的环境。以下将通过具体的实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，土壤中的百菌清含量(单位g/kg土壤)按照以下方法测定：称量5g烘干土，加入体积比例为1:1的丙酮和水10mL，静置30分钟，振荡5分钟后离心取上清液，加入5mL石油醚振荡萃取5分钟，重复三次，静置后取上清液10mL，向其中加入无水硫酸钠0.4g，振荡脱水1分钟，之后取4mL于40℃旋转蒸发仪上旋转蒸发至干，然后用2mL色谱纯丙酮溶解，再用色谱纯丙酮稀释10倍备用待测。气相色谱条件：柱子：HT-Pesticides1；检测器：ECD检测器；进样口温度：260℃；柱温：240℃；检测器温度：280℃；分流比：60；进样量：1μL；尾吹60mL/min；柱压：60kpa；载气流量：1.25mL/min。百菌清的土壤清除率为：(处理前的土壤中百菌清的含量-用本发明提供的用于原位修复百菌清污染土壤的制剂处理之后的土壤中的百菌清的含量)/处理前的土壤中百菌清的含量×100％。以下实施例中，制剂中各成分的含量均以每mL用于原位修复百菌清污染土壤的制剂为基准。实施例1本实施例用于说明本发明提供的用于原位修复百菌清污染土壤的制剂，以及使用该制剂对百菌清污染土壤进行原位修复的方法。本实施例提供的用于原位修复百菌清污染土壤的制剂的组成如下：保藏编号为CGMCCNo.11113的黑曲霉(Aspergillusniger)，含量为13mg干重/mL；保藏编号为CGMCCNo.11114的多变根毛霉(Rhizomucorvariabilis)，含量为13mg干重/mL；保藏编号为CGMCCNo.11115的灰色小克银汉霉(Cunninghamellabertholletiae)，含量为14mg干重/mL；保藏编号为CGMCCNo.10848的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiazhejiangensis)，含量为1015个/mL；保藏编号为CGMCCNo.10842的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，含量为1015个/mL；保藏编号为CGMCCNo.10846的嗜麦芽寡氧单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，含量为1015个/mL；葡萄糖的含量为10g/mL，淀粉的含量为5g/mL，酵母膏的含量为5g/mL，酵母粉的含量为5g/mL，蛋白胨的含量为10g/mL，氯化钠的含量为10g/mL；有机肥的含量为2g/mL，尿素的含量为1g/mL，磷酸二铵的含量为1g/mL，硫酸钾的含量为1g/mL。将上述制剂均匀施用于百菌清含量为10g/kg土壤的被百菌清污染的土壤中，使得土壤中黑曲霉(Aspergillusniger)的含量达到2.6g干重/m3，多变根毛霉(Rhizomucorvariabilis)的含量达到2.6g干重/m3，灰色小克银汉霉(Cunninghamellabertholletiae)的含量达到2.8g干重/m3，伯克霍尔德氏菌(Burkholderiazhejiangensis)的含量达到1017个/m3，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的含量达到1017个/m3，嗜麦芽寡氧单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)的含量达到1017个/m3，微生物生长促进剂的含量达到90g/m3，肥料的含量达到10g/m3。在土壤表面覆盖多孔地膜，使得土壤温度保持在25±2℃。每周灌溉和翻耕土壤，使得土壤中水份含量保持在20重量％-30重量％。12天后，测得土壤中百菌清含量为0.039g/kg土壤，百菌清的土壤清除率达到99.61％。实施例2-16本实施例用于说明本发明提供的用于原位修复百菌清污染土壤的制剂，以及使用该制剂对百菌清污染土壤进行原位修复的方法。实施例2-16提供的用于原位修复百菌清污染土壤的制剂的组成中，除了表1-1和1-2中的组分的含量外，其余组分(微生物生长促进剂和肥料)的含量均和实施例1相同。将实施例2-16提供的用于原位修复百菌清污染土壤的制剂均匀施用于百菌清含量为10g/kg土壤的被百菌清污染的土壤中，使得土壤中除了真菌和细菌的含量达到表2-1和2-2中所示的含量外，其它组分(微生物生长促进剂和肥料)的含量均和实施例1相同。实施例2-16中，使用实施例2-16提供的用于原位修复百菌清污染土壤的制剂对被百菌清污染的土壤进行处理的方式均和实施例1相同。12天后，测得的土壤中百菌清的含量和百菌清的土壤清除率如表3所示。表1-1制剂中真菌和细菌组分的含量实施例12345678黑曲霉1320----35----10多变根毛霉132025--30--75-灰色小克银汉霉14--25----70---伯克霍尔德氏菌10151014--1016----10101018铜绿假单胞菌101510141012----10171010-嗜麦芽寡氧单胞菌1015--10121016--1017---表1-2制剂中真菌和细菌组分的含量实施例910111213141516黑曲霉----60----------多变根毛霉45----65--------灰色小克银汉霉--80----75------伯克霍尔德氏菌----------1015----铜绿假单胞菌1011----------1016--嗜麦芽寡氧单胞菌--1015----------1017表1-1和1-2中，黑曲霉、多变根毛霉和灰色小克银汉霉的含量单位为“mg干重/mL”；伯克霍尔德氏菌、铜绿假单胞菌和嗜麦芽寡氧单胞菌的含量单位为“个/mL”。表2-1土壤中真菌和细菌的含量实施例12345678黑曲霉2.64----7----2多变根毛霉2.645--6--15-灰色小克银汉霉2.8--5----14---伯克霍尔德氏菌10171016--1018----10121020铜绿假单胞菌101710161014----10191012-嗜麦芽寡氧单胞菌1017--10141018--1019---表2-2土壤中真菌和细菌的含量实施例910111213141516黑曲霉----12----------多变根毛霉9----13--------灰色小克银汉霉--16----15------伯克霍尔德氏菌----------1017----铜绿假单胞菌1013----------1018--嗜麦芽寡氧单胞菌--1017----------1019表2-1和2-2中，黑曲霉、多变根毛霉和灰色小克银汉霉的含量单位为“g干重/m3”；伯克霍尔德氏菌、铜绿假单胞菌和嗜麦芽寡氧单胞菌的含量单位为“个/m3”。表3处理后土壤中百菌清的含量和百菌清的土壤清除率处理后土壤中百菌清的含量(g/kg土壤)百菌清的土壤清除率(％)实施例10.03999.61实施例20.10398.97实施例30.10598.95实施例40.29497.06实施例50.29097.10实施例60.12498.76实施例70.12798.73实施例80.28597.15实施例90.27497.26实施例100.25997.41实施例110.43895.62实施例120.41695.84实施例130.38596.15实施例140.39496.06实施例150.37796.23实施例160.34896.52由实施例1-16和表3可见，使用本发明提供的用于原位修复百菌清污染土壤的制剂对百菌清污染的土壤进行原位修复，可以高效率地清除土壤中的百菌清，不仅解决了土壤中高残留的百菌清严重危及食品安全的问题，改善了土壤的微生态，使土壤更加快速的恢复耕作能力，而且克服了光化学降解法易受光照条件的限制和容易造成对耕地的二次化学试剂污染的问题。同时，当将真菌和细菌组合使用、或不同的真菌组合使用、以及不同的细菌组合使用时，与单独使用某一种真菌或细菌相比，具有更好的修复效果。当前第1页1 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