本发明涉及一种提纯长链二羧酸的方法，特别是从微生物发酵液中获得高纯度长链二羧酸的方法。
背景技术：
长链二羧酸分子通式为CnH2n-2O4，其中n为10-18，是微生物利用液蜡等发酵而得到的代谢产物。其发酵液是复杂的多相体系，其中含有未反应的碳源、微生物细胞及碎片、未利用的培养基和代谢产物以及微生物的分泌物等，尤其是其中含有大量蛋白质、色素和灰分等杂质，严重影响产品的纯度和应用，并给该种类二羧酸的提取与精制带来了困难。
目前提取长链二羧酸的方法一般分为溶剂法和水相法。虽然溶剂法可以解决上述问题，但由于溶剂法存在投资大，设备腐蚀严重，产品中残留有溶剂和烷烃以及生产安全性和环境污染等问题，该方法的使用受到了很大限制。传统的水相提纯方法虽然克服了溶剂法的缺陷，但是其产品纯度和收率不能达到较高指标。
CN01142806.6公开的长链二羧酸精制方法中，以长链二羧酸干粉为原料，使用丙酮、甲醇和乙醇作溶剂精制长链二羧酸。该法首先发酵液中的二羧酸先经活性炭吸附后，再酸化结晶、过滤、水洗和干燥二羧酸结晶滤饼得到长链二羧酸干粉，然后采用有机溶剂进行精制。该方法精制的原料为含水的滤饼经干燥后得到二羧酸干粉，对原料含水量的限制降低了该方法的操作弹性，增加了粗酸干燥的设备，导致此工艺流程较长，增加了生产成本。而且该方法在获得二羧酸结晶滤饼之前的碱性二羧酸钠盐的水溶液中及溶剂精制过程中，共进行了两次活性炭吸附处理，相关领域的技术人员都了解，增加一次活性炭处理过程，会增加设备投资和生产成本，并且活性炭用量与产品的损失是成正比的，活性炭用量越大，产品的收率越低。而且在有机溶剂精制二羧酸时，采用吸附剂一般能达到脱色的要求，但仍较难脱除其中的小分子蛋白，使总氮含量不符合要求。
CN1255483A公开了一种水相法分离二羧酸的方法：将终止发酵液加热除去未反应的烷烃，再加硅藻过滤除菌；滤液经调pH值得到酸饼和滤液；滤液又加活性炭脱色，然后过滤；又用脱色后的滤液溶解之前得到的酸饼，酸化；最后得到结晶，经烘干得到二羧酸产品。此方法操作步骤繁琐，操作成本高，而且二羧酸产品收率太低，纯度亦不高，烷烃回收率低。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供了一种提纯长链二羧酸的方法。本发明方法采用有机溶剂沉淀的方法，有效降低了二羧酸产品中蛋白等杂质的含量，从而得到高纯度的二羧酸产品。
本发明一种提纯长链二羧酸的方法，包括以下内容：
I、将终止发酵液加热破乳，分离未反应的烷烃；
II、除去菌渣等固体杂质，得到发酵清液；
III、向发酵清液中加入丙酮、乙腈中的至少一种和活性炭，震荡混合后进行过滤；
IV、将III所得的滤液在加热蒸发设备中加入无机酸进行酸化，利用酸化过程中加热可以实现有机溶剂与发酵母液的分离，蒸馏出的有机溶剂冷凝后回收，二羧酸结晶析出，冷却、过滤、干燥得到精制的二羧酸产品。
本发明方法中，步骤I所述终止发酵液为微生物利用液蜡发酵而得到的代谢产物，其中含有的二羧酸分子通式为CnH2n-2O4，其中n为10-18，二羧酸可以是单一一种二羧酸，也可以是混合二羧酸。
本发明方法中，步骤II可以采用离心或膜过滤等常规方法和设备进行脱除菌体等杂质的操作。
本发明方法中，优选向发酵清液中先加入活性炭进行吸附，吸附结束后加入丙酮、乙腈中的至少一种，震荡混合后进行过滤。所述的活性炭优选粉末活性炭，加入量为发酵液理论含酸量的1%~10%，吸附时间为30~60min。丙酮和/或乙腈中的加入量为发酵清液体积的5%~40%。震荡混合时间20~60min。
本发明方法中，步骤III还可以加入适量的苦味酸，优选和丙酮、乙腈中的至少一种同时加入，加入量为发酵液的理论含酸量的2~5 wt%。苦味酸、丙酮和/或乙腈、活性炭共同作用，提高蛋白等杂质的沉淀效果。
本发明方法中，步骤III所述的过滤优选超滤或纳滤设备进行分离。
本发明方法中，步骤IV中所述酸化的pH值为2.0~4.0，加热温度为80~95℃，常压操作条件。冷凝回收的有机溶剂可以重复使用。本发明上述的酸化所用的酸可以是任意浓度的H2SO4、HNO3、HCl或H3PO4。
步骤IV中冷却结晶温度一般为使二羧酸充分结晶为止，温度一般为10℃～30℃。
本发明方法可以获得高纯度的单一种类的二羧酸产品，也可以获得混合二羧酸产品。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明人发现，虽然终止发酵液在加热灭活和破乳过程中已将部分蛋白等杂质变性为沉淀，而随初步过滤而除去，但后续的酸化析出二羧酸过程中，由于pH值的剧烈变化，残余的大量水溶性蛋白仍会在酸化的过程中变性，随二羧酸一并析出，包埋在晶体中因而严重影响产品质量。
本发明采用有机溶剂与苦味酸共同沉淀发酵液中未变性的蛋白、核酸等杂质，再通过过滤除去沉淀，使得发酵液中的绝大部分蛋白等杂质得以除去；水溶性的苦味酸可以与蛋白、多糖、核酸等生物分子的碱性功能团形成复合物而沉淀，而后通过过滤而除去，不会引入另外的杂质。避免了后续酸化时发酵液中残余的水溶性蛋白变性析出，影响产品质量，从而得到高纯度的二羧酸精产品。本发明方法具有工艺简单易于实现的特点，产品收率高，在较小的物耗能耗投入下，可以得到纯度高、总氮含量低的聚合级产品，更适宜于工业化生产。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步对本发明方法予以说明。
实施例1
以正十二烷烃为底物，利用热带假丝酵母发酵生产十二碳二羧酸。发酵结束时二羧酸浓度为150g/L，pH为7.2。取发酵液1000ml，加热至80℃，静置至室温，分去溶液残留的液蜡，过滤除去菌体，向发酵清液中加入1.5g粉末活性炭，搅拌脱色30min。继续向发酵清液中加入80ml丙酮，震荡混合60min，用膜孔径为10-2μm的滤膜过滤，除去活性炭和蛋白等沉淀，用6M的硫酸调节滤液pH至3，于加热蒸发装置中加热至85℃，蒸馏丙酮溶剂，蒸馏出的丙酮冷凝回收。以15℃/h匀速降至室温结晶，过滤得二羧酸滤饼，水洗至中性，干燥滤饼即得到产品。产品质量见表1。
实施例2
以正十二烷烃为底物，利用热带假丝酵母发酵生产十二碳二羧酸。发酵结束时二羧酸浓度为158 g/L，pH为7.3。取发酵液1000ml，加热至90℃，静置至室温，分去溶液残留的液蜡，过滤除去菌体，向发酵清液中加入2.5g粉末活性炭，搅拌脱色40min。继续向发酵清液中加入200ml乙腈，震荡混合60min，用膜孔径为10-2μm的滤膜过滤，除去活性炭和蛋白等沉淀，用10M的硫酸调节滤液pH至4，于加热蒸发装置中加热至90℃，蒸馏乙腈溶剂，蒸馏出的乙腈冷凝回收。
以20℃/h匀速降至室温结晶，过滤得二羧酸滤饼，水洗至中性，干燥滤饼即得到产品。产品质量见表1。
实施例3
以正十三烷烃为底物，利用热带假丝酵母发酵生产十三碳二羧酸。发酵结束时二羧酸浓度为154.3 g/L，pH为7.5。取发酵液1000ml，加热至85℃，静置至室温，分去溶液残留的液蜡，过滤除去菌体，向发酵清液中加入5g粉末活性炭，搅拌脱色60min。继续向发酵清液中加入300ml丙酮和3.2g苦味酸，震荡混合60min，用膜孔径为10-3μm的滤膜过滤，除去活性炭和蛋白等沉淀，用8M的硫酸调节滤液pH至2，于加热蒸发装置中加热至95℃，蒸馏丙酮溶剂，蒸馏出的丙酮冷凝回收。以18℃/h匀速降至室温结晶，过滤得二羧酸滤饼，水洗至中性，干燥滤饼即得到产品。产品质量见表1。
实施例4
以正十三烷烃为底物，利用热带假丝酵母发酵生产十三碳二羧酸。发酵结束时二羧酸浓度为163.0 g/L，pH为7.1。取发酵液1000ml，加热至90℃，静置至室温，分去溶液残留的液蜡，过滤除去菌体，向发酵清液中加入15g粉末活性炭，搅拌脱色60min。继续向发酵清液中加入350ml乙腈和8g苦味酸，震荡混合40min，用膜孔径为10-3μm的滤膜过滤，除去活性炭和蛋白等沉淀，用7M的硫酸调节滤液pH至3，于加热蒸发装置中加热至90℃，蒸馏乙腈溶剂，蒸馏出的乙腈冷凝回收。以15℃/h匀速降至室温结晶，过滤得二羧酸滤饼，水洗至中性，干燥滤饼即得到产品。产品质量见表1。
比较例1
发酵清液中只加入1.5g粉末活性炭，而不加入丙酮，其余同实施例1。产品质量见表1。
表1 长链二羧酸产品质量