一种硫巯化多肽的富集方法与流程

本发明涉及一种硫巯化多肽富集方法及其在细胞、组织及体液等蛋白质组样品中规模化硫巯化多肽分析中的应用。

背景技术：

大量研究结果表明，氧化应激在衰老相关多种重大疾病中都扮演了关键的病理角色。活性氧(ROS)、活性氮(RNS)通过攻击脂质大分子、蛋白质分子和DNA分子等，引起细胞生理功能的紊乱，进一步导致细胞凋亡和坏死。蛋白质的含硫氨基酸残基，包括半胱氨酸(cysteine，Cys)残基和蛋氨酸(methionine，Met)残基，都是活性氧发挥氧化-还原调节的重要作用位点。活性氧结合到这些氨基酸残基上以后，产生一种氧化-还原依赖的翻译后修饰，改变蛋白分子的结构和功能，从而进一步引起各种生物学效应。最近，硫巯化修饰是作为蛋白质半胱氨酸残基上一种新的氧化修饰得到广泛关注。目前，硫巯化修饰的富集主要集中在蛋白质水平上，尚未有大规模的组学富集方法(Angew.Chem.Int.Ed,2014,53,575-581；Sci.Signaling,2009,2,ra72)。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种可用于复杂蛋白质组样品中规模化富集硫巯化多肽的方法。为了实现该目的，本发明的技术方案是：

1)多氨基树枝状聚合物、甲醇、磷酸缓冲盐、以及碘乙酸-N-琥珀酰胺酯充分混合后，避光振荡反应0.5-24小时；

其中碘乙酸-N-琥珀酰胺酯加入摩尔量为多氨基树枝状聚合物的1-100倍，甲醇加入量为总体积的50％-80％，磷酸缓冲盐浓度为0.01-0.5M,pH为7-9，多氨基树枝状聚合物为以1,4-丁二胺为核心的氨基乙醇树枝状聚合物中的一种或二种以上，分子量范围为30000Da-100000Da。

2)制备的水溶性高分子化合物与蛋白质酶解产物充分混合后，室温避光振荡反应0.5-24小时，形成水溶性高分子-巯基多肽复合物。

其中蛋白质酶解产物加入量为水溶性高分子化合物的0.1-1倍；

3)超滤膜的截留分子量为3000Da至10000Da；使用超滤膜的离心转速为5000rpm至20000rpm。

4)二硫键还原剂为巯基乙醇、二硫苏糖醇、磷酸三氯乙酯。

其中二硫键还原剂加入摩尔量为蛋白质酶解产物摩尔量的0.5％-2％；

5)二硫键还原剂25℃-90℃温度下反应0.5-3小时，断裂硫巯化多肽上的二硫键，进而释放出多肽。

6)该硫巯化多肽富集方法应用于细胞、组织及体液等蛋白质组样品中规模化硫巯化多肽的富集。

本发明具有如下优点：

1、采用多氨基树枝状聚合物，可提供多个活性反应位点，提高巯基多肽的键合量；

2、采用超滤膜截留的方式，操作简单快速、适用面广；

3、发展的硫巯化多肽富集方法可用于复杂蛋白质组样品中规模化硫巯化多肽的富集方法。

附图说明

图1为可选择性与含巯基多肽反应的水溶性高分子化合物的合成示意图(A)及硫巯化多肽富集流程图(B)；

图2为巯基肽段富集性能评价(a)为富集前，(b)为富集后；

图3为复杂样品中硫巯化多肽的富集。

具体实施方式

实施例1

选择性与含巯基多肽反应的水溶性高分子化合物的制备：称取3mg碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，溶于400μL甲醇和200μL pH 8.0磷酸缓冲盐的混合溶液中，配置成反应溶液A；称取16mg氨基乙醇树枝状聚合物(丁二胺核，6代)，分子量为58000Da,并加入反应溶液A中，混匀后，室温振荡避光反应3小时，反应产物置于超滤膜上，截留分子量为10000Da，16000rpm离心40min，除去未反应完的碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，再用磷酸缓冲盐清洗两次，即制成选择性与含巯基多肽反应的水溶性高分子化合物1，制备流程图如图1(A)所示。

称取3mg转铁蛋白,并用50mM磷酸缓冲盐稀释至0.2mg/mL,然后放入95℃水浴锅中热变性30min,加入1M磷酸三氯乙酯10μL 56℃反应1.5h,取400μL转铁蛋白溶液，加入2μg胰蛋白酶酶解，获得的酶解产物与制备的水溶性高分子化合物1混匀后，室温避光反应12h,然后再置于超滤膜上，16000rpm离心40min,离心获得溶液采用nano-RPLC-ESI/MS/MS分析，富集流程如图1(B)所示，富集前的效果如图2(a)，富集后的效果如图2(b)所示。通过数据库匹配，富集前，转铁蛋白序列覆盖率为62％，有19条巯基多肽被检测。富集后，转铁蛋白序列覆盖率为37％，且无巯基多肽被检测，说明所制备的水溶性高分子化合物1具有较好的巯基多肽富集能力。

实施例2

选择性与含巯基多肽反应的水溶性高分子化合物的制备：称取10mg碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，溶于480μL甲醇和120μL pH 7.5磷酸缓冲盐的混合溶液中，配置成反应溶液A；称取16mg氨基乙醇树枝状聚合物(丁二胺核，6代)，分子量为58000Da,并加入反应溶液A中，混匀后，室温振荡避光反应10小时，反应产物置于超滤膜上，截留分子量为10000Da，16000rpm离心40min，除去未反应完的碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，再用磷酸缓冲盐清洗两次，即制成选择性与含巯基多肽反应的水溶性高分子化合物2，制备流程图如图1(A)所示。

取200μg HeLa细胞提取蛋白质酶解产物，依次进行95℃热变性30min,酶解24h,然后加入制备的水溶性高分子化合物2混匀，室温避光反应12h,然后再置于超滤膜上，16000rpm离心40min,再用磷酸缓冲盐清洗两次，再加入1M磷酸三氯乙酯10μL 56℃反应1.5h后,16000rpm离心40min获得产物采用nano-RPLC-ESI/MS/MS分析，如图3所示，通过数据库匹配，共鉴定1000种硫巯化多肽，说明该方法具有优异的巯基多肽富集能力。

实施例3

称取3mg碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，溶于400μL甲醇和200μL pH 8.0磷酸缓冲盐的混合溶液中，配置成反应溶液A；

称取16mg氨基乙醇树枝状聚合物(丁二胺核，4代)(分子量为30000Da),并加入反应溶液A中，制得制成选择性与含巯基多肽反应的水溶性高分子化合物，然后将其用于HeLa细胞提取蛋白质酶解产物中硫巯肽段的富集，共鉴定 出1200种硫巯化多肽，说明该方法具有优异的巯基多肽富集能力。

实施例4

称取3mg碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，溶于400μL甲醇和200μL pH 8.0磷酸缓冲盐的混合溶液中，配置成反应溶液A；

称取16mg氨基乙醇树枝状聚合物(丁二胺核，10代,分子量为100000Da),并加入反应溶液A中，制得制成选择性与含巯基多肽反应的水溶性高分子化合物，然后将其用于HeLa细胞提取蛋白质酶解产物中硫巯肽段的富集，共鉴定出980种硫巯化多肽，说明该方法具有优异的巯基多肽富集能力。

实施例5

称取3mg碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，溶于400μL甲醇和200μL pH 8.0磷酸缓冲盐的混合溶液中，配置成反应溶液A；

称取16mg氨基乙醇树枝状聚合物(丁二胺核，8代,分子量为80000Da),并加入反应溶液A中，制得制成选择性与含巯基多肽反应的水溶性高分子化合物，然后将其用于HeLa细胞提取蛋白质酶解产物中硫巯肽段的富集，共鉴定出1040种硫巯化多肽，说明该方法具有优异的巯基多肽富集能力。

给出富集能力的对比例2个以上(对比例需要完整的步骤、参数以及结论)，证明本发明方法的优异富集能力。