本发明属于生物医药及食品领域中功能食品中微生物分离纯化技术，具体涉及一种具有高抗氧化乳酸菌粉剂的制备方法。
背景技术：
酸奶和干酪是新疆的传统乳制品，其中含有大量的益生菌。近几年，越来越多的研究者开始热衷研究乳酸菌的抗氧化作用，对于机体代谢活动来说，氧化作用这一过程必不可少。虽然，人体自身可以抵御相当一部分的免疫损伤，但也并不能对这些损伤进行全部防御，另外还需要对它们进行修复，以上这些都需要机体摄入大量抗氧化剂才能保持体内代谢活动的平衡。然而，人们在摄入抗氧化剂的同时，不得不担心其安全问题，所以对于研究者们来说对天然抗氧化剂的深入探索显得迫在眉睫。
当微生物细胞在低浓度的过氧化氢或甲萘醌作用下时，可以诱导细胞产生一定的适应力，从而保护自身免受到高浓度氧化剂的损害，这种使氧化剂耐受性不断得到提高的作用机理主要是因为氧化剂可以激发机体抗氧化防御系统中的各种酶的活性。过氧化氢虽然是属于相对较弱的一种抗氧化剂，但它的优点是高扩散性和较长的作用时间，因此它能够直接造成机体抗氧化损伤或者作为羟自由基的前体物。因而，选取过氧化氢的耐受能力作为考察乳酸菌菌体抗氧化活性的一项指标。
研究表明，乳酸菌具有整肠、抑菌、抗癌、增强机体免疫力和抗衰老等许多生理功能。因此，无论从安全性还是营养保健价值方面考虑，乳酸菌作为抗氧化剂将具有很大的市场潜力。乳酸菌一般存在于蔬菜、水果、乳制品、肉制品、水产品，尤其是各类发酵食品中。如果能从食源角度筛选出具有抗氧化活性的乳酸菌，用于生产功能性发酵食品、保健品或是开发为抗衰老药品，都将对推动我国益生菌产业及促进人们身体健康具有积极作用，并会带来良好的经济和社会效益。
技术实现要素：
本发明目的之一是以新疆传统乳制品中分离纯化的乳酸菌为研究对象，采用体外抗氧化筛选及冷冻干燥技术，提供一种新的高抗氧化乳酸菌粉剂的制备方法。
为实现此目的，本发明提供如下的技术方案：
一种高抗氧化乳酸菌的筛选方法，其特征在于包括如下的步骤：
（1）菌株的选择：从新疆传统乳制品中分离出部分乳酸菌；
mrs培养基配方如下：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、硫酸镁0.58g、柠檬酸氢二铵2g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、硫酸锰0.25g、吐温1ml，去离子水1000ml，ph6.2-6.6，121℃灭菌20min。
（2）抗氧化特性初筛：将分离到的乳酸菌进行抗氧化特性初筛，得到双氧水耐受性较好的乳酸菌；
（3）进一步对乳酸菌进行筛选，对乳酸菌各组提取物中的抗氧化指标进行检测，得到一株高抗氧化乳酸菌菌株；
（4）制备菌株发酵液，并对其进行离心实验确定离心最终参数为：温度4℃、转速5000r/min、时间20min；
（5）离心后的乳酸菌菌体立即进行冷冻干燥，制成发酵剂。
本发明所述的方法，其中步骤（2）中所述的过程为：在液体mrs培养基中分别加入h2o2溶液，使得培养基中h2o2的起始浓度分别达到0.4、0.7、1.0mmol/l，然后按照2%的体积分数加入事先活化好的乳酸菌各菌株菌悬液，此时菌悬液的浓度为108ml-1，放入37℃恒温箱中培养，期间每隔2h取一次样液，测定其od值，记录各菌株在不同h2o2起始浓度下的生长曲线，筛选出具有高过氧化氢耐受性的菌株。
本发明所述的方法，其中步骤（3）中所述的抗氧化指标包括：羟自由基清除能力、dpph自由基清除能力、超氧阴离子清除能力、亚铁离子螯合能力以及还原能力，最终筛选得到的菌株为l1。
本发明所述的方法，其中步骤（4）中所述的过程为：通过单因素确定乳酸菌离心的温度、时间以及离心速度，再根据正交实验确定乳酸菌l1的最佳离心条件；
①离心温度的确定：离心力和离心时间不变，即在离心力4000r/min离心时间20min时，测定菌悬液在-4℃、4℃、20℃下离心后上清液、菌泥的活菌数，确定最佳离心温度；
②离心力的确定：离心温度和离心时间不变，确定最佳离心力，即在4000r/min、5000r/min、6000r/min时，测定离心后上清液和菌泥活菌数，计算离心损失率、离心存活率；
③离心时间的确定离心力和离心温度不变，测定离心5min、l0min、20min时上清液和菌泥活菌数，计算离心损失率、离心存活率，确定最佳离心时间；
④根据单因素确定的最佳离心温度、离心力、离心时间，进行正交试验设计，对乳酸菌l1细胞高密度富集培养后的最适离心条件进行探索研究。
本发明所述的方法，其中步骤（5）中所述的过程为：将菌悬液加入各冻干瓶中，充分混匀，置于-70℃低温冰箱中急速冷冻24h，确保形成小冰晶且完全冻结。在真空度约13.3pa条件下于真空冷冻干燥机中干燥24-72h至冻干完全，密封冻干瓶，测活菌数。
需要进一步说明的是：本发明所选用的全部乳酸菌来自新疆中亚食品研发中心（有限公司）菌种保存库，这些乳酸菌的活化、冻干方法不仅仅限于本发明所述的具体方法，培养基成分也不限于此，其它常规技术和方法都适用，只要可以提高菌种活力、并将其制备成冻干粉状方便使用即可。
本发明所述的方法，其中步骤（5）中所述的发酵剂需进行活化方可用于实际生产。活化过程中需要加入复水介质，使乳酸菌在短时间内从休眠状态变为正常的细胞，并且能修复在冷冻干燥过程中受到损伤的细胞。
本发明的方法所适用的乳酸菌种类范围较广，不仅为大规模工业化生产具有高抗氧化性的乳酸菌粉剂奠定了坚实的基础，而且使发酵食品产业更健康、稳速的进行发展提供了切实可行的依据。高抗氧化乳酸菌具有免疫调节作用，它能够增强机体特异性与非特异性免疫物质，激活吞噬细胞酶活性，选择性的杀死肠道致病菌，促进有益菌的生长，对人体有增强免疫力、抗感染、延缓衰老的功能，赋予发酵食品更强大的功能性效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更详细的描述：
实施例一
本发明采用的菌种均为新疆传统乳制品中分离筛选得到，分别为乳酸片球菌l1、植物乳杆菌l2、植物乳杆菌l3、发酵乳杆菌l4、魏斯氏菌l5，以下均使用简称。
1.抗氧化特性初筛：在液体mrs培养基中分别加入h2o2溶液，使得培养基中h2o2的起始浓度分别达到0.4、0.7、1.0mmol/l，然后按照2%的体积分数加入事先活化好的乳酸菌各菌株菌悬液，此时菌悬液的浓度为108ml-1，放入37℃恒温箱中培养，期间每隔2h取一次样液，测定其od值，记录各菌株在不同h2o2起始浓度下的生长曲线，筛选出具有高过氧化氢耐受性的菌株，包括l2、l4、l5。
2.测定以上三株乳酸菌的抗氧化指标，包括：羟自由基清除能力、dpph自由基清除能力、超氧阴离子清除能力、亚铁离子螯合能力以及还原能力，最终筛选得到的菌株为l2。
3.将l2活化后制成菌悬液，离心条件设置为温度4℃、转速5000r/min、时间20min。
4.将菌悬液加入各冻干瓶中，充分混匀，置于-70℃低温冰箱中急速冷冻24h，确保形成小冰晶且完全冻结。在真空度约13.3pa条件下于真空冷冻干燥机中干燥24-72h至冻干完全，密封冻干瓶。
5.将冻干粉剂进行活化方可用于实际生产，活化过程中需要加入复水介质，使乳酸菌在短时间内从休眠状态变为正常的细胞，并且能修复在冷冻干燥过程中受到损伤的细胞。