本发明涉及为了赋予4-羟基苯甲酸或其盐(以下，有时简称为“4-HBA”)的生产能力而实施了特定的基因操作的棒状细菌的转化体、以及使用该转化体的高效的4-HBA的制造方法。
背景技术：
：在全球变暖和石化资源枯竭问题的背景下，人们认识并关注到以可再生资源为原料的化学品的制造与生物燃料一并作为新产业生物炼制技术而成为实现低碳社会的重要策略。4-羟基苯甲酸为除了被用作抗菌剂的对羟基苯甲酸酯的合成原料以外，还被用作液晶的聚合物原料的有用的化学物质。目前，4-HBA以原油为原料用化学手段来生产。作为化学手段的4-HBA制造方法，例如存在使用苯酚、氢氧化钾和二氧化碳在高压条件下反应的方法等。这种方法不仅作为起始物质的苯酚依赖于化石原料，而且是在反应工艺中需要高温高压条件的、典型性的化学工业的高能耗型制造工艺。因此，希望开发能够一种节能型的、由可再生资源制造的、废弃物排放低的环境和谐型工艺、即希望确立利用生物法的4-HBA制造技术。但是，以往的利用以可再生资源为原料的生物法的4-HBA的生产与利用生物法的乳酸、乙醇的生产相比较，由于作为原料的糖的代谢反应阶段非常多，因此生产率低。另外，存在作为产物的4-HBA造成的细菌的增殖抑制、细胞毒性等难点。因此，无法实现工业性的生产。使用大肠杆菌能够明确4-HBA由分支酸-丙酮酸裂解酶合成，所述分支酸-丙酮酸裂解酶从作为芳香族氨基酸等的合成相关的莽草酸途径的中间体的分支酸被ubiC编码(非专利文件1、2、专利文件1、2)。迄今为止，报告了尝试将大肠杆菌来源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因(ubiC)导入作为其他种类微生物的克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)来生成4-HBA(非专利文件3)。另外，报告了增强了莽草酸途径的大肠杆菌中的4-HBA的发酵生产(非专利文件4)。进而，为了尝试4-HBA造成的增殖抑制、毒性回避，虽然报告了4-HBA抗性品系选育、离子交换树脂添加培养，但是4-HBA的生产率在实用上并不充分。另一方面，本发明人等报告了对棒状细菌导入分支酸-丙酮酸裂解酶并由葡萄糖生成苯酚，但是并没有作为中间物质的4-HBA的生成相关的记载、分支酸-丙酮酸裂解酶的酶活性相关的描述(专利文件3)。另外，关于大肠杆菌以外的ubiC，报告了类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)来源的物质，但以大肠杆菌为宿主使该基因高表达的转化体和以类球红细菌为宿主使该基因高表达的转化体均仅能以低浓度生产4-HBA，实用上并不能满足(专利文件4)。已知对大肠杆菌来源的UbiC酶详细进行了酶学性的解析，其被作为产物的4-HBA强烈抑制。因此，为了构建工业上可使用的4-HBA高生产株，高活性的UbiC的获取、对于4-HBA造成的产物抑制具有抗性的UbiC的获取、以及对于4-HBA具有抗性的宿主的选择极为重要。专利文件1：美国专利6030819专利文件2：美国专利6114157专利文件3：国际公开2012/063862专利文件4：日本特开2013-183048非专利文件1：J.Bacteriol.,174,5309-5316(1992)非专利文件2：Microbiology,140,897-904(1994)非专利文件3：Appl.Microbiol.Biotechnol.,43,985-988(1995)非专利文件4：Biotechnol.Bioeng.,76,376-390(2001)技术实现要素：本发明的课题在于提供能够以糖类、通过代谢生成并得到分支酸的化合物或分支酸为原料，高效地制造4-HBA的微生物、以及使用该微生物高效地制造4-HBA的方法。为了解决上述课题，本发明人等反复进行了研究，发现了对棒状细菌导入了由分支酸催化4-HBA的生成反应的分支酸-丙酮酸裂解酶(chorismatepyruvate-lyase)基因的转化体由葡萄糖等高效地生成4-HBA。另外，发现了该转化体在好氧且实质性地不增殖的条件下反应时，4-HBA的生产效率特别高。另外，发现了迄今为止关于报告了4-HBA的生产的几个转化体的宿主，4-HBA对它们的增殖造成的影响进行比较的结果是，在大肠杆菌、类球红细菌、谷氨酸棒状杆菌和被报告作为溶剂抗性菌的恶臭假单胞菌之中，谷氨酸棒状杆菌的4-HBA抗性最高。本发明是基于上述发现而完成的，提供以下的转化体及4-HBA的制造方法。第1项.一种具有4-羟基苯甲酸或其盐的生产能力的转化体，其通过将编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到。第2项.根据第1项所述的转化体，其中，编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因为泛菌(Pantoea)属来源的基因、普罗威登斯菌(Providencia)属来源的基因、埃希氏菌(Escherichia)属来源的基因、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)属来源的基因、克罗诺杆菌(Cronobacter)属来源的基因、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属来源的基因、肠杆菌(Enterobacter)属来源的基因、假单胞菌(Pseudomonas)属来源的基因、摩根氏菌(Morganella)属来源的基因、固氮细菌(Azotobacter)属来源的基因、希瓦氏菌(Shewanella)属来源的基因或贪铜菌(Cupriavidus)属来源的基因。第3项.根据第1项所述的转化体，其中，编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因为菠萝泛菌(Pantoeaananatis)来源的基因、拉氏普罗威登斯菌(Providenciarustigianii)来源的基因、斯氏普罗威登斯菌(Providenciastuartii)来源的基因、斯尼比普罗威登斯菌(Providenciasneebia)来源的基因、雷极普罗威登斯菌(Providenciarettgeri)来源的基因、产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)来源的基因、布氏普罗威登斯菌(Providenciaburhodogranariea)来源的基因、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)来源的基因、费格森埃希菌(Escherichiafergusonii)来源的基因、杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonaspiscicida)来源的基因、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)来源的基因、阪崎肠杆菌(Cronobactersakazakii)来源的基因、杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacteryoungae)来源的基因、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacterkoseri)来源的基因、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)来源的基因、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)来源的基因、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)来源的基因、摩根氏菌(Morganellamorganii)来源的基因、棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)来源的基因、腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)来源的基因或台湾贪铜菌(Cupriavidustaiwanensis)来源的基因。第4项.根据第1项所述的转化体，其中，编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因为下述(a)或(b)的DNA，(a)由序列号1～21中的任一个碱基序列构成的DNA(b)与由(a)中任一个碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交且编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA，或者与(a)中任一个碱基序列具有90％以上的同一性的碱基序列构成且编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA。第5项.根据第1～4项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为棒状杆菌属细菌。第6项.根据第5项所述的转化体，其中，宿主棒状杆菌属细菌为谷氨酸棒状杆菌。第7项.根据第6项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒状杆菌为棒状杆菌R(FERMBP-18976)、ATCC13032或ATCC13869。第8项.一种谷氨酸棒状杆菌HBA-2(保藏编号：NITEBP-01838)转化体。第9项.一种4-羟基苯甲酸或其盐的制造方法，其中，包括：在反应液中培养第1～8项中任一项所述的转化体的工序，所述反应液包括选自由糖类、转化体通过代谢生成分支酸的化合物和分支酸、以及它们的盐组成的组中的至少一种原料化合物；以及回收反应液中的4-羟基苯甲酸或其盐的工序。第10项.根据第9项所述的方法，在好氧且转化体不增殖的条件下培养转化体。通过使用本发明的转化体，从而能够由葡萄糖等糖类、分支酸、喹酸、莽草酸等以高效率制造4-HBA。一般而言，微生物会因4-HBA这种芳香族化合物的细胞毒性而抑制增殖，因此难以使用微生物来制造4-HBA。另外，微生物具有的分支酸-丙酮酸裂解酶的活性一般很弱，而且分支酸-丙酮酸裂解酶受到4-HBA的强烈的产物抑制，因此难以充分生产4-HBA。但是，根据本发明，使用对于4-HBA抗性优异的微生物，能够在实用上充分且高效地制造4-HBA。附图说明图1是表示4-羟基苯甲酸对四种微生物(谷氨酸棒状杆菌R、大肠埃希氏菌JM109、恶臭假单细胞S12ATCC700801和类球红细菌NBRC12203)的增殖造成的影响的图。具体实施方式下面，对本发明进行详细说明。(1)具有4-HBA生产能力的转化体本发明的具有4-HBA生产能力的转化体是将编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因导入宿主棒状细菌的转化体。宿主棒状细菌是指伯杰氏系统细菌学手册[BargeysManualofDeterminativeBacteriology,Vol.8,599(1974)]中定义的一组微生物，只要是在通常的好氧条件下增殖的棒状细菌则没有特别限定。如果列举具体例，可以列举棒状杆菌属菌、短杆菌属菌、节杆菌属菌、分枝杆菌属菌、微球菌属菌等。棒状细菌中，优选棒状杆菌属菌。作为棒状杆菌属菌，可以列举谷氨酸棒状杆菌、有效棒状杆菌(Corynebacteriumefficiens)、产氨棒状杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、耐盐棒状杆菌(Corynebacteriumhalotolerance)、解烷棒状杆菌(Corynebacteriumalkanolyticum)等。其中，从安全且4-HBA生产率高的观点出发，优选谷氨酸棒状杆菌。作为优选的菌株，可以列举：谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)R株(FERMP-18976)、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233(FERMBP-1497)、MJ-233AB-41(FERMBP-1498)等。这些菌株在布达佩斯条约下被国际保藏，是公众能够利用的。其中，优选R株(FERMP18976)、ATCC13032株、ATCC13869株。此外，根据分子生物学的分类，黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、散枝短杆菌(Brevibacteriumdivaricatum)、百合棒杆菌(Corynebacteriumlilium)等棒状细菌的菌名也统一在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)中[Liebl,W.etal.,TransferofBrevibacteriumdivaricatumDSM20297T,“Brevibacteriumflavum”DSM20411,“Brevibacteriumlactofermentum”DSM20412andDSM1412,andCorynebacteriumglutamicumandtheirdistinctionbyrRNAgenerestrictionpatterns.IntJSystBacteriol.41:255260.(1991)，駒形和男ら,コリネフォルム細菌の分類,発酵と工業,45:944963(1987)]。作为短杆菌属菌，可以列举产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes)(例如ATCC6872株)等。作为节杆菌属菌，可以列举球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)(例如ATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株)等。作为分枝杆菌属菌，可以列举牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)(例如ATCC19210株、ATCC27289株)等。作为微球菌属菌，可以列举弗氏微球菌(Micrococcusfreudenreichii)(例如No.239株(FERMP13221))、藤黄微球菌(Micrococcusleuteus)(例如No.240株(FERMP13222))、脲微球菌(Micrococcusureae)(例如IAM1010株)、玫瑰色微球菌(Micrococcusroseus)(例如IFO3764株)等。另外，除了野生株以外，棒状细菌也可以是其突变株或人工的基因重组体。例如，可以列举乳酸脱氢酶(乳酸脱氢酶，LDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyrvatecarboxylase)、苹果酸脱氢酶(malatedehydrogenase)等的基因的破坏株。其中，优选乳酸脱氢酶基因的破坏株。该基因破坏株中，乳酸脱氢酶基因被破坏，由此使丙酮酸至乳酸的代谢途径被阻断。其中，优选谷氨酸棒状杆菌的、特别是R(FERMP18976)株的乳酸脱氢酶基因的破坏株。这种基因破坏株可以通过基因工程的方法按照常规方法来制作。例如，在WO2005/010182A1中记载了乳酸脱氢酶破坏株及其制作方法。如图1所示，本发明人等发现棒状细菌与其他细菌相比，对于4-HBA的抗性极高。从这点来看，棒状细菌适于利用本发明方法的4-HBA制造。分支酸-丙酮酸裂解酶酶基因分支酸-丙酮酸裂解酶是催化由分支酸产生4-HBA和丙酮酸的反应的酶。编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因的来源没有特别限定，可以列举泛菌(Pantoea)属、普罗威登斯菌(Providencia)属、埃希氏菌(Escherichia)属、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)属、克罗诺杆菌(Cronobacter)属、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属、肠杆菌(Enterobacter)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、摩根氏菌(Morganella)属、固氮细菌(Azotobacter)属、希瓦氏菌(Shewanella)属或贪铜菌(Cupriavidus)属微生物来源的基因。从酶的比活力高这点来看，优选泛菌属、普罗威登斯菌属、埃希氏菌属、假交替单胞菌属、克罗诺杆菌属、柠檬酸杆菌属或肠杆菌属微生物来源的基因，从难以受到4-HBA造成的产物抑制这点来看，优选普罗威登斯菌属、肠杆菌属、希瓦氏菌属或贪铜菌属微生物来源的基因，从转化体的4-HBA生产率良好这点来看，优选泛菌属、普罗威登斯菌属、埃希氏菌属或克罗诺杆菌属微生物来源的基因。综合来看，更优选普罗威登斯菌属或克罗诺杆菌属来源的基因。具体而言，可以列举菠萝泛菌(Pantoeaananatis)、拉氏普罗威登斯菌(Providenciarustigianii)、斯氏普罗威登斯菌(Providenciastuartii)、斯尼比普罗威登斯菌(Providenciasneebia)、雷极普罗威登斯菌(Providenciarettgeri)、产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)、布氏普罗威登斯菌(Providenciaburhodogranariea)、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、费格森埃希菌(Escherichiafergusonii)、杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonaspiscicida)、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)、阪崎肠杆菌(Cronobactersakazakii)、杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacteryoungae)、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacterkoseri)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、摩根氏菌(Morganellamorganii)、棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)、腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)或台湾贪铜菌(Cupriavidustaiwanensis)来源的基因。作为菠萝泛菌来源的基因，可以列举由序列号1的碱基序列构成的基因，作为拉氏普罗威登斯菌来源的基因，可以列举由序列号2的碱基序列构成的基因，作为斯氏普罗威登斯菌来源的基因，可以列举由序列号3的碱基序列构成的基因，作为斯尼比普罗威登斯菌来源的基因，可以列举由序列号4的碱基序列构成的基因，作为雷极普罗威登斯菌来源的基因，可以列举由序列号5的碱基序列构成的基因，作为产碱普罗威登斯菌来源的基因，可以列举由序列号6的碱基序列构成的基因，作为布氏普罗威登斯菌(Providenciaburhodogranariea)来源的基因，可以列举由序列号7的碱基序列构成的基因，作为大肠埃希氏菌来源的基因，可以列举由序列号8的碱基序列构成的基因，作为费格森埃希菌来源的基因，可以列举由序列号9的碱基序列构成的基因，作为杀鱼假交替单胞菌来源的基因，可以列举由序列号10的碱基序列构成的基因，作为游海假交替单胞菌来源的基因，可以列举由序列号11的碱基序列构成的基因，作为阪崎肠杆菌来源的基因，可以列举由序列号12的碱基序列构成的基因，作为杨氏柠檬酸杆菌来源的基因，可以列举由序列号13的碱基序列构成的基因，作为克氏柠檬酸杆菌来源的基因，可以列举由序列号14的碱基序列构成的基因，作为产气肠杆菌来源的基因，可以列举由序列号15的碱基序列构成的基因，作为阴沟肠杆菌来源的基因，可以列举由序列号16的碱基序列构成的基因，作为恶臭假单胞菌来源的基因，可以列举由序列号17的碱基序列构成的基因，作为摩根氏菌来源的基因，可以列举由序列号18的碱基序列构成的基因，作为棕色固氮菌来源的基因，可以列举由序列号19的碱基序列构成的基因，作为腐败希瓦氏菌来源的基因，可以列举由序列号20的碱基序列构成的基因，作为台湾贪铜菌来源的基因，可以列举由序列号21的碱基序列构成的基因。另外，还可以使用与碱基序列1～21中任一个碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交的DNA、且编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA(同源物)。在本发明中，“严格的条件”是指在6×SSC的盐浓度的杂交溶液中，在50～60℃的温度条件下，进行16小时杂交，在0.1×SSC的盐浓度的溶液中进行清洗的条件。另外，还可以使用与碱基序列1～21中任一个碱基序列具有90％以上、其中95％以上、其中98％以上的同一性的碱基序列构成的DNA、且编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA(同源物)。在本发明中，碱基序列的同一性是利用GENETYXver.8(GENETYX株式会社ゼネティックス制造)计算出的值。分支酸-丙酮酸裂解酶活性可以改变“Microbiology,140,897-904(1994)”中记载的方法来测定。简单来说，向试验用液中添加被测酶，使其含有50mMTris-HCl(pH7.5)，0.5mM分支酸钡盐，0.2mMNADH，0.2MNaCl，5Unit乳酸脱氢酶，在33℃进行反应，通过追踪来源于NADH的340nm的吸光度的减少从而测定反应初速度。对于不添加分支酸钡盐的体系也同样进行反应，作为背景值。将两个测定值的差作为分支酸-丙酮酸裂解酶活性，当确认到依赖于酶和基质的添加的NADH来源的340nm的随时间变化的、线性的吸光度减少时，判定为具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性。酶活性的1unit定义为每1分钟产生1微摩尔的4-HBA的酶量，根据酶反应的初速度计算出。由碱基序列1～21中任一个碱基序列构成的DNA的同源物例如可以通过使用基于这些碱基序列按照常规方法设计的引物或探针的PCR或杂交，从其他生物种的DNA文库中选择，由此以高概率得到编码具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA。另外，本发明的转化体优选4-羟基苯甲酸脱羧酶基因未被导入。4-羟基苯甲酸脱羧酶为将4-HBA转换为苯酚的酶。由于棒状细菌不具有内源性4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，因此不导入外源性的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因时，棒状细菌不进行从4-HBA向苯酚的转换。另一方面，在分支酸-丙酮酸裂解酶基因的基础上还导入4-羟基苯甲酸脱羧酶基因时，转化体由葡萄糖等糖类经由4-HBA生产苯酚。但是，一般而言，苯酚比4-HBA对于酶的抑制力格外强，因此欲由糖类经过多阶段的反应制造苯酚时，苯酚会抑制很多酶，因此苯酚制造效率恶化。另一方面，使用导入了分支酸-丙酮酸裂解酶基因而未导入4-羟基苯甲酸脱羧酶基因的转化体，由糖类一度制造毒性比较低的4-HBA，另行使用导入了4-羟基苯甲酸脱羧酶基因的转化体或4-羟基苯甲酸脱羧酶基因自身由4-HBA制造苯酚时，由于受到苯酚影响的酶仅为4-羟基苯甲酸脱羧酶，因此苯酚制造效率比较良好。另外，一般而言，苯酚比4-HBA的细胞毒性也格外强。使用微生物由糖类制造苯酚时，由于经过多阶段的反应，因此苯酚制造会耗费时间。因此，微生物被长时间暴露于生成的苯酚中并受到毒性的影响，苯酚制造效率恶化。另一方面，如果使用导入了分支酸-丙酮酸裂解酶基因而未导入4-羟基苯甲酸脱羧酶基因的转化体，由糖类生成细胞毒性比较低的4-HBA，则即使经过多阶段的反应而需要长时间，转化体受到的损害也少。进而，另行通过使用导入了4-羟基苯甲酸脱羧酶基因的转化体或4-羟基苯甲酸脱羧酶基因自身由4-HBA制造苯酚时，能够由糖类高效地制造苯酚。用于转化体的载体的构建将通过PCR扩增得到的编码分支酸-丙酮酸裂解酶的DNA分别克隆到能够在宿主中扩增的适当的载体中即可。作为质粒载体，只要是包含在棒状细菌内担负自主复制功能的基因的质粒载体即可。作为其具体例，可以列举：乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)2256来源的pAM330[日本特开昭58-67699号公报]、[Miwa,K.etal.,Crypticplasmidsinglutamicacidproducingbacteria.Agric.Biol.Chem.48:29012903(1984)]和[Yamaguchi,R.etal.,DeterminationofthecompletenucleotidesequenceofttheBrevibacteriumlactofermentumplasmidpAM330andtheanalysisofitsgeneticinformation.NucleicAcidsSymp.Ser.16:265267(1985)]、谷氨酸棒状杆菌ATCC13058来源的pHM1519[Miwa,K.etal.,Crypticplasmidsinglutamicacidproducingbacteria.Agric.Biol.Chem.48:29012903(1984)]和pCRY30[Kurusu,Y.etal.,Identificationofplasmidpartitionfunctionincoryneformbacteria.Appl.Environ.Microbiol.57:759764(1991)]、谷氨酸棒状杆菌T250来源的pCG4[日本特开昭57-183799号公报]、[Katsumata,R.etal.,ProtoplasttransformationofglutamateproducingbacteriawithplasmidDNA.J.Bacteriol.、159:306311(1984)]、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50[日本特开昭62-166890]、pEK0、pEC5、pEKEx1[Eikmanns，B.J.etal.,AfamilyofCorynebacteriumglutamicum/Escherichiacolishuttlevectorsforcloning,controlledgeneexpression，andpromoterprobing.Gene，102:9398(1991)]等。作为优选的启动子，可以列举谷氨酸棒状杆菌R来源的甘油醛3-磷酸脱氢酶A基因(gapA)的启动子PgapA、苹果酸脱氢酶基因(mdh)的启动子Pmdh、乳酸脱氢酶A基因(ldhA)的启动子PldhA等，其中，优选PgapA。作为优选的终止子，可以列举大肠杆菌rRNA操纵子的rrnBT1T2终止子、大肠杆菌的trpA终止子、乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)的trp终止子等，其中，优选rrnBT1T2终止子。转化转化方法可以没有限制地使用公知的方法。作为这样的公知的方法，可以列举例如氯化钙/氯化铷法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔法等。其中，对于棒状细菌优选电脉冲法，电脉冲法可以通过公知的方法进行[Kurusu，Y.etal.，ElectroporationtransformationsystemforCoryneformbacteriabyauxotrophiccomplementation.Agric.Biol.Chem.54:443447(1990)]。转化体使用微生物的培养中通常使用的培养基进行培养即可。作为该培养基，通常可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基。作为碳源，可以列举：葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、甘露糖醇、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、淀粉、糖蜜、山梨糖醇、甘油等糖质或糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸或葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇。碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的这些碳源的浓度通常设定为约0.1～10(w/v％)即可。作为氮源，可以列举：氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，还可以利用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的氮源浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为10(w/v％)即可。作为无机盐类，可以列举例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴或碳酸钙等。这些无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的无机盐类浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.1～1(w/v％)即可。作为营养物质，例如可以得到肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物或者动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等，通常设定为约0.1～10(w/v％)即可。进而，还可以根据需要添加维生素类。作为维生素类，例如可以列举生物素、硫胺素、吡哆醇、泛酸、肌醇、尼克酸等。培养基的pH优选约6～8。作为优选的微生物培养培养基，可以列举A培养基[Inui，M.etal.，MetabolicanalysisofCorynebacteriumglutamicumduringlactateandsuccinateproductionsunderoxygendeprivationconditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182196(2004)]、BT培养基[Omumasaba，C.A.etal.,Corynebacteriumglutamicumglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseisoformswithopposite，ATPdependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91103(2004)]等。培养温度设定为约15℃～45℃即可，培养时间设定为约1～7天即可。宿主染色体基因的破坏或缺失宿主棒状细菌中，优选存在于其染色体上的4-羟基苯甲酸羟化酶基因被破坏或发生缺失。通过破坏4-羟基苯甲酸羟化酶导致生成的4-HBA的代谢被抑制，4-HBA的生产率提高的同时副产物减少。制作以使基因的部分序列缺失而不产生正常发挥功能的酶蛋白的方式进行改变后的缺失型基因，利用包含该基因的DNA转化细菌，在缺失型基因与染色体上的基因之间引起同源重组，由此能够将染色体上的基因置换成缺失型或破坏型的基因。由缺失型或破坏型的基因编码的酶蛋白即使生成也具有与野生型酶蛋白不同的立体结构，功能降低或消失。由这种利用同源重组的基因置换所致的基因缺失或破坏方法已经确立，有使用包含温度敏感性复制起点的质粒、能够进行接合转移的质粒的方法、利用在宿主内不具有复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号、日本特开平05-007491号)。(2)4-HBA的制造方法可以通过包括：在反应液中培养上述说明的本发明的转化体的工序，所述反应液含有选自由糖类、转化体通过代谢生成并得到分支酸的化合物和分支酸、以及它们的盐组成的组中的至少一种原料化合物；以及回收反应液中的4-HBA的工序的方法来制造4-HBA。原料化合物为需要使转化体进入细胞内的化合物，另外，优选在植物中大量包含等、工业上易于利用的原料化合物。作为糖类，优选葡萄糖，但是还可以使用通过代谢生成并得到葡萄糖的糖类。在这样的糖类中包含具有葡萄糖单位的低聚糖或多糖类。作为这样的糖类，可以列举果糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖等单糖类；纤维二糖，蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、木二糖等二糖类；糊精或可溶性淀粉等多糖类等。另外，作为通过代谢生成并得到分支酸的化合物，可以列举喹酸、莽草酸等。另外，作为例如包括这些原料化合物的原料，还可以使用糖蜜。另外，还可以使用将秸秆(水稻秸秆、大麦秸秆、小麦秸秆、黑麦秸秆、燕麦秸秆等)、甘蔗渣、玉米秸秆等非可食农产品废弃物、柳枝稷、象草、芒草等能源作物、木屑、废纸等通过糖化酶等糖化的、包含葡萄糖等多种糖的糖化液。其中，作为原料化合物，优选葡萄糖、分支酸、喹酸、莽草酸。微生物的增殖在反应之前，优选将转化体在好氧条件下、在温度约25℃～38℃下培养约12～48小时而使其增殖。培养用培养基反应之前的转化体的好氧培养中使用的培养基，可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基。作为碳源，还可以使用糖类(葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等)；甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇；正链烷烃等烃等。碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，还可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。氮源在培养基中的浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1～10(w/v％)即可。作为无机盐类，可以列举例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。无机盐在培养基中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01～1(w/v％)即可。作为营养物质，可以列举肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物、动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质在培养基中的浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1～10(w/v％)即可。进而，还可以根据需要添加维生素类。作为维生素类，可以列举生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。培养基的pH优选约6～8。作为具体的优选的棒状细菌用培养基，可以列举A培养基[Inui,M.etal.,MetabolicanalysisofCorynebacteriumglutamicumduringlactateandsuccinateproductionsunderoxygendeprivationconditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182196(2004)]、BT培养基[Omumasaba,C.A.etal.,Corynebacteriumglutamicumglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseisoformswithopposite,ATPdependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91103(2004)]等。这些培养基中，使糖类浓度在上述范围内来使用即可。反应液作为反应液，可以使用含有碳源、氮源、无机盐类等的天然反应液或合成反应液。作为碳源，使用上述说明的原料化合物或包含该原料化合物的糖蜜、糖化液等即可。作为碳源，除了糖类以外，还可以使用甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇；正链烷烃等烃等。碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。反应液中的原料化合物的浓度优选约1～20(w/v％)，更优选约2～10(w/v％)，进一步优选约2～5(w/v％)。另外，包括原料化合物的全部碳源的浓度设定为约2～5(w/v％)即可。作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，还可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。氮源在反应液中的浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1～10(w/v％)即可。作为无机盐类，可以列举例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。无机盐在反应液中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01～1(w/v％)即可。进而，还可以根据需要添加维生素类。作为维生素类，可以列举生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。反应液的pH优选约6～8。作为具体的优选的棒状细菌用反应液，可以列举前述的BT培养基等。这些培养基中，使糖类浓度在上述范围内来使用即可。反应条件反应温度即转化体的存活温度优选约20℃～50℃，更优选约25℃～47℃。如果为上述温度范围，则能够高效地制造4-HBA。另外，反应时间优选约1～7天，更优选约1～3天。培养可以是分批培养、流加培养、连续培养中的任何一种。其中，优选分批培养。反应可以在好氧条件下进行，也可以在还原条件下进行。本发明的转化体自身的4-HBA生产能力在好氧条件下更高。但是，由于在好氧条件下转化体增殖，因此原料化合物因增殖而消耗，导致4-HBA制造效率下降。因此，优选在好氧且转化体不增殖的条件下进行反应。本发明中的不增殖包括实质上不增殖或几乎不增殖。例如，通过使用使作为微生物的增殖所必须的化合物的生物素、硫胺素等维生素类等、氮源等的一种以上缺失或限制的反应液，从而能够回避或抑制转化体的增殖。另外，在还原条件下，由于棒状细菌实质上不增殖，原料化合物不因增殖而被消耗，因此4-HBA制造效率提高。还原条件由反应液的氧化还原电位规定。反应液的氧化还原电位优选约200mV～500mV，更优选约150mV～500mV。反应液的还原状态可以简单地利用刃天青指示剂(在还原状态下由蓝色脱色为无色)推测，使用氧化还原电位差计(例如，BROADLEYJAMES公司制造，ORPElectrodes)能够准确地测定。处于还原条件下的反应液的制备方法可以没有限制地使用公知的方法。例如，可以使用反应液用水溶液代替蒸馏水等作为反应液的液体介质，反应液用水溶液的制备方法例如参考硫酸还原微生物等绝对厌氧性微生物用的培养液制备方法(Pfennig,Net.al.(1981):Thedissimilatorysulfatereducingbacteria,InTheProkaryotes,AHandbookonHabitats,IsolationandIdentificationofBacteria,Ed.byStarr,M.P.et.al.p.926940,Berlin,SpringerVerlag.)或“農芸化学実験書第三巻、京都大学農学部農芸化学教室編、1990年第26刷、産業図書株式会社出版(农艺化学实验书第三卷、京都大学农学部农艺化学教室编、1990年第26次印刷、产业图书株式会社出版)”等，能够得到期望的还原条件下的水溶液。具体而言，可以通过对蒸馏水等进行加热处理或减压处理将溶解气体除去而得到还原条件的反应液用水溶液。在这种情况下，可以通过在约10mmHg以下、优选约5mmHg以下、更优选约3mmHg以下的减压条件下，将蒸馏水等处理约1～60分钟、优选约5～40分钟来将溶解气体、特别是溶解氧除去而得到还原条件下的反应液用水溶液。另外，也可以添加适当的还原剂(例如，硫代乙醇酸、抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、巯基乙酸、硫代乙酸、谷胱甘肽、硫化钠等)来制备还原条件的反应液用水溶液。将上述方法适当组合而成的方法也是有效的还原条件的反应液用水溶液的制备方法。在还原条件下使其反应时，反应中也优选将反应液维持于还原条件。为了维持反应过程中的还原条件，优选尽可能地防止从反应体系外混入氧，具体而言，可以列举将反应体系用氮气等惰性气体或二氧化碳等密封的方法。作为更有效地防止氧混入的方法，为了在反应过程中使本发明的好氧性细菌的菌体内的代谢功能高效地发挥作用，有时也需要添加维持反应体系的pH调节液或适当添加各种营养素溶解液，在这种情况下，预先从添加溶液中除去氧是有效的。4-HBA的回收通过以上述方式进行培养，在反应液中生产出4-HBA。可以通过回收反应液来回收4-HBA，也可以进一步利用公知的方法从反应液中分离出4-HBA。作为这种公知的方法，可以列举离子交换树脂法、浓缩法、晶析法、膜分离法、有机溶剂提取法、各种吸附法等。实施例14-羟基苯甲酸生产基因(分支酸-丙酮酸裂解酶基因)的克隆和表达(1)从微生物中提取染色体DNA从菠萝泛菌(Pantoeaananatis)LMG20103中提取染色体DNA的操作如下进行：向LMGBacteriaCultureMediumNo.1培养基[将1g的牛肉提取物、2g的酵母提取物、5g的蛋白胨、5g的NaCl溶解在1L蒸馏水中后，将pH调整为7.4]中使用白金环接种后，在28℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从拉氏普罗威登斯菌(Providenciarustigianii)JCM3953中提取染色体DNA的操作如下进行：向JCMMediumNo.12培养基[将5g的蛋白胨、3g的牛肉提取物、5g的NaCl溶解在1L蒸馏水中后，将pH调整为7.0]中使用白金环接种后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从斯氏普罗威登斯菌(Providenciastuartii)ATCC25827中提取染色体DNA的操作如下进行：向ATCCMediumNo.3培养基[将5g的蛋白胨、3g的牛肉提取物溶解在1L蒸馏水中后，将pH调整为6.8]中使用白金环接种后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从斯尼比普罗威登斯菌(Providenciasneebia)JCM16941中提取染色体DNA的操作如下进行：向JCMMediumNo.27培养基[将15g的蛋白胨、5g的大豆蛋白胨、5g的氯化钠溶解在1L蒸馏水中]中使用白金环接种后，在28℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从雷氏普罗威登斯菌(Providenciarettgeri)JCM1675中提取染色体DNA的操作如下进行：向JCMMediumNo.12培养基[将5g的蛋白胨、3g的牛肉提取物、5g的NaCl溶解在1L蒸馏水中后，将pH调整为7.0]中使用白金环接种后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)JCM1673中提取染色体DNA的操作如下进行：向JCMMediumNo.12培养基[将5g的蛋白胨、3g的牛肉提取物、5g的NaCl溶解在1L蒸馏水中后，将pH调整为7.0]中使用白金环接种后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从布氏普罗威登斯菌(Providenciaburhodogranariea)JCM16940中提取染色体DNA的操作如下进行：向JCMMediumNo.27培养基[将15g的蛋白胨、5g的大豆蛋白胨、5g的氯化钠溶解在1L蒸馏水中]中使用白金环接种后，在28℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)K12MG1655中提取染色体DNA的操作如下进行：向LB培养基[将10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的NaCl溶解在1L蒸馏水中]中使用白金环接种后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从费格森埃希菌(Escherichiafergusonii)NBRC102419中提取染色体DNA的操作如下进行：向NBRCMediumNo.802培养基[将10g的多蛋白胨、2g的酵母提取物、1g的MgSO4·7H2O溶解在1L蒸馏水中后，将pH调整为7.0]中使用白金环接种后，在30℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonaspiscicida)JCM20779中提取染色体DNA的操作如下进行：向JCMMediumNo.118培养基[将37.4g的MARINEBROTH-2216(碧迪公司制造)溶解在1L蒸馏水中]中使用白金环接种后，在30℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)NBRC102225中提取染色体DNA的操作如下进行：向NBRCMediumNo.304培养基[将37.4g的MARINEBROTH-2216(碧迪公司制造)溶解在1L蒸馏水中]中使用白金环接种后，在25℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从阪崎肠杆菌(Cronobactersakazakii)JCM1233中提取染色体DNA的操作如下进行：向JCMMediumNo.12培养基[将5g的蛋白胨、3g的牛肉提取物、5g的NaCl溶解在1L蒸馏水中后，将pH调整为7.0]中使用白金环接种后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacteryoungae)ATCC29220中提取染色体DNA的操作如下进行：向ATCCMediumNo.3培养基[将5g的蛋白胨、3g的牛肉提取物溶解在1L蒸馏水中后，将pH调整为6.8]中使用白金环接种后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从克氏柠檬酸杆菌(Citrobacterkoseri)ATCCBAA-895中提取染色体DNA的操作如下进行：向ATCCMediumNo.18培养基[将15g的蛋白胨、5g的大豆蛋白胨、5g的氯化钠溶解在1L蒸馏水中]中使用白金环接种后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)NBRC13534中提取染色体DNA的操作如下进行：向NBRCMediumNo.802培养基[将10g的多蛋白胨、2g的酵母提取物、1g的MgSO4·7H2O溶解在1L蒸馏水中后，将pH调整为7.0]中使用白金环接种后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)NBRC13535中提取染色体DNA的操作如下进行：向NBRCMediumNo.802培养基[将10g的多蛋白胨、2g的酵母提取物、1g的MgSO4·7H2O溶解在1L蒸馏水中后，将pH调整为7.0]中使用白金环接种后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)ATCC47054中提取染色体DNA的操作如下进行：向ATCCMediumNo.1065培养基[将10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的NaCl溶解在1L蒸馏水中]中使用白金环接种后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从摩根氏菌(Morganellamorganii)NBRC3848中提取染色体DNA的操作如下进行：向NBRCMediumNo.802培养基[将10g的多蛋白胨、2g的酵母提取物、1g的MgSO4·7H2O溶解在1L蒸馏水中后，将pH调整为7.0]中使用白金环接种后，在30℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)ATCC9104中提取染色体DNA的操作如下进行：向NBRCMediumNo.805培养基[将1g的酵母提取物、5g的Mannitol,0.7g的K2HPO4、0.1g的KH2PO4、1g的MgSO4·7H2O溶解在1L蒸馏水中后，将pH调整为7.0-7.2]中使用白金环接种后，在26℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)JCM20190中提取染色体DNA的操作如下进行：向JCMMediumNo.22培养基[将10g的蛋白胨、10g的牛肉提取物,5g的NaCl溶解在1L蒸馏水中后，将pH调整为7.0-7.2]中使用白金环接种后，在25℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。从台湾贪铜菌(Cupriavidustaiwanensis)LMG19424中提取染色体DNA的操作如下进行：向JCMMediumNo.27培养基[将15g的蛋白胨、5g的大豆蛋白胨、5g的氯化钠溶解在1L蒸馏水中]中使用白金环接种后，在25℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。4-羟基苯甲酸生产基因(分支酸-丙酮酸裂解酶基因)的克隆通过以下的PCR法对包括编码4-羟基苯甲酸生产基因(分支酸-丙酮酸裂解酶基因)的ubiC基因的DNA片段进行扩增。当PCR时，使用包含ubiC基因的基因序列克隆ubiC基因，针对序列号1(PantoeaananatisubiC基因)、序列号2(ProvidenciarustigianiiubiC基因)、序列号3(ProvidenciastuartiiubiC基因)、序列号4(ProvidenciasneebiaubiC基因)、序列号5(ProvidenciarettgeriubiC基因)、序列号6(ProvidenciaalcalifaciensubiC基因)、序列号7(ProvidenciaburhodogranarieaubiC基因)、序列号8(EscherichiacoliubiC基因)、序列号9(EscherichiafergusoniiubiC基因)、序列号10(PseudoalteromonaspiscicidaubiC基因)、序列号11(PseudoalteromonashaloplanktisubiC基因)、序列号12(CronobactersakazakiiubiC基因)、序列号13(CitrobacteryoungaeubiC基因)、序列号14(CitrobacterkoseriubiC基因)、序列号15(EnterobacteraerogenesubiC基因)、序列号16(EnterobactercloacaeubiC基因)、序列号17(PseudomonasputidaubiC基因)、序列号18(MorganellamorganiiubiC基因)、序列号19(AzotobactervinelandiiubiC基因)、序列号20(ShewanellaputrefaciensubiC基因)、序列号21(CupriavidustaiwanensisubiC基因)，分别合成下述一对引物来使用。PantoeaananatisubiC基因扩增用引物(a-1)；5’-CTCTCATATGACGCAAGACCCGCT-3’(序列号22)(b-1)；5’-CTCTCATATGTTAACCTTGATCACGATAGAGCG-3’(序列号23)另外，引物(a-1)和(b-1)上附加有NdeI限制性内切酶位点。ProvidenciarustigianiiubiC基因扩增用引物(a-2)；5’-CTCTCATATGCATGAAACAATTTTTACCCATCATCC-3’(序列号24)(b-2)；5’-CTCTCATATGGATTATGTTAGATAGTTATCTATATGCAGGTG-3’(序列号25)另外，引物(a-2)和(b-2)上附加有NdeI限制性内切酶位点。ProvidenciastuartiiubiC基因扩增用引物(a-3)；5’-CTCTCATATGGATGAAACGCTTTTTATCTCTCAC-3’(序列号26)(b-3)；5’-CTCTCATATGTCCCTCCATTTGTTGTGCTC-3’(序列号27)另外，引物(a-3)和(b-3)上附加有NdeI限制性内切酶位点。ProvidenciasneebiaubiC基因扩增用引物(a-4)；5’-CTCTCATATGGATGATACGCTTTTTACCTCTC-3’(序列号28)(b-4)；5’-CTCTCATATGCTTCCCTTCACTTGTCATGC-3’(序列号29)另外，引物(a-4)和(b-4)上附加有NdeI限制性内切酶位点。ProvidenciarettgeriubiC基因扩增用引物(a-5)；5’-CTCTCATATGGATGAAACGCTTTTTACTTCTCAG-3’(序列号30)(b-5)；5’-CTCTCATATGTTAACGATATGCAGGTGATTCAGG-3’(序列号31)另外，引物(a-5)和(b-5)上附加有NdeI限制性内切酶位点。ProvidenciaalcalifaciensubiC基因扩增用引物(a-6)；5’-CTCTCATATGCATGAAACGATTTTTACCTCTCATC-3’(序列号32)(b-6)；5’-CTCTCATATGGTTATCTATATGCAGGTGATTCAGG-3’(序列号33)另外，引物(a-6)和(b-6)上附加有NdeI限制性内切酶位点。ProvidenciaburhodogranarieaubiC基因扩增用引物(a-7)；5’-CTCTCATATGGATGAAACGCTTTTTACCTCTC-3’(序列号34)(b-7)；5’-CTCTCATATGATACTTCCCTCCACTTGTCG-3’(序列号35)另外，引物(a-7)和(b-7)上附加有NdeI限制性内切酶位点。EscherichiacoliubiC基因扩增用引物(a-8)；5’-CTCTCATATGTCACACCCCGCGTTAA-3’(序列号36)(b-8)；5’-CTCTCATATGTTAGTACAACGGTGACGCC-3’(序列号37)另外，引物(a-8)和(b-8)上附加有NdeI限制性内切酶位点。EscherichiafergusoniiubiC基因扩增用引物(a-9)；5’-CTCTCATATGCTGATTTTGCAACAACTGGTG-3’(序列号38)(b-9)；5’-CTCTCATATGTTAGTACAACGGTGATGCAGG-3’(序列号39)另外，引物(a-9)和(b-9)上附加有NdeI限制性内切酶位点。PseudoalteromonaspiscicidaubiC基因扩增用引物(a-10)；5’-CTCTCATATGCCTTTGCAATTACCCTTAGAG-3’(序列号40)(b-10)；5’-CTCTCATATGAAGCCTGCCATTTCTGGTGG-3’(序列号41)另外，引物(a-10)和(b-10)上附加有NdeI限制性内切酶位点。PseudoalteromonashaloplanktisubiC基因扩增用引物(a-11)；5’-CTCTCATATGATTACTTTCCCTGTTTCATTATCTGC-3’(序列号42)(b-11)；5’-CTCTCATATGTCATGAGTACAAATACGCTCCTG-3’(序列号43)另外，引物(a-11)和(b-11)上附加有NdeI限制性内切酶位点。CronobactersakazakiiubiC基因扩增用引物(a-12)；5’-CTCTCATATGTCCCATCCCGCGCTGAG-3’(序列号44)(b-12)；5’-CTCTCATATGTATTCTGCGTCAGGCTCCAC-3’(序列号45)另外，引物(a-12)和(b-12)上附加有NdeI限制性内切酶位点。CitrobacteryoungaeubiC基因扩增用引物(a-13)；5’-CTCTCATATGCCACACCCTGCGTTAA-3’(序列号46)(b-13)；5’-CTCTCATATGTCAGTACAACGGCGATGCA-3’(序列号47)另外，引物(a-13)和(b-13)上附加有NdeI限制性内切酶位点。CitrobacterkoseriubiC基因扩增用引物(a-14)；5’-CTCTCATATGTCACACCCTGCGTTAAC-3’(序列号48)(b-14)；5’-CTCTCATATGTTAATACAACGGTGATGCGGG-3’(序列号49)另外，引物(a-14)和(b-14)上附加有NdeI限制性内切酶位点。Enterobacteraerogenes,ubiC基因扩增用引物(a-15)；5’-CTCTCATATGCCACATCCTGCGCTTAC-3’(序列号50)(b-15)；5’-CTCTCATATGTTAATACAATGGCGATGCAGGC-3’(序列号51)另外，引物(a-15)和(b-15)上附加有NdeI限制性内切酶位点。EnterobactercloacaeubiC基因扩增用引物(a-16)；5’-CTCTCATATGTCACACCCTGCGCTAA-3’(序列号52)(b-16)；5’-CTCTCATATGTCAGTACAACGGCGATGC-3’(序列号53)另外，引物(a-16)和(b-16)上附加有NdeI限制性内切酶位点。PseudomonasputidaubiC基因扩增用引物(a-17)；5’-CTCTCATATGTCGTACGAATCCCCG-3’(序列号54)(b-17)；5’-CTCTCATATGTCAGCGGTTTTCCTCCTTG-3’(序列号55)另外，引物(a-17)和(b-17)上附加有NdeI限制性内切酶位点。MorganellamorganiiubiC基因扩增用引物(a-18)；5’-CTCTCATATGACACAAACAGTGATAACACCC-3’(序列号56)(b-18)；5’-CTCTCATATGCCACGTTATTCTTCTCCGAG-3’(序列号57)另外，引物(a-18)和(b-18)上附加有NdeI限制性内切酶位点。AzotobactervinelandiiubiC基因扩增用引物(a-19)；5’-CTCTCATATGACCGCTGCTCCCG-3’(序列号58)(b-19)；5’-CTCTCATATGTTATAGGGTGTCCGGGTC-3(序列号59)另外，引物(a-19)和(b-19)上附加有NdeI限制性内切酶位点。Shewanellaputrefaciens,ubiC基因扩增用引物(a-20)；5’-CTCTCATATGAATGTGACTAGCTTAAGCTTCC-3’(序列号60)(b-20)；5’-CTCTCATATGTCACTGGCAAATTGCTCGC-3’(序列号61)另外，引物(a-20)和(b-20)上附加有NdeI限制性内切酶位点。CupriavidustaiwanensisubiC基因扩增用引物(a-21)；5’-CTCTCATATGAGCGCGCAGTCCGTG-3’(序列号62)(b-21)；5’-CTCTCATATGCAGTTTCATCTCGTGGTCTC-3’(序列号63)另外，引物(a-21)和(b-21)上附加有NdeI限制性内切酶位点。模板DNA使用从PantoeaananatisLMG20103、ProvidenciarustigianiiJCM3953、ProvidenciastuartiiATCC25827、ProvidenciasneebiaJCM16941、ProvidenciarettgeriJCM1675、ProvidenciaalcalifaciensJCM1673、ProvidenciaburhodogranarieaJCM16940、EscherichiacoliMG1655、EscherichiafergusoniiNBRC102419、PseudoalteromonaspiscicidaJCM20779、PseudoalteromonashaloplanktisNBRC102225、CronobactersakazakiiJCM1233、CitrobacteryoungaeATCC29220、CitrobacterkoseriATCCBAA-895、EnterobacteraerogenesNBRC13534、EnterobactercloacaeNBRC13535、PseudomonasputidaATCC47054、MorganellamorganiiNBRC3848、AzotobactervinelandiiATCC9104、ShewanellaputrefaciensJCM20190和CupriavidustaiwanensisLMG1942中提取的染色体DNA。*)菌株购入机关的简称如下所示。<机关简称>ATCC：AmericanTypeCultureCollectionJCM：JapanCollectionofMicroorganismsLMG：BelgianCo-ordinatedCollectionsofMicro-organisms/LaboratoryforMicrobiologyoftheFacultyofSciencesofGhentUniversity(BCCM/LMG)NBRC：NITEBiologicalResourceCenter实际的PCR使用Veriti热循环仪(应用生物系统公司制造)，使用PrimeSTARGXLDNAPolymerase(宝生物工程株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。反应液：将以上混合，将该50μl的反应液加入PCR。*)扩增PantoeaananatisubiC基因时以引物(a-1)与(b-1)的组合，扩增ProvidenciarustigianiiubiC基因时以引物(a-2)与(b-2)的组合，扩增ProvidenciastuartiiubiC基因时以引物(a-3)与(b-3)的组合，扩增ProvidenciasneebiaubiC基因时以引物(a-4)与(b-4)的组合，扩增ProvidenciarettgeriubiC基因时以引物(a-5)与(b-5)的组合，扩增ProvidenciaalcalifaciensubiC基因时以引物(a-6)与(b-6)的组合，扩增ProvidenciaburhodogranarieaubiC基因时以引物(a-7)与(b-7)的组合，扩增EscherichiacoliubiC基因时以引物(a-8)与(b-8)的组合，扩增EscherichiafergusoniiubiC基因时以引物(a-9)与(b-9)的组合，扩增PseudoalteromonaspiscicidaubiC基因时以引物(a-10)与(b-10)的组合，扩增PseudoalteromonashaloplanktisubiC基因时以引物(a-11)与(b-11)的组合，扩增CronobactersakazakiiubiC基因时以引物(a-12)与(b-12)的组合，扩增CitrobacteryoungaeubiC基因时以引物(a-13)与(b-13)的组合，扩增CitrobacterkoseriubiC基因时以引物(a-14)与(b-14)的组合，扩增EnterobacteraerogenesubiC基因时以引物(a-15)与(b-15)的组合，扩增EnterobactercloacaeubiC基因时以引物(a-16)与(b-16)的组合，扩增PseudomonasputidaubiC基因时以引物(a-17)与(b-17)的组合，扩增MorganellamorganiiubiC基因时以引物(a-18)与(b-18)的组合，扩增AzotobactervinelandiiubiC基因时以引物(a-19)与(b-19)的组合，扩增ShewanellaputrefaciensubiC基因时以引物(a-20)与(b-20)的组合，扩增CupriavidustaiwanensisubiC基因时以引物(a-21)与(b-21)的组合进行。PCR循环：将以上过程作为一个循环，进行30个循环。利用0.8％的琼脂糖凝胶对10μl上述生成的反应液进行电泳，在Pantoeaananatis株来源ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在Providenciarustigianii株来源ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在Providenciastuartii株来源ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在Providenciasneebia株来源ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在Providenciarettgeri株来源ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在Providenciaalcalifaciens株来源ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在Providenciaburhodogranariea株来源ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在Escherichiacoli株来源ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在Escherichiafergusonii株来源ubiC基因的情况下能够检测到约0.7-kb的DNA片段，在Pseudoalteromonaspiscicida株来源ubiC基因的情况下能够检测到约0.6-kb的DNA片段，在Pseudoalteromonashaloplanktis株来源ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在Cronobactersakazakii株来源ubiC基因的情况下能够检测到约0.6-kb的DNA片段，在Citrobacteryoungae株来源ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在Citrobacterkoseri株来源ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在Enterobacteraerogenes株来源ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在Enterobactercloacae株来源ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在Pseudomonasputida株来源ubiC基因的情况下能够检测到约0.6-kb的DNA片段，在Morganellamorganii株来源ubiC基因的情况下能够检测到约0.5-kb的DNA片段，在Azotobactervinelandii株来源ubiC基因的情况下能够检测到约0.6-kb的DNA片段，在Shewanellaputrefaciens株来源ubiC基因的情况下能够检测到约0.6-kb的DNA片段，在Cupriavidustaiwanensis株来源ubiC基因的情况下能够检测到约0.7-kb的DNA片段。各DNA片段通过NucleoSpinGelandPCRClean-Up(宝生物工程株式会社制造)提纯。(3)4-羟基苯甲酸生产基因(分支酸-丙酮酸裂解酶基因)的表达质粒的构建将通过上述项(2)所示的PCR扩增的10μl包括Pantoeaananatis株来源ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包括Providenciarustigianii株来源ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包括Providenciastuartii株来源ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包括Providenciasneebia株来源ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包括Providenciarettgeri株来源ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包括Providenciaalcalifaciens株来源ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包括Providenciaburhodogranariea株来源ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包括Escherichiacoli株来源ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包括Escherichiafergusonii株来源ubiC基因的约0.7-kb的DNA片段、包括Pseudoalteromonaspiscicida株来源ubiC基因的约0.6-kb的DNA片段、包括Pseudoalteromonashaloplanktis株来源ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包括Cronobactersakazakii株来源ubiC基因的约0.6-kb的DNA片段、包括Citrobacteryoungae株来源ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包括Citrobacterkoseri株来源ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包括Enterobacteraerogenes株来源ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包括Enterobactercloacae株来源ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包括Pseudomonasputida株来源ubiC基因的约0.6-kb的DNA片段、包括Morganellamorganii株来源ubiC基因的约0.5-kb的DNA片段、包括Azotobactervinelandii株来源ubiC基因的约0.6-kb的DNA片段、包括Shewanellaputrefaciens株来源ubiC基因的约0.6-kb的DNA片段、包括Cupriavidustaiwanensis株来源ubiC基因的约0.7-kb的DNA片段和2μl的含有PgapA启动子的克隆载体pCRB209[国际公开WO2012/033112]分别由限制性内切酶NdeI切割，通过在70℃处理10分钟而使限制性内切酶失活后，将两者混合，对其中添加1μl的T4DNA连接酶10×缓冲液、1unit的T4DNA连接酶(宝生物工程株式会社制造)的各成分，利用灭菌蒸馏水使其为10μl，在15℃使其反应并键合。将其作为连接A液、B液、C液、D液、E液、F液、G液、H液、I液、J液、K液、L液、M液、N液、O液、P液、Q液、R液、S液、T液和U液。以得到的21种连接A液、B液、C液、D液、E液、F液、G液、H液、I液、J液、K液、L液、M液、N液、O液、P液、Q液、R液、S液、T液和U液分别利用氯化钙法〔JournalofMolecularBiology,53,159(1970)〕转化大肠埃希氏菌HST02，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和1.5％琼脂]上。通过常规方法对各个培养基上的增殖株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶分别对该质粒进行切割，确认插入片段。其结果是除了确认到质粒pCRB209约5.1-kb的DNA片段以外，在Pantoeaananatis株来源ubiC基因(连接A液)的情况下，还确认到长度约0.5-kb的插入片段，在Providenciarustigianii株来源ubiC基因(连接B液)的情况下，还确认到长度约0.5-kb的插入片段，在Providenciastuartii株来源ubiC基因(连接C液)的情况下，还确认到长度约0.5-kb的插入片段，在Providenciasneebia株来源ubiC基因(连接D液)的情况下，还确认到长度约0.5-kb的插入片段，在Providenciarettgeri株来源ubiC基因(连接E液)的情况下，还确认到长度约0.5-kb的插入片段，在Providenciaalcalifaciens株来源ubiC基因(连接F液)的情况下，还确认到长度约0.5-kb的插入片段，在Providenciaburhodogranariea株来源ubiC基因(连接G液)的情况下，还确认到长度约0.5-kb的插入片段，在Escherichiacoli株来源ubiC基因(连接H液)的情况下，还确认到长度约0.5-kb的插入片段，在Escherichiafergusonii株来源ubiC基因(连接I液)的情况下，还确认到长度约0.7-kb的插入片段，在Pseudoalteromonaspiscicida株来源ubiC基因(连接J液)的情况下，还确认到长度约0.6-kb的插入片段，在Pseudoalteromonashaloplanktis株来源ubiC基因(连接K液)的情况下，还确认到长度约0.5-kb的插入片段，在Cronobactersakazakii株来源ubiC基因(连接L液)的情况下，还确认到长度约0.6-kb的插入片段，在Citrobacteryoungae株来源ubiC基因(连接M液)的情况下，还确认到长度约0.5-kb的插入片段，在Citrobacterkoseri株来源ubiC基因(连接N液)的情况下，还确认到长度约0.5-kb的插入片段，在Enterobacteraerogenes株来源ubiC基因(连接O液)的情况下，还确认到长度约0.5-kb的插入片段，在Enterobactercloacae株来源ubiC基因(连接P液)的情况下，还确认到长度约0.5-kb的插入片段，在Pseudomonasputida株来源ubiC基因(连接Q液)的情况下，还确认到长度约0.6-kb的插入片段，在Morganellamorganii株来源ubiC基因(连接R液)的情况下，还确认到长度约0.5-kb的插入片段，在Azotobactervinelandii株来源ubiC基因(连接S液)的情况下，还确认到长度约0.6-kb的插入片段，在Shewanellaputrefaciens株来源ubiC基因(连接T液)的情况下，还确认到长度约0.6-kb的插入片段，在Cupriavidustaiwanensis株来源ubiC基因(连接U液)的情况下，还确认到长度约0.7-kb的插入片段。将包含Pantoeaananatis株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA1，将包含Providenciarustigianii株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA2，将包含Providenciastuartii株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA3，将包含Providenciasneebia株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA4，将包含Providenciarettgeri株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA5，将包含Providenciaalcalifaciens株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA6，将包含Providenciaburhodogranariea株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA7，将包含Escherichiacoli株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA8，将包含Escherichiafergusonii株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA9，将包含Pseudoalteromonaspiscicida株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA10，将包含Pseudoalteromonashaloplanktis株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA11，将包含Cronobactersakazakii株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA12，将包含Citrobacteryoungae株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA13，将包含Citrobacterkoseri株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA14，将包含Enterobacteraerogenes株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA15，将包含Enterobactercloacae株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA16，将包含Pseudomonasputida株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA17，将包含Morganellamorganii株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA18，将包含Azotobactervinelandii株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA19，将包含Shewanellaputrefaciens株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA20，将包含Cupriavidustaiwanensis株来源ubiC基因的质粒命名为pHBA21(表1)。[表1]4-羟基苯甲酸生产基因表达质粒与基因的来源质粒名4-羟基苯甲酸生产基因的来源pHBA1PantoeaananatispHBA2ProvidenciarustigianiipHBA3ProvidenciastuartiipHBA4ProvidenciasneebiapHBA5ProvidenciarettgeripHBA6ProvidenciaalcalifacienspHBA7ProvidenciaburhodogranarieapHBA8EscherichiacolipHBA9EscherichiafergusoniipHBA10PseudoalteromonaspiscicidapHBA11PseudoalteromonashaloplanktispHBA12CronobactersakazakiipHBA13CitrobacteryoungaepHBA14CitrobacterkoseripHBA15EnterobacteraerogenespHBA16EnterobactercloacaepHBA17PseudomonasputidapHBA18MorganellamorganiipHBA19AzotobactervinelandiipHBA20ShewanellaputrefacienspHBA21Cupriavidustaiwanensis(4)4-羟基苯甲酸生产基因(分支酸-丙酮酸裂解酶基因)导入株的构建使用上述的质粒pHBA1～pHBA21，利用电脉冲法[Agric.Biol.Chem.、Vol.54、443-447(1990)和Res.Microbiol.、Vol.144、181-185(1993)]，转化谷氨酸棒状杆菌R，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基上。通过常规方法对该培养基上的增殖株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶分别对该质粒进行切割，确认插入质粒。其结果是确认了上述制作的质粒pHBA1～pHBA21的导入。将得到的菌株命名为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)HBA-1～HBA-21。此外，本菌株的基因重组的概要在表2中汇总示出。谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)HBA-2在日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8(邮政编码292-0818)的独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心保藏(国内保藏的保藏日：2014年3月27日、基于布达佩斯条约的国际保藏的保藏日：2015年2月23日、保藏编号：NITEBP-01838)。该菌株在37CFR1.808规定的条件下可被公众利用。[表2]4-羟基苯甲酸生产基因导入株菌株名导入质粒名4-羟基苯甲酸生产基因的来源HBA-1pHBA1PantoeaananatisHBA-2pHBA2ProvidenciarustigianiiHBA-3pHBA3ProvidenciastuartiiHBA-4pHBA4ProvidenciasneebiaHBA-5pHBA5ProvidenciarettgeriHBA-6pHBA6ProvidenciaalcalifaciensHBA-7pHBA7ProvidenciaburhodogranarieaHBA-8pHBA8EscherichiacoliHBA-9pHBA9EscherichiafergusoniiHBA-10pHBA10PseudoalteromonaspiscicidaHBA-11pHBA11PseudoalteromonashaloplanktisHBA-12pHBA12CronobactersakazakiiHBA-13pHBA13CitrobacteryoungaeHBA-14pHBA14CitrobacterkoseriHBA-15pHBA15EnterobacteraerogenesHBA-16pHBA16EnterobactercloacaeHBA-17pHBA17PseudomonasputidaHBA-18pHBA18MorganellamorganiiHBA-19pHBA19AzotobactervinelandiiHBA-20pHBA20ShewanellaputrefaciensHBA-21pHBA21Cupriavidustaiwanensis实施例2谷氨酸棒状杆菌4-羟基苯甲酸生产基因导入株来源的分支酸-丙酮酸裂解酶活性比较将实施例1中制作的谷氨酸棒状杆菌/4-HBA生产基因导入株(参照表1)，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基[2g的(NH2)2CO、7g的(NH4)2SO4、0.5g的KH2PO4、0.5g的K2HPO4、0.5g的MgSO4·7H2O、1ml的0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O、1ml的0.02％(w/v)生物素溶液、2ml的0.01％(w/v)硫胺溶液、2g的酵母提取物、7g的维生素测定酪蛋白氨基酸、40g的葡萄糖、15g的琼脂悬浊于1L蒸馏水中]上，在33℃下于暗处静置15小时。将一白金环的上述培养皿中增殖的谷氨酸棒状杆菌/4-HBA生产基因导入株，接种到装有10ml的含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基[2g的(NH2)2CO、7g的(NH4)2SO4、0.5g的KH2PO4、0.5g的K2HPO4、0.5g的MgSO4·7H2O、1ml的0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O、1ml的0.02％(w/v)生物素溶液、2ml的0.01％(w/v)硫胺溶液、2g的酵母提取物、7g的维生素测定酪蛋白氨基酸、40g的葡萄糖溶解于1L蒸馏水中]的试管中，在33℃下在好氧条件下进行15小时的振荡培养。将这样培养增殖的各个菌体通过离心分离(4℃、8000rpm、10分钟)进行回收。利用超声波处理破碎菌体细胞后，将通过离心分离(4℃、15000rpm、20分钟)得到的细胞破碎上清液用作粗酶液，通过以下的方法测定分支酸-丙酮酸裂解酶活性。混合粗酶液、50mMTris-HCl(pH7.5)、0.5mM分支酸钡盐、0.2mMNADH、0.2MNaCl、5Unit乳酸脱氢酶，在33℃下进行反应，追踪来源于NADH的340nm的吸光度减少，解析反应初速度。根据反应初速度与蛋白浓度计算出比活力(将每分钟产生1微摩尔的4-HBA的酶量定义为1unit)。(此外，另行确认了将反应液用过滤器过滤后，生成的4-HBA通过HPLC直接检测出4-HBA的峰值(CosmosilC18ARII(Nacalaitesque)、层析20％甲醇、0.07％过氯酸)，利用两种测定方法的定量性并无区别。)其结果是，关于HBA1～HBA21菌株，检测出了表3所示的目标分支酸-丙酮酸裂解酶活性。示出特别高的活性的是Pantoeaananatis来源ubiC基因和Cronobactersakazakii来源ubiC基因。除此以外，关于Providenciarustigianii、Providenciastuartii、Providenciasneebia、Providenciarettgeri、Providenciaalcalifaciens、Providenciaburhodogranariea、Escherichiacoli、Escherichiafergusonii、Pseudoalteromonaspiscicida、Pseudoalteromonashaloplanktis、Cronobactersakazakii、Citrobacteryoungae、Citrobacterkoseri、Enterobacteraerogenes、Enterobactercloacae、Pseudomonasputida、Morganellamorganii、Azotobactervinelandii、Shewanellaputrefaciens、Cupriavidustaiwanensis来源的4-羟基苯甲酸生产基因，也检测出分支酸-丙酮酸裂解酶活性。这里，对谷氨酸棒状杆菌野生株(仅具有空载体)进行了同样的实验，结果是未确认到4-HBA生成。[表3]分支酸-丙酮酸裂解酶活性的比较实施例3对于谷氨酸棒状杆菌4-羟基苯甲酸生产基因导入株来源的分支酸-丙酮酸裂解酶活性的产物抑制的IC50的比较使用在实施例2中制备的、HBA-1～HBA-21株来源的细胞破碎上清液，研究了由作为产物的4-HBA造成的抑制。其结果是属于Providencia属的、Providenciarustigianii、Providenciastuartii、Providenciasneebia、Providenciarettgeri、Providenciaalcalifaciens、Providenciaburhodogranariea来源的分支酸-丙酮酸裂解酶与其他属来源的相比较，对于4-HBA抑制性特别低(表4)。[表4]对于谷氨酸棒状杆菌4-HBA生产基因导入株的分支酸-丙酮酸裂解酶活性的产物抑制的IC50的比较实施例4谷氨酸棒状杆菌4-羟基苯甲酸生产基因导入株的来自葡萄糖的4-羟基苯甲酸生成实验将实施例1中制作的谷氨酸棒状杆菌/4-HBA生产基因导入株(参照表1)，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基[2g的(NH2)2CO、7g的(NH4)2SO4、0.5g的KH2PO4、0.5g的K2HPO4、0.5g的MgSO4·7H2O、1ml的0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O、1ml的0.02％(w/v)生物素溶液、2ml的0.01％(w/v)硫胺溶液、2g的酵母提取物、7g的维生素测定酪蛋白氨基酸、40g的葡萄糖、15g的琼脂悬浊于1L蒸馏水中]上，在33℃下于暗处静置15小时。将一白金环的上述培养皿中增殖的谷氨酸棒状杆菌/4-HBA生产基因导入株，接种到装有10ml进而装有2％碳酸钙的含有卡那霉素50μg/ml的A琼脂培养基[2g的(NH2)2CO、7g的(NH4)2SO4、0.5g的KH2PO4、0.5g的K2HPO4、0.5g的MgSO4·7H2O、1ml的0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O、1ml的0.02％(w/v)生物素溶液、2ml的0.01％(w/v)硫胺溶液、2g的酵母提取物、7g的维生素测定酪蛋白氨基酸、40g的葡萄糖溶解于1L蒸馏水中]的试管中，在33℃下在好氧条件下进行24小时的振荡培养。将上述条件下增殖得到的培养液进行离心分离(4℃、15000rpm、10分钟)，使用得到的上清液通过HPLC对4-HBA进行定量。其结果是谷氨酸棒状杆菌HBA-1、HBA-2、HBA-3、HBA-8和HBA-12菌株生成表5所示的目标4-HBA。其中，Providenciarustigianii、Providenciastuartii或Cronobactersakazakii来源的4-HBA生成酶基因导入株的4-HBA生成能力比E.coli或Pantoeaananatis来源的4-HBA生成酶基因导入株更高且更优异。4-HBA生成能力最优异的是Providenciarustigianii来源的4-HBA生成酶基因导入株。另外，对谷氨酸棒状杆菌野生株(仅具有空载体的对照)进行同样的实验时，未确认到4-HBA生成。[表5]谷氨酸棒状杆菌4-HBA生产基因导入株的来自葡萄糖的4-HBA生成实验实施例5作为4-HBA生产宿主的合格性试验(4-HBA对好氧增殖的影响)关于谷氨酸棒状杆菌、大肠埃希氏菌、恶臭假单细胞和类球红细菌，进行了好氧培养中的4-HBA的增殖抑制实验。此外，在本试验中使用的恶臭假单细胞S12作为溶剂抗性菌而被报告，迄今为止报告了酪氨酸途径下的4-HBA的生成。将谷氨酸棒状杆菌涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基[2g的(NH2)2CO、7g的(NH4)2SO4、0.5g的KH2PO4、0.5g的K2HPO4、0.5g的MgSO4·7H2O、1ml的0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O、1ml的0.02％(w/v)生物素溶液、2ml的0.01％(w/v)硫胺溶液、2g的酵母提取物、7g的维生素测定酪蛋白氨基酸、40g的葡萄糖、15g的琼脂悬浊于1L蒸馏水中]上，在33℃下于暗处静置15小时。将一白金环的上述培养皿中增殖的谷氨酸棒状杆菌R株接种到装有10ml的含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基[2g的(NH2)2CO、7g的(NH4)2SO4、0.5g的KH2PO4、0.5g的K2HPO4、0.5g的MgSO4·7H2O、1ml的0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O、1ml的0.02％(w/v)生物素溶液、2ml的0.01％(w/v)硫胺溶液、2g的酵母提取物、7g的维生素测定酪蛋白氨基酸、40g的葡萄糖溶解于1L蒸馏水中]的试管中，在33℃下在好氧条件下进行15小时的振荡培养。将在上述条件下增殖的谷氨酸棒状杆菌R株以初始菌体浓度OD610＝0.05来接种到10ml的A液体培养基中，同时以4-HBA变为最终浓度0、100、200、250、300mM来进行添加，在33℃下在好氧条件下进行振荡培养。菌体的增殖通过测定OD610的吸光度来进行。将大肠埃希氏菌JM109涂布到LB琼脂培养基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和1.5％琼脂]上，在37℃下于暗处静置15小时。将在上述培养皿中增殖的大肠埃希氏菌JM109涂布到LB液体培养基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物和0.5％氯化钠]上，在37℃下在好氧条件下进行13小时的振荡培养。将在上述条件下增殖的大肠埃希氏菌JM109以初始菌体浓度OD＝0.05来接种到100ml的LB液体培养基中，同时以4-HBA变为最终浓度0、100、200mM来进行添加，在37℃下在好氧条件下进行振荡培养。菌体的增殖通过测定OD610的吸光度来进行。将恶臭假单细胞S12涂布到LB琼脂培养基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和1.5％琼脂]上，在30℃下于暗处静置15小时。将在上述培养皿中增殖的恶臭假单细胞S12涂布到LB液体培养基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物和0.5％氯化钠]上，在30℃下在需氧条件下进行13小时的振荡培养。将在上述条件下增殖的恶臭假单细胞S12以初始菌体浓度OD610＝0.05来接种到100ml的LB液体培养基中，同时以4-HBA变为最终浓度0、100、200、300mM来进行添加，在30℃下在好氧条件下进行振荡培养。菌体的增殖通过测定OD610的吸光度来进行。将类球红细菌涂布到LB琼脂培养基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和1.5％琼脂]上，在30℃下于暗处静置20小时。将在上述培养皿中增殖的类球红细菌涂布到LB液体培养基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物和0.5％氯化钠]上，在30℃下在好氧条件下进行13小时的振荡培养。将在上述条件下增殖的类球红细菌以初始菌体浓度OD＝0.1来接种到100ml的LB液体培养基中，同时以4-HBA变为最终浓度0、100、200mM来进行添加，在30℃下在好氧条件下进行振荡培养。菌体的增殖通过测定OD610的吸光度来进行。图1示出向培养基中添加4-HBA对好氧增殖的影响的解析结果。大肠埃希氏菌在100mM的4-HBA存在下显著受到增殖抑制，在200mM的4-HBA下增殖被完全抑制。恶臭假单细胞S12(作为溶剂抗性被报告的菌株)在200mM4-HBA下增殖被完全抑制。类球红细菌在100mM的4-HBA下增殖被完全抑制。与此相对，谷氨酸棒状杆菌在大肠埃希氏菌、恶臭假单细胞S12和类球红细菌的增殖被完全抑制的200mM的4-HBA存在下也能够增殖。进而，谷氨酸棒状杆菌在250mM的4-HBA存在下也能够增殖，虽然这里并未示出，但是在培养开始后28小时，增殖至与200mM的4-HBA存在下的增殖同等(野生株OD610的约65％)的增殖。这样，谷氨酸棒状杆菌与大肠埃希氏菌、恶臭假单细胞S12和类球红细菌相比较，示出对4-HBA具有较高的抗性，作为4-HBA生产的宿主具有较高的适合性。根据本发明方法，能够使用微生物以实用的效率由葡萄糖等制造4-HBA。当前第1页1 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