H‑INP‑(D)BAL‑(D)TRP‑PHE‑APC‑NH2及其可药用盐的液相合成的方法与流程

本申请要求2014年3月4日提交的美国临时申请号61/947,748的权益。上述申请的全部教导都引入本文作为参考。

发明背景

生长激素释放肽(Ghrelin)是由肠产生的28个氨基酸的肽类激素，其在摄食调节、营养吸收、消化道运动和能量平衡中起到重要作用。在负能量平衡条件(饥饿、恶病质以及神经性厌食期间)下生长激素释放肽分泌增加，而在正能量平衡条件(进食、高血糖症和肥胖症期间)下其表达减少。它是生长激素促分泌物受体(GHSR)的内源性配体，且GHSR-1a通过激活包括在所选择的生理条件下刺激生长激素分泌的GHSR-1a来展示其至少部分功能。

生长激素释放肽的类似物具有许多不同的治疗用途(参见例如美国专利号7,456,253和7,932,231，其全部内容引入本文作为参考。

特别有治疗前景的生长激素释放肽类似物是H-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH₂(式(I),SEQ ID NO:1)。迄今为止，该类似物仅通过固相合成制备。目前需要提供H-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH₂(SEQ ID NO:1)的生长激素释放肽类似物及其可药用盐的大规模生产可接受的液相合成方法。例如，需要提供所期望的产率、高纯度(例如立体化学纯度)、成本效益或其组合的液相方法。

发明简述

本发明提供了用于合成生长激素释放肽类似物H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH₂(SEQ ID NO:1)及其可药用盐的新方法，其可以有利地用于大规模合成生长激素释放肽类似物H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH₂(SEQ ID NO:1)。

在一项实施方案中，本发明是用于合成式(I)的肽或其可药用盐的方法

H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH₂ (I)。

该方法包括至少一个在液相中偶联式(I)的肽的任何两个氨基酸的步骤。

在另一项实施方案中，本发明是结构式(II)的肽片段或其盐

Boc-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc(Boc)-NH₂ (II)。

在另一项实施方案中，本发明是结构式(III)的肽片段或其盐

Boc-Inp-DBal-DTrp-OH (III)。

在另一项实施方案中，本发明是结构式(IV)的肽片段或其盐

H-Phe-Apc(Boc)-NH₂ (IV)。

在另一项实施方案中，本发明是结构式(V)的肽片段或其盐

H-DBal-DTrp-OH (V)。

在另一项实施方案中，本发明是结构式(VI)的肽片段或其盐

Z-Phe-Apc(Boc)-NH₂ (VI)。

本文公开的液相肽合成方法具有许多优点。例如，本文公开的液相合成方法提供了会聚的而非逐步的合成流程，因此提高了总产率。此外，使用硅烷化试剂可以有利地使用非质子有机溶剂，因此避免水性溶剂的缺点例如消除杂质的形成。使用硅烷化的中间体还允许使用主链未保护的氨基酸残基作为中间体，因此减少合成步骤的数目并提高产率。本文公开方法的其它优点是在二肽阶段而非在单个氨基酸残基阶段进行N-末端氨基酸残基(Apc)的酰胺化中发现。该酰胺化导致氨污染的减少，因此避免了由于活化的羧基基团被溶解的氨所氨解而引起的未成熟的肽链终止。

附图简述

通过本发明的示例实施方案的以下更加具体的描述，上述内容将非常清楚，例如附图所示，其中参考字符在整个不同视图中是指相同的部分。这些图不一定是按比例的，重点在于说明本发明的实施方案。

图1是说明本文公开方法的示例实施方案所用的步骤次序的方框图。

图2是说明本文公开方法的示例实施方案所用的步骤次序的方框图。

图3是说明本文公开方法的示例实施方案所用的步骤次序的方框图。

图4是说明本文公开方法的示例实施方案所用的步骤次序的方框图。

图5是说明本文公开方法的示例实施方案所用的步骤次序的方框图。

图6是说明本文公开方法的示例实施方案所用的步骤次序的方框图。

图7是说明本文公开方法的示例实施方案所用的步骤次序的方框图。

图8是说明本文公开方法的示例实施方案所用的步骤次序的方框图。

图9是说明本文公开方法的示例实施方案所用的步骤次序的方框图。

图10是说明本文公开方法的示例实施方案所用的步骤次序的方框图。

图11是说明本文公开方法的示例实施方案所用的步骤次序的方框图。

图12是说明本文公开方法的示例实施方案所用的步骤次序的方框图。

图13是说明本文公开方法的示例实施方案所用的步骤次序的方框图。

图14是说明本文公开方法的示例实施方案所用的步骤次序的方框图。

图15是说明本文公开方法的示例实施方案所用的步骤次序的方框图。

图16是制备用于实施本发明的中间体的本文公开方法的示例实施方案所使用的合成流程的说明。

图17是制备用于实施本发明的中间体的本文公开方法的示例实施方案所使用的合成流程的说明。

图18是制备用于实施本发明的中间体的本文公开方法的示例实施方案所使用的合成流程的说明。

图19是制备用于实施本发明的中间体的本文公开方法的示例实施方案所使用的合成流程的说明。

图20是制备用于实施本发明的中间体的本文公开方法的示例实施方案所使用的合成流程的说明。

图21是制备用于实施本发明的中间体的本文公开方法的示例实施方案所使用的合成流程的说明。

图22是制备用于实施本发明的中间体的本文公开方法的示例实施方案所使用的合成流程的说明。

图23是制备用于实施本发明的中间体的本文公开方法的示例实施方案所使用的合成流程的说明。

图24是制备式(I)化合物的本文公开方法的示例实施方案所使用的合成流程的说明。

发明详述

用于定义肽类的命名是本领域通常使用的，其中在N-末端的氨基基团在左侧出现，在C-末端的羰基基团在右侧出现。

如本文所用，术语“氨基酸”包括天然存在的氨基酸和非天然的氨基酸。除非另外指明，术语“氨基酸”包括分离的氨基酸分子(即包含与氨基连接的氢和与羰基碳连接的羟基的分子)和氨基酸残基(即其中与氨基连接的氢和或羰基碳连接的羟基中之一或两者都被去除的分子)。氨基基团可以是α-氨基基团、β-氨基基团等。例如，术语“氨基酸丙氨酸”可以指分离的丙氨酸H-Ala-OH或者指丙氨酸残基H-Ala-、-Ala-OH或-Ala-中的任一。除非另外指明，在本文所述化合物中发现的全部氨基酸都可以是D或L构型。术语“氨基酸”包括其盐，包括可药用盐。任何氨基酸都可以是被保护或未保护的。保护基团可以与氨基基团(例如α-氨基基团)、主链羧基或任何侧链的官能团连接。作为实例，被苄氧基羰基基团(Z)在α-氨基基团上保护的苯丙氨酸将用Z-Phe-OH代表。

如本文所用，术语“肽片段”是指通过至少一个酰胺键(即选自肽片段的氨基酸的一个氨基酸的氨基基团与另一个氨基酸的羧基基团之间的键)共价连接的两个或多个氨基酸。术语“多肽”和“肽片段”可互换使用。术语“肽片段”包括其盐，包括可药用盐。

如本文所用，术语“偶联”是指两个化学部分反应形成共价键的步骤。当指氨基酸偶联时，术语“偶联”的含义是两个氨基酸反应的步骤，由此形成一个氨基酸残基的氨基基团与另一个氨基酸的羧基基团(例如主链羧基)之间的共价酰胺键。

如本文所用，术语“羧基活化基团”的含义是修饰氨基酸的羧基基团或肽片段的羧基末端使其容易氨解的基团。通常情况下，羧基活化基团是替换了羧基基团的羟基部分的吸电子部分。该吸电子部分提高了极性，并因此提高了羰基碳的亲电子性。如本文所用，术语“活化的羧基基团”是指其中羟基基团被羧基活化基团代替的羧基基团。

如本文所用，术语“亲核添加剂”的含义是用于有机合成中以控制其立体化学结果的化学化合物或单元。

如本文所用，术语“硅烷化的氨基酸”是指被包含硅烷基的部分至少在一个可修饰位点修饰过的氨基酸。可修饰位点的实例包括-NH和-OH官能团。该修饰是氨基酸与硅烷化试剂反应的结果，如下文所述。在一项示例实施方案中，硅烷化的氨基酸是全硅烷化的，即，被包含硅烷基的部分在全部可修饰位点修饰。

为了便于生长激素释放肽类似物H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH₂(SEQ ID NO:1)的大规模合成，本文提供了新的其合成方法。一般而言，该整个过程都在溶液相进行，即，不需要固相反应，例如氨基酸与树脂结合的氨基酸的偶联。

日益增多的证据支持与GHSR-1a部分重叠的独立的生长激素释放肽途径，且其增加体重和GI运动性，不释放GH。最令人注目的证据是来源于生长激素释放肽的肽类似物，其是GHSR-1a的完全拮抗剂，不刺激GH释放，但是影响GI运动性并增加体重。

生长激素释放肽类似物H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH₂(SEQ ID NO:1)是一种小肽的生长激素释放肽激动剂，其药理学研究以及在癌症、心脏病以及COPD恶病质中使用全长人生长激素释放肽进行人类临床试验证实了食欲、体重和心输出量的增加，且无明显毒性。由于生长激素释放肽的有力的促运动作用，GI运动障碍也是生长激素释放肽激动剂靶向的临床应用，特别是手术后肠梗阻、阿片类药物引起的便秘、胃肌轻瘫、肠易激综合征和慢性便秘。生长激素释放肽和生长激素释放肽类似物H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH₂(SEQ ID NO:1)还具有抗炎特性，抑制一系列炎症性细胞因子，因此，GI炎症性病症例如炎性肠病是另外的潜在临床靶点。

本发明的示例实施方案描述如下。

本发明的第一个实施方案是合成H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH₂或其可药用盐的方法，包括在液相中偶联氨基酸。

本发明的第二个实施方案是合成H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH₂或其可药用盐的方法，包括通过在极性非质子有机溶剂中与硅烷化试剂反应而将未保护或被保护的氨基酸或者未保护或被保护的肽片段硅烷化来制备硅烷化的氨基酸。

被保护的氨基酸是其中一个或多个官能团被保护基团保护的氨基酸。被保护的肽片段是二肽、三肽或四肽，其中所述肽片段的氨基酸的一个或多个官能团被保护基团保护。优选地，本发明的被保护的氨基酸和/或被保护的肽片段具有被保护的氨基基团。术语“氨基保护基团”是指可以用于代替氨基基团的酸性质子从而降低其亲核性的保护基团。

氨基保护基团的实例(如X¹、X²、X³、X⁴等)包括但不限于取代或未取代的酰基型基团，例如甲酰基、丙烯酰基(Acr)、苯甲酰基(Bz)、乙酰基(Ac)、三氟乙酰基；取代或未取代的芳烷基氧基羰基型基团，例如苄氧基羰基(Z)、对氯苄氧基羰基、对溴苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、对甲氧基苄氧基羰基、二苯甲基氧基羰基、2-(对-联苯基)异丙基氧基羰基、2-(3,5-二甲氧基苯基)异丙基氧基羰基、对-苯基偶氮苄氧基羰基、三苯基膦酰基乙氧基羰基或9-芴基甲氧基羰基基团(Fmoc)；取代或未取代的烷氧基羰基型基团，例如叔丁氧基羰基(BOC)、叔戊氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基、异丙基氧基羰基、乙氧基羰基、烯丙氧基羰基、2-甲基磺酰基乙氧基羰基或2,2,2-三氯乙氧基羰基基团；环烷基氧基羰基型，例如环戊基氧基羰基、环己基氧基羰基、金刚烷基氧基羰基或异冰片基氧基羰基基团，以及包含杂原子的基团，例如苯磺酰基、对甲苯磺酰基、均三甲苯磺酰基、甲氧基三甲基苯磺酰基、2-硝基苯磺酰基、2-硝基苯硫基、4-硝基苯磺酰基或4-硝基苯硫基基团。在这些基团X中，优选那些包含羰基、硫基或磺酰基的基团。氨基保护基团X¹、X²、X³、X⁴等优选地选自烯丙氧基羰基基团、叔丁氧基羰基(BOC)、苄氧基羰基(Z)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、4-硝基苯磺酰基(Nosyl)、2-硝基苯硫基(Nps)以及取代的衍生物。

用于本发明方法的优选的氨基保护基团X¹、X²、X³、X⁴等是叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)和苄氧基-羰基(Z)。用于本发明方法的甚至更优选的氨基保护基团是叔丁氧基羰基(Boc)和苄氧基-羰基(Z)。

氨基保护基团X¹、X²、X³、X⁴等可以通过本领域已知的许多方法引入。例如，通过与适合的酸性卤化物或酸酐反应。在另一方面，氨基保护基团X¹、X²、X³、X⁴等可以被除去(即脱保护步骤)，例如，通过酸水解、氢解(例如在氢(例如通过液体反应介质中通气)和催化剂如钯催化剂的存在下)、用稀释的氢氧化铵处理、用肼处理、用钠处理以及用氨基钠处理。

在优选的实施方案中，本文所述实施方案中任何一项所述的方法是在氨基酸的羧基基团未保护情况下进行。所述合成的每个氨基酸偶联步骤包括将具有被保护氨基基团和任选的活化羧基基团的氨基酸与具有未保护氨基基团和未保护羧基基团的氨基酸偶联。

优选地，将未保护或被保护的氨基酸或者未保护或被保护的肽片段进行硅烷化包括将未保护或被保护的氨基酸或者未保护或被保护的肽片段的未保护的氨基基团硅烷化。

本发明方法(例如第二个实施方案的方法)中制备的硅烷化片段在需要时可以分离并纯化；但是，优选在原位使用该硅烷化片段。

通常的硅烷化试剂包括N,O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺、Ν,Ο-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺、六甲基二硅烷基胺、N-甲基-N-三甲基硅烷基乙酰胺、N,-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺、N-(三甲基硅烷基)乙酰胺、N-(三甲基硅烷基)二乙基胺、N-(三甲基硅烷基)二甲基胺、1-(三甲基硅烷基)咪唑、3-(三甲基硅烷基)-2-噁唑烷酮和(三甲基硅烷基)-N-二甲基-乙酰胺。优选的硅烷化试剂是(三甲基硅烷基)-N-二甲基-乙酰胺。

本发明的硅烷化反应一般是在0℃-100℃的温度下进行，且优选25℃-50℃。

一般而言，相对于需要硅烷化的氨基基团的摩尔量，使用0.5-5、优选0.7-3、更加优选1-2.5、甚至更加优选约2或1.8-2.2当量的硅烷化试剂。

一般而言，本发明的硅烷化是在极性非质子有机溶剂的存在下进行。更加通常的情况下，该溶剂是具有5-10之间的静态相对介电常数的非质子有机溶剂。优选地，该溶剂是乙酸乙酯。

在本发明的第三个实施方案中，所述实施方案的任何一项的方法包括将硅烷化的片段(例如第二个实施方案的硅烷化片段)与具有氨基保护基团和活化的羧基基团的(1)被保护且活化的氨基酸或者(2)被保护且活化的肽片段进行反应。

一般而言，硅烷化的片段(例如第二或第三个实施方案的硅烷化片段)与具有氨基保护基团和活化的羧基基团的(1)被保护且活化的氨基酸或者(2)被保护且活化的肽片段的反应，是在极性非质子有机溶剂存在下进行。更通常的情况下，该溶剂是具有5-10之间的静态相对介电常数的非质子有机溶剂。优选地，该溶剂是乙酸乙酯。

通常情况下，用于硅烷化的和/或用于该硅烷化片段随后的氨基酸或肽偶联反应的反应溶液，包含相对于溶液总重为10％重量至90％重量的极性非质子溶剂。

一般而言，本发明的硅烷化片段与具有氨基保护基团和活化的羧基基团的(1)被保护且活化的氨基酸或者(2)被保护且活化的肽片段的反应，是在-50℃-50℃的温度下进行。

适合的羧基基团活化试剂(在本文还称为“活化剂”)包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、五氟苯酚(PfpOH)和二(对氯四氟苯基)碳酸酯。如本领域已知，这些活化剂形成活化的酯。优选的，该活化剂是N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)。

在本发明优选的实施方案中，生长激素释放肽类似物的合成方法使用X¹-(D)Bal-OSu、X⁴-Inp-OSu和X³-Phe-OSu，其中X¹、X³和X⁴各自独立地是氨基保护基团。

在本发明的第四个实施方案中，本文所述实施方案中任一项的方法进一步包括将氨基酸H-(D)Trp-OH硅烷化，以形成硅烷化的氨基酸H-(D)Trp-OH残基，并将该硅烷化的氨基酸H-(D)Trp-OH残基与氨基酸X¹-(D)Bal-Y¹反应，其中X¹是氨基保护基团，且Y¹是活化的羧基基团。在具体实施方案中，X¹是Boc且Y¹是-OSu。在更加具体的实施方案中，X¹是Boc且Y¹是-OSu，且该硅烷化和偶联反应各自是在乙酸乙酯中进行。

在本发明的第五个实施方案中，本文所述实施方案中任一项的方法进一步包括将氨基酸H-Apc(X²)-OH硅烷化，以形成硅烷化的氨基酸H-Apc(X²)-OH残基，并将该硅烷化的氨基酸H-Apc(X²)-OH残基与氨基酸X³-Phe-Y²反应，其中X²是氨基保护基团，且Y²是活化的羧基基团。X³如上文所定义。在具体的实施方案中，H-Apc(X²)-OH是H-Apc(Boc)-OH，且X³-Phe-Y²是Z-Phe-OSu。在更加具体的实施方案中，H-Apc(X¹)-OH是H-Apc(Boc)-OH，且X²-Phe-Y³是Z-Phe-OSu，且该硅烷化和偶联反应各自是在乙酸乙酯中进行。

本发明的第六个实施方案是本文所述实施方案中任一项的方法，其中片段X³-Phe-Apc(X²)-NH2是通过将硅烷化的氨基酸H-Apc(X²)-OH残基和氨基酸X³-Phe-Y²在有机溶剂中偶联、然后经羧基基团酰胺化来制备。在特定实施方案中，氨基酸H-Apc(X²)-OH是通过在乙酸乙酯中将其与(三甲基硅烷基)-N-二甲基-乙酰胺反应进行硅烷化。在更加具体的实施方案中，形成H-Apc(X²)-OH、乙酸乙酯和(三甲基硅烷基)-N-二甲基-乙酰胺的混悬液，将该混悬液加热(至35℃-50℃；优选约45℃)，在硅烷化基本完成后，加入X³-Phe-Y²。优选地，X³-Phe-Y-2是Z-Phe-OSu，且H-Apc(X²)-OH是H-Apc(Boc)-OH。还优选地，羧基基团的酰胺化是在氨和DCC的存在下完成。此外优选地，X³-Phe-Y²是Z-Phe-OSu，且H-Apc(X²)-OH是H-Apc(Boc)-OH，且羧基基团的酰胺化是在氨和DCC的存在下完成。

本发明的第七个实施方案是本文所述实施方案中任一项的方法，其中肽片段X⁴-Inp-(D)Bal-(D)Trp-OH是从肽片段H-(D)Bal-(D)Trp-OH和X⁴-Inp-Y³在碱的存在下制备，其中Y³是活化的羧基基团。在具体的实施方案中，所述碱是二异丙基乙胺，X⁴是Boc，且Y³是-OSu。在其它具体的实施方案中，将HCl.H-(D)Bal-(D)Trp-OH在10℃-70℃(优选约40℃)在有机溶剂(如DMA)中在碱的存在下溶解以形成溶液，随后将该溶液冷却(例如至0℃)，并将Boc-Inp-OSu在10℃-30℃下加入该溶液。

本发明的第八个实施方案是本文所述实施方案中任一项的方法，进一步包括从X⁴-Inp-(D)Bal-(D)Trp-OH和H-Phe-Apc(X²)-NH2在亲核添加剂和偶联试剂存在下制备X⁴-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc(X²)-NH2。在具体的实施方案中，该亲核添加剂是HOPO。在另一项具体实施方案中，该亲核添加剂是HOPO且偶联试剂是EDC。而在另一项具体实施方案中，将H-Phe-Apc(X²)-NH2、X⁴-Inp-(D)Bal-(D)Trp-OH和亲核添加剂在有机溶剂中溶解，并随后加入偶联试剂。在另一项具体实施方案中，将H-Phe-Apc(X²)-NH2、X⁴-Inp-(D)Bal-(D)Trp-OH和HOPO在10℃-30℃(优选约25℃)下溶于有机溶剂中以形成溶液，将该溶液冷却(例如至2℃-10℃)，并随后加入EDC。

优选地，H-Phe-Apc(X²)-NH2是H-Phe-Apc(Boc)-NH2，且X⁴-Inp-(D)Bal-(D)Trp-OH是Boc-Inp-(D)Bal-(D)Trp-OH。进一步优选所述有机溶剂是二甲基乙酰胺。在另一项具体实施方案中，该方法进一步包括在有机溶剂中和在2-羟基吡啶-N-氧化物和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的存在下将Boc-Inp-(D)Bal-(D)Trp-OH和H-Phe-Apc(Boc)-NH2反应合成Boc-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc(Boc)-NH2。

本发明的第九个实施方案是本文所述实施方案中任一项的方法，进一步包括通过氢解将Z-Phe-Apc(Boc)-NH2脱保护，以形成H-Phe-Apc(Boc)-NH2。在具体实施方案中，将Z-Phe-Apc(Boc)-NH2在有机溶剂(如甲醇)中溶解并脱保护，包括向有机溶剂中加入催化剂(如钯催化剂)，并在有机溶剂中流入或产生氢。优选地，该有机溶剂是甲醇。

本发明的第九个实施方案是本文所述实施方案中任一项的方法，进一步包括经酸解将Boc-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc(Boc)-NH2脱保护，以获得H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH2.2HCl。在具体实施方案中，该酸解是在4-甲硫基苯基和HCl存在下在异丙醇中进行。

本发明的第十个实施方案是生长激素释放肽类似物H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH₂或其可药用盐的液相合成方法，包括：(a)从硅烷化的H-(D)Trp-OH和X¹-(D)Bal-Y¹在有机溶剂中合成片段H-(D)Bal-(D)Trp-OH，(b)从硅烷化的H-Apc(X²)-OH和X³-Phe-Y⁴在有机溶剂中合成片段X³-Phe-Apc(X²)-NH2，(c)从H-(D)Bal-(D)Trp-OH和X⁴-Inp-Y³在有机溶剂中和碱的存在下合成片段X⁴-Inp-(D)Bal-(D)Trp-OH，以及(d)从X⁴-Inp-(D)Bal-(D)Trp-OH和H-Phe-Apc(X²)-NH2在亲核添加剂和偶联试剂的存在下合成X-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc(X²)-NH2。在具体的实施方案中，可以独立地进行第十个实施方案中步骤(a)、(b)、(c)和(d)中的一个或多个，其如上文第一至九个实施方案中所述，包括如各个具体和优选的实施方案中所述。在其它具体实施方案中，步骤(a)、(b)、(c)和(d)中的一个或多个可以如下文各实施例中所述进行。优选地，偶联试剂各自独立地是碳二亚胺试剂。

生长激素释放肽类似物H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH₂(SEQ ID NO:1)或其可药用盐(如H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH₂的乙酸盐)的液相合成的其它实施方案如附图1-14中所图示，包括如图7和12中所示的线性合成以及图1-6、8-11、13和14中的会聚合成。

优选会聚合成，特别是优选如图1中所概述的合成方法。图1-14中所示的氨基酸和肽片段的氨基基团可以如本文所述被保护，优选用氨基保护基团Boc和Z，羧基基团可以如本文所述活化(例如用HOSu)，且这些氨基酸和肽片段可以如图1-14中各自所示的次序用偶联试剂并用如本文所述的偶联反应进行偶联。

生长激素释放肽类似物H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH₂(SEQ ID NO:1)或其可药用盐(如H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH₂的盐酸盐)可以进一步纯化并冻干，以获得冻干后的生长激素释放肽类似物。因此，本发明的其它实施方案是制备冻干的生长激素释放肽类似物的方法，该方法包括按照本文所述的任一项实施方案制备包含H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH₂或其可药用盐的粗产物，并进一步包括经高效液相色谱纯化该粗产物以获得纯化后的产物，并将该纯化产物冷冻干燥，得到冻干的生长激素释放肽类似物。在具体实施方案中，该方法包括用乙腈/乙酸铵缓冲液梯度在柱子(优选C18-接枝的硅胶)上洗脱该粗产物，以得到洗脱物，将洗脱物分段，将所需纯度(例如>95％)的流份合并，得到合并的流份，用水稀释该合并的流份，得到稀释的合并流份，用富含乙腈的梯度洗脱该稀释的合并流份，得到第二次洗脱物，将第二次洗脱物分段，将所需纯度的第二次流份合并，得到合并的高纯度流份，真空蒸发合并的高纯度流份中的乙腈，得到水溶液，将该水溶液冷冻干燥，得到冻干的生长激素释放肽类似物。

图15是制备冻干的序列为H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH₂(SEQ ID NO:1)的生长激素释放肽类似物的示意图，包括合成生长激素释放肽类似物H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH₂(SEQ ID NO:1)的合成次序。

本发明的偶联试剂通常是碳二亚胺试剂。碳二亚胺试剂的实例包括但不限于Ν,Ν'-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-环己基-N'-异丙基碳二亚胺(CIC)、Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N-叔丁基-N'-甲基碳二亚胺(BMC)、N-叔丁基-N'-乙基碳二亚胺(BEC)、二[[4-(2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷基)]-甲基]碳二亚胺(BDDC)和N,N-二环戊基碳二亚胺。DCC是优选的偶联试剂。

本发明的亲核添加剂通常选自2-羟基吡啶-N-氧化物(HOPO)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)、1-羟基-苯并三唑(HOBt)、3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(HODhbt)和1-羟基-1H-1,2,3-三唑-4-甲酸乙酯(HOCt)。

通常情况下，本发明的硅烷化试剂是选自N,O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺、Ν,Ο-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺、六甲基二硅烷基胺、N-甲基-N-三甲基硅烷基乙酰胺、N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺、三甲基氯硅烷+碱、N-(三甲基硅烷基)乙酰胺、三甲基硅烷基氰化物、N-(三甲基硅烷基)二乙基胺、N-(三甲基硅烷基二甲基胺、1-(三甲基硅烷基)咪唑和3-三甲基硅烷基-2-噁唑烷酮。在一项示例实施方案中，该硅烷化试剂是(三甲基硅烷基)-N-二甲基-乙酰胺。

通常情况下，本文所述的方法可以进一步包括反应猝灭步骤(例如通过加入3-(二甲基氨基)丙基胺)、洗涤步骤(例如用有机溶剂(如乙腈、二异丙基醚、异丙醇或环己烷)、用KHSO₄溶液(如4(w/v)％KHSO₄溶液)、用NaCl溶液(如2(w/v)％NaCl溶液)、用去矿物质水、用NaHCO₃溶液(如4(w/v)％NaHCO₃溶液))、浓缩步骤(如真空浓缩、结晶、过滤、沉淀)以及干燥步骤(如真空干燥或共沸蒸馏)。

用于定义肽类的命名是本领域内通常使用的，其中在N-末端的氨基基团在左侧出现，在C-末端的羰基基团在右侧出现。

如本文所用，术语“氨基酸”包括天然存在的氨基酸和非天然的氨基酸。

本发明化合物中存在的某些氨基酸可以通过下文代表：

Apc代表与4-氨基哌啶-4-甲酸对应的以下结构：

Bal代表与3-苯并噻吩基丙氨酸对应的以下结构式：

Inp代表与六氢异烟酸对应的以下结构式：

Phe代表与苯丙氨酸对应的以下结构式：

且

Τ代表与色氨酸对应的以下结构式：

本文所用的某些其它缩写如下文所定义：

BDDC是二[[4-(2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷基)]-甲基]碳二亚胺，

BEC是N-叔丁基-N'-乙基碳二亚胺，

BMC是N-叔丁基-N'-甲基碳二亚胺，

Boc是叔丁氧基羰基，

CIC是N-环己基-N'-异丙基碳二亚胺；

DMA是二甲基胺，

DCC是N,N'-二环己基碳二亚胺

DCU是N,N'-二环己基脲

DIC是N,N'-二异丙基碳二亚胺，

DIEA或DIPEA是二异丙基乙胺，

EDC是1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，

Fmoc是芴基甲氧基羰基，

HOAt是1-羟基-7-氮杂苯并三唑，

HOBt是1-羟基-苯并三唑，

HOCt是1-羟基-1H-1,2,3-三唑-4-甲酸乙酯，

HODhbt是3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪，

HOPO是2-羟基吡啶-N-氧化物，

HOSu或SucOH是N-羟基琥珀酰亚胺，

PfpOH是五氟苯酚，且

Z是苄氧基羰基。

除了N-末端氨基酸之外，在本公开物中全部氨基酸缩写(例如Phe)代表结构—NH—C(R)(R')—CO—，其中R和R'各自独立地是氢或氨基酸侧链(如R＝苄基且R’＝H，为Phe)，或R和R'可以结合形成环系统，如Apc和Inp的情况。因此，4-氨基哌啶-4-甲酸是H-Apc-OH，3-苯并噻吩基丙氨酸是H-Bal-OH，六氢异烟酸是H-Inp-OH，苯丙氨酸是H-Phe-OH，且色氨酸是H-Trp-OH。这些氨基酸或肽(例如Boc-Inp-(D)Bal-(D)Trp-OH)的"OH"标识是指C-末端是游离酸。例如在中间体、被保护的二肽Z-Phe-Apc(Boc)-NH₂或肽H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH₂中的"NH₂"标识是指被保护的肽片段的C-末端是酰胺化的。此外，某个R和R'单独或以组合作为环结构，可以包含液相合成过程中需要保护的官能团，例如，Apc的R和R'基团可以用其它基团保护，例如Boc基团:Apc(Boc)。此外，氨基酸的N-末端可以用保护基团X例如Boc保护，通过以下表示：X-Inp-OH、X-Bal-OH等(如Boc-Inp-OH、Boc-Bal-OH等)。氨基酸的羧基基团可以例如用活化剂Y如N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)活化，通过以下表示：H-Inp-Y(如H-Inp-OSu)。

当所述氨基酸具有异构体形式时，除非另外明确指明为D构型如(D)Bal或D-Bal，其所代表的氨基酸是L构型。

生长激素释放肽类似物H-Inp-DBal-D-Trp-Phe-Apc-NH₂(SEQ ID NO:1)可以制备为酸性或碱性盐。可药用盐(以水-或油-可溶或可分散产物的形式)包括例如从无机或有机酸或碱形成的常规无毒的盐或季铵盐。所述盐的实例包括酸加成盐例如乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一酸盐；以及碱盐例如铵盐、碱金属盐如钠和钾盐、碱土金属盐如钙和镁盐，与有机碱的盐如二环己基胺盐、N-甲基-D-葡萄糖胺，以及与氨基酸如精氨酸和赖氨酸的盐。优选地，生长激素释放肽类似物H-Inp-DBal-DTrp-Phe-Apc-NH₂(SEQ ID NO:1)是制备为乙酸盐。

实施例

按照图15所示流程合成H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH₂

下文所述合成使用：(1)被保护的氨基酸作为起始原料，特别是Boc-Inp-OH、Boc-(D)Bal-OH、Z-Phe-OH和H-Apc(Boc)-OH，以及(2)未保护的氨基酸H-(D)Trp-OH。这些氨基酸是市场可获得的，或者可以用本领域已知的方法合成。

1.合成Boc-Inp-OSu

Boc-Inp-OSu是按照如图16所示的合成流程合成。

具体而言，室温下将Boc-Inp-OH(1.15g,5mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(SucOH)(0.69g,6mmol)溶于12.3mL乙腈中。当固体溶解后，将该溶液冷却至0℃，并逐滴加入DCC(1.08g 5.25mmol)溶于1.4ml乙腈中的溶液。将温度控制在0℃持续一小时，并随后历经4小时逐渐升至室温。反应过夜后，分两批加入溶于0.15ml乙腈中的DCC(0.10g,0.5mmol)。反应完全后，经过滤除去形成的DCC，并两次用3.8ml乙腈洗涤。合并母液，并真空浓缩至5ml体积的溶液。随后，将该浓缩的溶液加至10.4ml异丙醇中，其引起Boc-Inp-OSu沉淀。将该混悬液真空浓缩至8mL，并随后用12.5ml异丙醇稀释。滤出固体，用3.8ml异丙醇洗涤两次，并在45℃下真空干燥，得到1.51g白色粉末(90％产率)。

2.合成Boc-(D)Bal-OSu

Boc-DBal-OH是按照如图17所示的合成流程合成。

具体而言，室温下将Boc-(D)Bal-OH(1.61g,5mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(SucOH)(0.69g,6mmol)溶于17.6mL乙腈中。当固体溶解后，将该溶液冷却至0℃，并逐滴加入DCC(1.03g 5mmol)溶于1.3ml乙腈中的溶液。将温度控制在0℃持续一小时，并随后历经4小时逐渐升至室温。反应过夜后，分两批加入溶于0.15ml乙腈中的DCC(0.10g,0.5mmol)。反应完全后，经过滤除去形成的DCC，并两次用12ml乙腈洗涤。合并母液，并真空浓缩至13ml体积的溶液。随后，将该浓缩的溶液加至27ml异丙醇中。进一步真空浓缩过程中Boc-(D)Bal-OSu结晶。将乙腈用43mL另外的异丙醇进一步脱除。该混悬液的终体积为53mL。滤出固体，用9ml异丙醇洗涤两次，然后用9ml二异丙基醚洗涤，并在45℃下真空干燥，得到1.83g白色粉末(85％产率)。

3.合成H-(D)Bal-(D)Trp-OH

H-(D)Bal-(D)Trp-OH是按照如图19所示的合成流程合成。

具体而言，将H-(D)Trp-OH(0.91g,4.34mmol)加入(三甲基硅烷基)-N-二甲基-乙酰胺(1.27g,8.67mmol)和4.1ml乙酸乙酯中。将反应介质在45℃加热直至得到溶液(约2小时)。将溶液冷却至0℃，加入Boc-(D)Bal-OSu(1.83g 4.25mmol)在17.6ml乙酸乙酯的冷却溶液中。加完15分钟后，将反应介质加温至室温。得到所需转化率(约5小时)后，用3-(二甲基氨基)丙基胺(0.11g 1.06mmol)猝灭该反应，然后用14.5ml的4(w/v)％KHSO₄溶液洗涤两次，并用17ml的2(w/v)％NaCl溶液洗涤一次，最后用14mL去矿物质水洗涤一次。将所得有机相真空浓缩，加入13.4ml冰醋酸，并将该溶液进一步浓缩至9.7mL终体积。加入4-甲硫基苯酚(1.82g 12.75mmol)和4N HC1在二噁烷中的溶液(2.23g 8.5mmol)。2小时后终止反应，将反应介质在106ml二异丙基醚中沉淀。滤出固体，用20ml二异丙基醚洗涤两次。在45℃真空干燥过夜，得到1.98的HCl H-(D)Bal-(D)Trp-OH(90％产率)。

4.合成Boc-Inp-(D)Bal-(D)Trp-OH

Boc-Inp-(D)Bal-(D)Trp-OH是按照如图20所示的合成流程合成。

具体而言，将HCl H-(D)Bal-(D)Trp-OH(1.74g 3.83mmol)在40℃下在DIPEA(1.03g 7.86mmol)存在下溶于13.8mL DMA中。得到溶液后，将该混合物冷却至0℃，并在室温下以固体将Boc-Inp-OSu(1.31g 4.02mmol)加入该溶液中。加完一小时后，将反应介质加温至室温。反应过夜后，转化完全，并通过加入3-(二甲基氨基)丙基胺(0.08g 0.8mmol)猝灭反应。随后，将该混合物用56ml乙酸乙酯稀释，并用28mL的4(w/v)％KHSO₄溶液洗涤三次，然后用25mL去矿物质水洗涤一次。将所得有机相真空浓缩，并经共沸蒸馏干燥。加入总计68mL的另外的乙酸乙酯。将该溶液浓缩至14ml终体积，并在128ml二异丙基醚中沉淀。滤出固体，用24mL二异丙基醚洗涤两次，并在45℃真空干燥，得到1.6g固体(81％产率)。

5.合成Z-Phe-OSu

Z-Phe-OSu是按照如图18所示的合成流程合成。

具体而言，室温下将Z-Phe-OH(1.53g,5mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(SucOH)(0.69g,6mmol)溶于16.3ml乙腈中。固体溶解后，将该溶液冷却至0℃，并逐滴加入DCC(1.08g 5.25mmol)溶于1.3ml乙腈中的溶液。将温度控制在0℃持续一小时，并随后历经4小时逐渐升至室温。反应过夜后，分两批加入溶于0.15ml乙腈中的DCC(0.10g,0.5mmol)。反应完全后，经过滤除去形成的DCC，并两次用4ml乙腈洗涤。合并母液，并真空浓缩至6ml体积的溶液。随后，将该浓缩的溶液加至12ml异丙醇中。在进一步真空浓缩过程中Z-Phe-OSu结晶。将乙腈用14.5mL另外的异丙醇进一步脱除。该混悬液的终体积为24mL。滤出固体，用4ml异丙醇洗涤两次，并在45℃下真空干燥，得到1.7g白色粉末(87％产率)。

6.合成Z-Phe-Apc(Boc)-NH2

Z-Phe-Apc(Boc)-NH2是按照如图21所示的合成流程合成。

具体而言，将H-Apc(Boc)-OH(1.06g 4.2mmol)加入8.8ml乙酸乙酯与(三甲基硅烷基)-N-二甲基-乙酰胺(1.23g 8.4mmol)中。将该混悬液加热至45℃。得到溶液后，加入Z-Phe-OSu(1.7g 4.28mmol)在16.1ml乙酸乙酯中的溶液。将温度保持在45℃，反应过夜后，将反应用3-(二甲基氨基)丙基胺(0.11g 1.07mmol)猝灭。随后，将该混合物用11mL的4(w/v)％KHSO₄溶液洗涤两次，然后用11mL的2(w/v)％NaCl洗涤，并最后用11mL去矿物质水洗涤。将洗涤的有机相通过加入28ml乙酸乙酯进行共沸蒸馏干燥。将该溶液浓缩至28.2ml终体积，并冷却至0℃。

加入预先溶于1ml乙酸乙酯中的DCC(0.78g 4.63mmol)，然后逐滴加入9.261ml的0.5M氨在二噁烷中的溶液(4.63mmol)。加完后，将该混合物加温至室温，一小时后转化完成。加入0.83mL水猝灭反应，在35℃加热30分钟。经过滤除去DCU，并将所得溶液用33mL的4(w/v)％KHSO₄溶液洗涤两次，然后用33mL的4(w/v)％NaHCO₃洗涤，并最后用33mL去矿物质水洗涤。将洗涤的有机相经共沸蒸馏干燥。因此，加入29ml乙酸乙酯。终体积为7.8mL。向该溶液中加入7.7ml热的环己烷。在5℃下Z-Phe-Apc(Boc)-NH₂结晶过夜。过滤该晶体后，用15ml环己烷洗涤两次，将该固体在45℃下真空干燥。得到1.98g白色晶体(产率87％)。

7.合成H-Phe-Apc(Boc)-NH2

H-Phe-Apc(Boc)-NH2是按照如图22所示的合成流程合成。

具体而言，将Z-Phe-Apc(Boc)-NH₂(1.97g 3.65mmol)溶于6.15ml甲醇中。加入0.194g在炭上支撑的钯催化剂(0.18mmol)后，通入N₂气历经30分钟将反应惰化，并随后在35℃下将氢气通入该溶液中。2小时后，反应完全，将催化剂滤除。将所得溶液真空浓缩，并加入9ml乙腈。将溶液进一步浓缩，且H-Phe-Apc(Boc)-NH₂结晶。当体积达到4.1ml时，将该混悬液过滤，并将固体用10ml二异丙基醚洗涤两次。将该固体在45℃下真空干燥，得到1.3g固体(产率87％)。

8.合成Boc-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc(Boc)-NH2

Boc-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc(Boc)-NH2是按照如图23所示的合成流程合成。

具体而言，室温下将H-Phe-Apc(Boc)-NH₂(0.95g 2.35mmol)、Boc-Inp-(D)Bal-(D)Trp-OH(1.6g 2.47mmol)和2-羟基吡啶-N-氧化物(0.32g 2.84mmol)溶于11.3ml二甲基乙酰胺中。得到溶液后，将该混合物冷却至5℃，并加入乙基-N"-二甲基丙基碳二亚胺(0.55g 2.84mmol)。1小时后，将温度调至10℃，并在5小时后，将该混合物加热至室温。反应过夜后，得到满意的转化率，并将该混合物用40ml乙酸乙酯稀释。将所得溶液用19mL的4(w/v)％KHSO₄溶液洗涤，然后用14mL的4(w/v)％NaHCO₃洗涤三次，并最后用15mL去矿物质水洗涤。将洗涤后的有机相经共沸蒸馏干燥。因此，加入29ml乙酸乙酯。终体积为16.3mL。向该溶液中加入19ml热的环己烷。Boc-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc(Boc)-NH₂在5℃下结晶过夜。过滤该晶体后，用15ml环己烷洗涤两次，将固体在45℃下真空干燥。得到2g白色晶体(产率86％)。

9.合成H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH2(粗的)

H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH2按照图24所示的合成流程合成。

具体而言，将Boc-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc(Boc)-NH₂(2g 2.02mmol)和4-甲硫基苯酚溶于9ml异丙醇中。加入5N HCl在异丙醇中的溶液(3.3ml；20.2mmol)，并将该混合物加热至40℃。反应过夜后，反应完全，形成混悬液。将混悬液用83ml二异丙基醚稀释并过滤。将固体用10ml二异丙基醚洗涤三次。在45℃下真空干燥后，得到1.7g固体(70％产率)。

10/11.粗的H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH2的纯化/冷冻干燥

将粗产物在C18-接枝的硅胶柱上用乙腈/乙酸铵缓冲液梯度洗脱。将洗脱物分段，并将纯度高于95％的流份合并。将流份用水稀释，再次加样至柱上，用富含乙腈的梯度洗脱。真空蒸发乙腈，并将所得水溶液冷冻干燥，得到终产物，其为标题多肽的乙酸盐。

本文所引用的全部专利、公开的申请和文献以其整体引入作为参考。

当本发明通过其示例实施方案进行具体显示和描述时，本领域技术人员应当理解，可以做出形式上和细节上的不同变化，但不偏离所附权利要求涵盖的本发明的范围。