使用辛酸进行使病毒灭活或去除的蛋白质纯化。
背景
生物药物或使用包含治疗性蛋白质的药物组合物治疗疾病、病症或状况是许多制药和生物技术公司的战略要素。生物药物组合物中使用的许多蛋白质通过使用哺乳动物细胞系进行重组生产或通过从生物流体中纯化而获得。然而，通过这样的方法制备的治疗性蛋白质可能被病毒污染，表面上带有传染性致病病毒，这可能对个体的健康有害。有必要对包含治疗性蛋白质的介质进行处理以消除任何潜在的污染的病毒的活性。
传染性致病病毒的灭活可通过热灭活、溶剂/去污剂(S/D)灭活、pH灭活、化学灭活和/或辐照灭活来进行，其中S/D灭活可能是最广泛接受的可靠方法。
大多数人类病原体是有包膜病毒。这些病毒对由溶剂和去污剂引起的膜破裂敏感。采用热、酸性pH、化学品和辐照的灭活方法是有问题的，因为这些手段是刺激性和/或侵入性的，并且倾向于使被纯化的治疗性蛋白质变性或以其它方式失活。
对于病毒的灭活，作为药物产品纯化过程中病毒清除的一部分，通常通过去污剂或低pH处理步骤将有包膜病毒灭活，在该步骤中向药物产品的溶液添加去污剂或将其pH调节至约3.7(3.5-3.9)持续长达6小时或更久。然而，去污剂并不总是对所有种类的有包膜病毒都有效，它们可能具有环境问题，或者对于低pH灭活而言，因为当pH高于3.8时灭活效应逐渐消失，所以操作窗口非常窄。相反，当pH值低于3.5时，许多蛋白质的聚集体形成或变性风险急剧增加。
EP 0 374 625已经表明，辛酸在短时间内对大多数有包膜病毒是有效的。US 4,939,176报道了一种通过使生物活性蛋白质的溶液与辛酸接触来灭活该溶液中的病毒的方法。针对该方法所记载的优选条件是pH 4至pH 8，以及0.07(％w/w)至0.001(％w/w)的非电离形式的辛酸。
利用化学剂的其它病毒灭活方法是已知的。US 4,540,573教导了使用二烷基磷酸酯或三烷基磷酸酯作为抗病毒剂。US 4,534,972描述了一种使得治疗活性或免疫活性蛋白质溶液基本上不含病原体的方法。在US 4,534,972中，将蛋白质溶液与诸如菲咯啉铜等过渡金属络合物和还原剂接触，以在基本上不影响蛋白质活性的情况下实现病毒的灭活。
US 5,164,487涉及使用辛酸制备不含聚集体、血管活性物质和蛋白水解酶的IgG制剂。该方法包括在用离子交换或疏水性基质进行层析纯化之前使含有IgG的起始材料与0.4％至1.5％的辛酸接触。
Steinbuch等人显示了使用辛酸来沉淀存在于Cohn乙醇级分III中的大多数蛋白质和脂蛋白(除了免疫球蛋白以外)(Steinbuch等人，1973)。已经描述了免疫球蛋白从哺乳动物血清和腹水中的两步纯化(McKinney等人，1987)。首先使用辛酸来沉淀白蛋白和其它非IgG蛋白质，然后将硫酸铵添加至上清液中以使IgG沉淀。
在人免疫球蛋白制备过程中，通常认为只要优化了诸如温度和离子强度等参数，在pH 4.8下辛酸是大多数血浆蛋白质的有效沉淀剂。Steinbuch等人(1969)已经描述了用辛酸沉淀大部分血浆蛋白质，而不影响IgG、血浆铜蓝蛋白和IgA。Steinbuch等人使用辛酸从哺乳动物血清中分离了IgG，并且报道，在微酸性pH但不低于pH 4.5时，最佳地获得了大量的非免疫球蛋白沉淀。将血浆用pH 4.8的0.06M乙酸盐缓冲液2∶1稀释，然后用2.5wt.％辛酸盐处理以启动沉淀。
概述
本发明提供了一种从样品中纯化目标蛋白质的方法，其包括以下步骤：
i.将含有蛋白质的样品加载至固定相上，以使目标蛋白质结合至所述固定相；
ii.使具有结合的目标蛋白质的固相接触辛酸溶液；其中该辛酸溶液处于允许形成游离辛酸的pH下，并且其中如针对游离辛酸所测量的，该辛酸溶液是浓度为1至50mM的辛酸缓冲液；以及
iii.洗脱所述目标蛋白质。
本发明最终实现引入辛酸处理作为层析步骤的一部分，以便在没有不连续过程并且不需要人员关注的情况下进行病毒灭活，特别是在洗脱物的pH调节通过将其洗脱至缓冲液中而自动进行的情况下。
本发明的一个方面涉及一种从样品中纯化目标蛋白质的方法，其包括以下步骤：
i.将含有蛋白质的样品加载至固定相上，以使目标蛋白质结合至所述固相；
ii.使所述固相接触辛酸溶液；以及
iii.洗脱所述目标蛋白质。
本发明的又一方面涉及一种含有蛋白质的混合物中的病毒的灭活方法，其包括以下步骤：i.将样品加载至固定相上，以使目标蛋白质结合至所述固相；ii.使所述固相接触辛酸溶液，以便灭活并洗掉所述病毒；以及iii.洗脱所述目标蛋白质。
本发明的另一方面涉及一种制备无病毒蛋白质溶液的方法，其包括以下步骤：i.将样品加载至固定相上，以使目标蛋白质结合至所述固相；ii.使所述固相经历辛酸溶液洗涤，以便灭活并洗掉所述病毒；以及iii.洗脱所述目标蛋白质。
本发明的备选方面涉及一种病毒灭活方法，其中将包含a)目标蛋白质和b)一种或多种病毒类型的样品加载至固定相上，并用辛酸溶液洗涤。
一种灭活含有脂质外壳的病毒的方法，该方法包括以下步骤：i.将样品加载至固定相上，以使目标蛋白质结合至所述固相；ii.使所述固相经历辛酸溶液洗涤，以便灭活并洗掉所述病毒；以及iii.洗脱所述目标蛋白质。
本发明还涉及从包括以下步骤的方法获得的、基本上不含含有脂质外壳的病毒的蛋白质样品：i.将样品加载至固定相上，以使目标蛋白质结合至所述固相；ii.使所述固相经历辛酸溶液洗涤，以便灭活并洗掉所述病毒；以及iii.洗脱所述目标蛋白质。
本发明的再一方面涉及含有蛋白质的混合物中的支原体的灭活方法，其包括以下步骤：i.将样品加载至固定相上，以使目标蛋白质结合至所述固相；ii.使所述固相接触辛酸溶液，以便灭活并洗掉所述支原体；以及iii.洗脱所述目标蛋白质。
本发明还可解决从示例性实施方案的公开内容中可以明显看出的其它问题。
详述
本发明的一个方面涉及层析步骤过程中伴行的病毒灭活和蛋白质纯化。本发明的方法不需要技术人员参与灭活步骤以及单独向柱上加载。单一的灭活和捕获步骤可在没有技术人员参与的情况下进行。
通常，目标蛋白质的纯化包括对所述样品中的潜在病毒的灭活。因此，本发明的一个方面涉及无病毒蛋白质溶液的制备和根据本发明方法制备的无病毒蛋白质溶液。本发明的方法包括在加载含有蛋白质的溶液之后并在蛋白质洗脱之前，通过用含有辛酸的洗涤溶剂洗涤层析柱或膜来将病毒灭活。本发明的方法还灭活支原体并导致更大程度的宿主细胞蛋白质(HCP)减少。
对于本发明的蛋白质纯化和病毒灭活，辛酸溶液必须包含处于其游离酸或非电离酸形式的辛酸；也就是说，基本上作为游离辛酸或非电离辛酸。术语“游离辛酸”和“非电离辛酸”旨在表示处于其非解离形式的辛酸；也就是说，处于其质子化形式；即CH3(CH2)6CO2H。
本发明涉及从包含蛋白质的任何介质或样品中分离或纯化一种或多种目标蛋白质，通常是一种目标蛋白质，该介质或样品可进一步包含、潜在包含或包含一种或多种病毒。该样品可以是粗介质或已经以任何方式部分洗涤、过滤、渗滤(diafiltered)或部分纯化的介质。适当地，该样品选自发酵液、细胞培养物、细胞系培养基、腹水、组织培养基、转基因细胞培养基、人类或动物血液、包含血浆成分的人类或动物血浆。通常，该样品选自细胞系培养基如转基因细胞培养基以及人类或动物血浆。
所述样品或含有蛋白质的混合物是包含蛋白质的流体，该蛋白质一般是具有生物或治疗活性的蛋白质。流体可以是具有被病毒污染的可能性的任何流体。流体的非限制性实例包括组织和细胞培养提取物，如细胞裂解物、细胞上清液、胎盘提取物或腹水；生物流体，如血液、血浆、血清、乳汁、唾液、精液；或者包含具有活性的蛋白质的任何其它流体，或任何纯化的、部分纯化的此类流体，或包括来自先前纯化步骤的洗脱液的粗液体或胶体。
如上所述，在本发明中使用的样品以细胞系培养基如转基因细胞培养基以及人类或动物血浆作为其来源。
包含本发明蛋白质的本发明样品可以获自天然表达该蛋白质的生物体，经遗传工程化而表达该蛋白质的转基因生物体，或重组产生该蛋白质的细胞系。转基因生物体的非限制性实例包括本文公开的已被遗传工程化而表达感兴趣的蛋白质的生物体。包含蛋白质的本发明样品可来自生物体或转基因生物体，可使用本领域已知的常规方法从生物流体、组织或器官提取物或生物体的其它来源获得。此外，各种原核和/或真核表达系统也可以是本发明样品的来源，例如用于重组表达本文公开的蛋白质。作为本发明蛋白质的来源的表达系统可以包括但不限于诱导型表达、非诱导型表达、组成型表达、组织特异性表达、细胞特异性表达、病毒介导的表达、稳定整合的表达和瞬时表达。
本发明的蛋白质可由克隆至表达载体中的多核苷酸编码。原核表达载体、真核表达载体、酵母载体、昆虫载体、哺乳动物载体和其它合适的表达载体是本领域已知并且可商购获得的。
从生物体、转基因生物体或细胞培养系统初始收获后，包含本发明蛋白质的样品可经历包括渗滤过程的纯化或过滤过程。样品的这种初始或初步纯化可包括样品中蛋白质的浓缩、用于去除杂质的中间纯化步骤和用于去除其他杂质和蛋白质变体的精制步骤(polishing)中的一种或多种。
本发明的一个目的是灭活含有蛋白质的样品中的病毒。短语“病毒灭活”旨在表示特定样品中病毒颗粒数目的降低(“减少”)，和/或特定样品中病毒颗粒活性的降低，例如但不限于感染性和/或复制能力的降低。术语“病毒灭活”是指使在正常情况下能够复制的病毒体不能复制。该术语进一步包括从样品中去除病毒(至少部分地)或使其数目降低或减少。该术语包括在不知道是否存在病毒的情况下实施所述方法。例如，可将该方法应用于来自全血或血浆或细胞上清液的蛋白质，其中没有对病毒的存在与否进行表征并且不能保证来自血浆和细胞上清液的蛋白质对于向个体施用是安全的。本发明的实施方案导致但不限于超过6log10的病毒载量降低。也就是说，基于当前的检测极限，该方法导致病毒复制与对照相比减少1,000,000。
病毒颗粒的数目和/或活性的所述降低可以是约1％至约100％，优选约20％至约100％，更优选约30％至约100％，更优选约40％至约100％，甚至更优选约50％至约100％，甚至更优选约60％至约100％，更优选至少约70％，如至少约80％，更典型地至少约90％，如约95％至100％，优选约95％至约100％，典型地约99％至约100％的量级。
在某些非限制性实施方案中，纯化的抗体产物中病毒(若存在)的总量低于该病毒的ID50(将感染50％的目标群体的病毒量)或PFU(噬斑形成单位)，优选比该病毒的ID50/PFU低至少100倍，更优选比该病毒的ID50/PFU低至少10,000倍，更优选比该病毒的ID50/PFU低至少1,000,000倍。
本领域技术人员将会认识到，本发明的方法可灭活样品中的病毒，该病毒随后可从样品中去除，或者该方法既可灭活又可从样品中去除病毒。
本说明书的各方面部分地公开了含有脂质外壳的病毒。被称为病毒体的完整病毒颗粒由被称为衣壳的保护性蛋白质外壳所包围的核酸(DNA或RNA)组成。病毒可以分为无包膜病毒和有包膜病毒。如本文所用的，术语“含有脂质外壳的病毒”是指包含含有脂质的膜或包膜的任何病毒，例如有包膜病毒。有包膜病毒的壳体被脂蛋白膜或包膜围绕。由于病毒从宿主细胞的表面“芽生”，因此该包膜源自该宿主细胞并且主要由不被病毒基因组编码的脂质组成。有包膜病毒的大小在约45-55nm至约120-200nm的范围内。能够感染哺乳动物细胞的含有脂质外壳的病毒包括：DNA病毒，如疱疹病毒科(herpesviridae)病毒、痘病毒科(poxviridae)病毒或嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)病毒；RNA病毒，如黄病毒科(fliaviviridae)病毒、披膜病毒科(togaviridae)病毒、冠状病毒科(coronaviridae)病毒、δ-病毒属(deltavirus)病毒、正粘病毒科(orthomyxoviridae)病毒、副粘病毒科(paramyxoviridae)病毒、弹状病毒科(rhabdoviridae)病毒、布尼亚病毒科(bunyaviridae)病毒或纤丝病毒科(filoviridae)病毒；以及逆转录病毒，如逆转录病毒科(retroviridae)病毒或嗜肝DNA病毒科病毒。含有脂质外壳的病毒的非限制性实例包括人类免疫缺陷病毒、辛德毕斯病毒(sindbis virus)、单纯疱疹病毒、假狂犬病病毒、仙台病毒、水泡性口炎病毒、西尼罗河病毒(West Nile virus)、牛病毒性腹泻病毒、冠状病毒(corona virus)、马关节炎病毒、严重急性呼吸系统综合征病毒、鼠白血病病毒(MuLV)、传染性牛鼻气管炎病毒(IBRV)或痘苗病毒。
无包膜病毒是指壳体缺少脂蛋白膜或包膜的病毒。在无包膜病毒中，壳体介导向宿主细胞的附着和渗透。壳体通常是螺旋形或二十面体的。无包膜病毒的大小在约18-26nm至约70-90nm的范围内。能够感染哺乳动物细胞的无包膜病毒包括，例如细小病毒科(parvoviridae)病毒、腺病毒科(adenoviridae)病毒、双RNA病毒科(birnaviridae)病毒、乳头瘤病毒科(papillomaviridae)病毒、多瘤病毒科(polyomaviridae)病毒、小RNA病毒科(picornaviridae)病毒、呼肠病毒科(reoviridae)病毒和杯状病毒科(calciviridae)病毒。
所述病毒可以是但不限于MuLV、IBRV、HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、埃博拉病毒(Ebola)、西尼罗河病毒和汉坦病毒(hantavirus)，具有污染血液供应和基于血液的产品的潜力。难以在不严重损害蛋白质的质量和/或功能性的情况下去除或灭活可能存在于血液产品中的病毒剂。工业相关病毒的非限制性实例是：细小病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、布尼亚病毒科、弹状病毒科、呼肠孤病毒科、披膜病毒科、杯状病毒科、呼肠病毒科和小RNA病毒科。
所述病毒包括但不限于单链DNA病毒、双链DNA病毒、双链RNA病毒和单链RNA病毒。在进一步的方面，该病毒是有包膜病毒。有包膜病毒包括但不限于逆转录病毒、疱疹病毒或嗜肝DNA病毒(hepadnavirus)。在本发明的任何变化形式中，病毒可以选自腺病毒、非洲猪瘟病毒(African swine fever-line virus)、沙粒病毒(arenavirus)、动脉病毒(arterivirus)、星状病毒(astrovirus)、杆状病毒(baculovirus)、杆状DNA病毒(badnavirus)、杆状RNA病毒(barnavirus)、双RNA病毒(birnavirus)、雀麦花叶病毒(bromovirus)、布尼亚病毒(bunyavirus)、杯状病毒(calicivirus)、毛状病毒(capillovirus)、石竹隐潜病毒(carlavirus)、花椰菜花叶病毒(caulimovirus)、圆环病毒(circovirus)、线形病毒(closterovirus)、豇豆花叶病毒(comovirus)、冠状病毒(coronavirus)、被盖病毒(cotricovirus)、囊状病毒(cystovirus)、δ-病毒(deltavirus)、石竹病毒(dianthovirus)、耳突花叶病毒(enamovirus)、纤丝病毒(filovirus)、黄病毒(flavivirus)、真菌传杆状病毒(furovirus)、福塞尔噬菌体(fusellovirus)、双粒病毒(geminivirus)、嗜肝DNA病毒(hepadnavirus)、疱疹病毒(herpesvirus)、大麦病毒(hordeivirus)、低毒病毒(hypovirus)、ideaovirus、丝杆病毒(inovirus)、虹彩病毒(iridovirus)、轻小病毒(levivirus)、脂毛病毒(lipothrixvirus)、黄矮病毒(luteovirus)、玉米褪绿斑驳病毒(machlomovirus)、玉米雷亚多非纳病毒(marafivovirus)、微小病毒(microvirus)、肌尾病毒(myovirus)、坏死病毒(necrovirus)、野田村病毒(nodavirus)、正粘病毒(orthomyxovirus)、乳多空病毒(papovavirus)、副粘病毒(paramyxovirus)、分病毒(partitivirus)、细小病毒(parvovirus)、藻DNA病毒(phycodnavirus)、小RNA病毒(picornavirus)、芽生病毒(plamavirus)、短尾病毒(podovirus)、多DNA病毒(polydnavirus)、马铃薯X病毒(potexvirus)、马铃薯Y病毒(potyvirus)、痘病毒(poxvirus)、呼肠孤病毒(reovirus)、逆转录病毒(retrovirus)、弹状病毒(rhabdovirus)、根前毛菌噬菌体(rhizidiovirus)、sequevirus、长尾病毒(siphovirus)、南方菜豆花叶病毒(sobemovirus)、覆盖层病毒(tectivirus)、纤细病毒(tenuivirus)、四病毒(tetravirus)、烟草花叶病毒(tobamavirus)、烟草脆裂病毒(tobravirus)、披膜病毒(togavirus)、番茄丛矮病毒(tombusvirus)、全病毒(totivirus)、苹果退绿叶斑病毒(trichovirus)、芜菁黄花叶病毒(tymovirus)和幽影病毒(umbravirus)。在一些方面，病毒包括但不限于家畜流行性出血性疾病病毒(EHDV)、小鼠微小病毒(MMV)、小鼠细小病毒-1(MPV)、卡什谷病毒(cache valley virus)、囊病毒(Vesivirus)2117、猪圆环病毒(PCV1)、猪圆环病毒2(PCV2)、犬细小病毒(CPV)、牛细小病毒(BPV)或蓝舌病病毒(BTV)。
本发明的蛋白质通常是具有活性的蛋白质；优选地具有生物活性。该蛋白质可以是希望消除其中任何污染性病毒活性的任何感兴趣的蛋白质。
本发明的方法无限制地适用于所有蛋白质。如熟练技术人员所知，含有蛋白质的样品中的蛋白质通常是选择固定相的决定因素，因此不是本发明方法的限制因素。术语蛋白质旨在表示具有二级结构并任选地具有三级结构的寡肽或多肽链。术语蛋白质包括糖基化的寡肽、多肽和蛋白质，其包括糖蛋白，或与核酸序列连接的寡肽、多肽和蛋白质。蛋白质可包含本领域技术人员已知的任何翻译后修饰。蛋白质可包含非蛋白质元素、连接或修饰。特别是涉及但不限于来自转基因细胞的蛋白质时，本发明方法的蛋白质可包含一种或数种非天然氨基酸和/或非天然异构体。
本发明的方法无限制地适用于来自所有来源的蛋白质。含有蛋白质的样品中的蛋白质可选自血液蛋白质、乳蛋白质、细胞或细胞提取物蛋白质。含有蛋白质的样品中的蛋白质通常是血液蛋白质或来自细胞提取物的蛋白质，或激素。更典型地选自抗体或其片段，如Fab或单链抗体；受体，如可溶性受体；凝血因子，如FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI和FVIII；或生长激素。
术语“多肽”和“蛋白质”能够可互换地使用，以指代任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，其可以包含修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中断。该术语还包括已被天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化(lipidation)、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记组分缀合。该定义中还包括，例如，含有一种或多种氨基酸类似物(包括，例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其它修饰的多肽。
术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖例如单个单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂和中和抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多克隆抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、免疫粘附素和抗体片段，只要它们表现出所需的生物或免疫活性即可。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中可与抗体互换使用。
术语“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；单链抗体分子；双抗体(diabodies)；线性抗体；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文使用的术语“单克隆抗体”是指从基本均质性抗体群体获得的抗体，即除了可少量存在的可能天然存在的突变之外，组成该群体的单个抗体均是相同的。本文的单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而该链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及这些抗体的片段，只要它们表现出生物活性即可。
如上所述，纯化的精确定制(tailoring)依赖于对待纯化蛋白质的考虑。在某些实施方案中，本发明的分离步骤将抗体与一种或多种HCP分离。可使用本文所述方法成功纯化的抗体包括但不限于人IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM抗体。
在某些实施方案中，本发明的纯化策略排除蛋白A亲和层析的使用，例如IgG3抗体的纯化，因为IgG3抗体与蛋白A结合的效率低。允许具体定制纯化方案的其它因素包括但不限于：Fc区的存在与否(例如，在全长抗体与其Fab片段相比的情况下)，因为蛋白A与Fc区结合；在产生感兴趣抗体中使用的特定种系序列；以及抗体的氨基酸组成(例如，抗体的一级序列以及分子的总电荷/疏水性)。共享一种或多种特征的抗体可使用为利用该特征而定制的纯化策略进行纯化。
本发明的蛋白质可以是血液蛋白质，如凝血蛋白、白蛋白和/或免疫球蛋白。血液蛋白质的非限制性实例包括ADAMTS-13、a1-抗纤溶酶、a2-抗纤溶酶、抗凝血酶、抗凝血酶III、癌性促凝物(cancer procoagulant)、促红细胞生成素、因子II、因子V、因子VI、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、纤连蛋白、纤维蛋白原、肝素辅因子II、高分子量激肽原、肌内免疫球蛋白、静脉内免疫球蛋白、纤溶酶原、纤溶酶原激活物抑制剂-1、纤溶酶原激活物抑制剂-2、前激肽释放酶、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂、组织因子、组织纤溶酶原激活物、尿激酶或Von Willebrand因子。
本发明适合于从样品中分离和纯化抗体。通常，该样品包含细胞系收获物，其中该细胞系用于产生特异性蛋白质，例如本发明的特异性抗体。
实施例2和3综合起来表明，本发明的方法允许不同种类蛋白质的蛋白质纯化，因为伴随着两种不同蛋白质类型(即一个实例中的重组人抗体(IgG1)和另一个实例中的Fab)的纯化，实现了病毒如eMuLV的完全清除。此外，该实施例证明了伴行的抗体纯化与病毒灭活。
在优选的实施方案中，所述样品包含选自抗体或其片段、凝血因子和激素的蛋白质。该抗体优选选自抗TNF抗体、抗IL-6抗体、抗IL-8抗体、抗IL-12抗体、抗IL-16抗体、抗IL-20抗体、抗IL-21抗体、抗IL-23抗体、抗DR3抗体、抗CD27抗体、抗C5aR-215抗体、抗CD30抗体、抗TREM-1抗体、抗TREM-2抗体、抗uPA抗体、抗uPAR抗体、抗OX40抗体、抗BTLA抗体、抗GLP-1抗体、抗LAIR1抗体、抗LAIR2抗体、抗LILRAl抗体、抗Ly9抗体、抗PD1抗体、抗Siglec-9抗体、抗MMP2抗体、抗MMP6抗体、抗MMP8抗体、抗MMP9抗体和抗TIM3抗体。
所述蛋白质可以是激素，如选自hGH、胰高血糖素、kisspeptin和胰岛素的激素。
在典型的实施方案中，向填充有树脂的柱上加载澄清化的含有目标蛋白质的培养液。该柱通常加载约1至50g蛋白质/L树脂，如5-50g蛋白质/L树脂，典型地5至25g蛋白质/L树脂，更典型地10-20g蛋白质/L树脂。用pH在约5至6之间的含有约20-40mmol/kg辛酸钠的水性溶剂洗涤该柱，在pH稳定后持续约30分钟。在用含有甲酸的溶剂洗脱蛋白质之前，任选地用不同的溶剂进一步洗涤该柱以去除杂质。
样品向固定相上的加载可包括下列层析程序中的一种或多种：离子交换层析、亲和层析、混合模式层析和疏水相互作用层析。
因此，固定相可包含本领域已知的任何层析介质，包括用蛋白质结合配体、蛋白质、阴离子交换剂、阳离子交换剂固定的惰性基质。优选地，固定相是用于亲和层析的介质。
蛋白质从其病毒内含物中的纯化或病毒灭活是本发明的目的。实施例1显示，如通过掺加的eMuLV的清除所确定的，在具有Capto L介质的柱上采用辛酸洗涤进行的层析步骤完全清除了病毒内含物。实施例2在具有蛋白A介质的柱上也看到在实施例1中所看到的eMuLV的完全清除。因此，如通过病毒载量的清除所确定的蛋白质从其病毒内含物中的纯化或病毒灭活不依赖于柱中的介质。
当使用重组技术时，蛋白质可在细胞内、壁膜间隙中产生，或直接分泌到样品培养基中。在一个方面，例如如果蛋白质在细胞内产生，则在将样品加载到固相上之前，可任选地通过例如离心或超滤去除颗粒碎片，该碎片为宿主细胞或裂解的细胞(例如，由均质化产生的)。然而，该方法的一个优点是这种预备步骤不是必需的。当抗体分泌到培养基中时，可以首先使用可商购获得的蛋白质浓缩过滤器浓缩来自这类表达系统的上清液。
当蛋白质分泌到培养基中时，也可以通过例如切向流过滤将重组宿主细胞从细胞培养基中分离。可以使用本发明的方法从培养基中纯化本发明的蛋白质。
在一个实施方案中，亲和层析步骤包括将样品加载至包含合适的亲和层析载体的柱上。这类层析载体的非限制性实例包括但不限于蛋白A树脂、蛋白L树脂、蛋白G树脂、包含感兴趣的抗体所针对的抗原的亲和载体，以及包含Fc结合蛋白质的亲和载体。蛋白A树脂对抗体如IgG的亲和纯化和分离是有用的。
在加载至柱上后，可以使用例如平衡缓冲液洗涤该柱一次或多次。在洗脱该柱之前可使用包括采用不同缓冲液进行洗涤的其它洗涤。可以使用本领域技术人员公知的技术监测洗脱物。
合适的阳离子交换柱是固定相包含阴离子基团的柱子。这种柱子的一个实例是SP Sepharose(TM)柱。
合适的混合模式柱是固定相包含混合模式基团的柱子。这种柱子的一个实例是Capto MMC(TM)柱。
在另一个实施方案中，使样品经历疏水相互作用层析(“HIC”)。合适的柱子是固定相包含疏水基团的柱子。这种柱子的一个实例是苯基Sepharose(TM)柱。抗体在分离/纯化过程期间可能已经形成聚集体。该疏水层析步骤有利于这些聚集体的消除。它还有助于杂质的去除。
根据本发明的方法，将含有蛋白质的样品如细胞系培养基或血浆加载至固定相上，以使目标蛋白质结合至所述固定相。本发明的方法不限于任何固定相。实施例证明，不同的固定相均可在本发明的方法中使用。层析步骤可包括下列层析程序中的一种或多种：离子交换层析、亲和层析和疏水相互作用层析。固定相通常是层析柱的一部分。固定相通常是用于亲和层析的介质。固定相可选自离子交换层析柱、快速蛋白质液相层析柱和膨胀床吸附(EBA)层析柱，优选离子交换层析柱。
在一个实施方案中，固定相包含用免疫球蛋白结合蛋白质配体如重组蛋白或对抗体κ轻链可变区具有强亲和力的任何蛋白质固定的琼脂糖基质。这种固定相的一个实例是填充有Capto L介质(GE-Healthcare)的柱子。因此，在一个实施方案中，固定相包含通常固定于树脂上的蛋白L。在进一步的实施方案中，固定相包含蛋白A衍生的亲和介质。这种固定相的一个实例是填充有Mab Select SuRe介质的柱子。在进一步的实施方案中，固定相包含与强阳离子和/或强阴离子交换剂共同形成基质(matrixed)的琼脂糖。这样的固定相的实例包括Capto SP ImpRes和Capto Q ImpRes。
样品暴露于辛酸溶液的持续时间可随着多种因素而变化，包括但不限于游离辛酸的浓度、pH、病毒类型和温度。表A示出了在不同辛酸盐浓度下获得样品向辛酸溶液的优选暴露时间所需的pH。对于大多数实用目的，步骤ii.使固相接触辛酸溶液，或使样品接触辛酸溶液进行少于2小时，通常少于1小时，如0.05分钟至50分钟，更典型地0.10分钟至30分钟，优选0.25分钟至15分钟。
从表6和表7可以看出，病毒灭活通常在少于5分钟内实现。然而，根据条件(如游离辛酸的浓度、pH、病毒类型和温度)，为了实际目的需要长达1小时，如长达45分钟，如30分钟。
在本发明的典型实施方案中，用含有辛酸的水性溶剂将填充有树脂并加载目标蛋白质的柱子洗涤约30分钟。在用去除目标蛋白质的溶剂洗脱蛋白质之前，任选地用不同的溶剂进一步洗涤该柱以去除杂质。
辛酸溶液具有将病毒灭活而不使目标蛋白质变性的pH。辛酸溶液具有允许形成非离子型或游离辛酸的pH。因此，辛酸溶液的pH通常为酸性。
因此，辛酸溶液的pH为7.0或更低，如在2至7之间的pH，如低于6.5，如低于6.1，如2至6的pH，如pH为2＜pH≤6，优选3＜pH≤6，更优选4＜pH≤6，如4.5＜pH≤6，最优选2＜pH＜6，优选3＜pH＜6，更优选4＜pH＜6，如4.5＜pH＜6，如4.6≤pH＜6，如约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8和约5.9，例如4.9＜pH＜6。
从实施例2可以看出，低浓度的游离辛酸对于病毒如eMuLV的完全灭活仍然有效。在本发明的优选实施方案中，辛酸本身是缓冲液(pKa＝4.9)。通常，辛酸溶液是一种辛酸缓冲液，其浓度为1至100mM，通常为1至50mM，包括10至80mM，如30至70mM或30至50mM。优选地，非电离辛酸的浓度为1至10mM，如2至10mM，如2至8mM，如2至6mM。在典型的实施方案中，通过将35mmol/kg的辛酸钠与4.1mmol/kg的HCl混合，产生约5.6-6.7的pH，来制备所使用的缓冲液。可通过Henderson-Hasselbach方程式确定非电离辛酸的浓度：pH＝pKa+log([辛酸盐]/[辛酸])。
表A：在不同浓度和pH的辛酸盐缓冲液下，游离辛酸的浓度
表A示出了不同辛酸盐浓度下所需的pH，或者相反，不同pH水平下所需的浓度，以便实现本发明的蛋白质纯化所需的1mM游离辛酸的最小浓度。阴影区域描述了这样的实施方案，其中游离辛酸的浓度对于实际目的而言过低，于是为了根据本发明灭活可接受量的病毒，病毒灭活将会需要过长的暴露时间。
所述辛酸溶液通常是一种辛酸缓冲液，如针对游离辛酸所测量的，其浓度为1至500mM，通常为1至50mM，包括1至20mM，如2至20mM或1至10mM，更优选2至10mM，如2至8mM，如2至6mM。
所述辛酸溶液通常包含一定比例的i)辛酸盐和ii)无机或有机酸的组合，从而提供这样一种溶液：其pH低于7.0，如6.5或更低，如pH 1至6.2，并且如针对游离辛酸所测量的，其辛酸浓度为至少1mM，如至少2mM，如2至100mM，如2.5至100mM的浓度。
含有蛋白质的样品的加载和/或采用辛酸缓冲液的洗涤可在多个温度下进行，通常1至40℃，如1至30℃，如2至25℃。与实施例3中使用的温度相比，实施例4中使用的低温表明，在低温(2至8℃)和更高温度(15至25℃)下均实现了病毒灭活步骤。
可以通过常规技术，如通常采用有机酸的洗脱缓冲液，如酸性洗脱缓冲液，进行蛋白质的洗脱。在优选的实施方案中，该洗脱缓冲液是甲酸。在合适的实施方案中，通过将10mmol/kg的甲酸与3.4mmol/kg的NaOH混合，产生约3.5的pH，来制备洗脱缓冲液。该洗脱步骤也可通过高盐缓冲液进行。
在本发明的典型实施方案中，向填充有树脂的柱子上加载澄清化的含有目标蛋白质的培养液；该柱通常加载约10-40g蛋白质/L树脂，如20-40g蛋白质/L树脂，并且在2至25℃下，在约5至6之间的pH下，用含有约20-40mmol/kg辛酸钠的水性溶剂洗涤该柱，在pH稳定后持续约30分钟。在用含有甲酸的溶剂洗脱蛋白质之前，任选地用不同的溶剂进一步洗涤该柱以去除杂质。
本发明还涉及通过本发明方法获得的固体或溶液形式的蛋白质。在又一个实施方案中，本发明涉及一种或多种药物组合物，其包含蛋白质，如通过本发明方法获得的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，以及可接受的载体。
下列非限制性实例仅为了说明性目的而提供，以便促进对当前设想的代表性实施方案的更全面理解。不应将这些实例解释为限制本说明书中描述的任何实施方案，包括与本文公开的含有脂质外壳的病毒的灭活方法和使用这些方法处理的产物有关的那些实施方案。
非限制性地，下列实施方案是本发明的优选方式。
1.一种从样品中纯化目标蛋白质的方法，其包括以下步骤：
i.将含有蛋白质的样品加载至固定相上，以使目标蛋白质结合至所述固定相；
ii.使具有结合的目标蛋白质的固相接触辛酸溶液；其中该辛酸溶液处于允许形成游离辛酸的pH下，并且其中如针对游离辛酸所测量的，该辛酸溶液是浓度为1至50mM的辛酸缓冲液；以及
iii.洗脱所述目标蛋白质。
2.根据实施方案1所述的方法，其中目标蛋白质的纯化包括所述样品中病毒的灭活。
3.根据实施方案1或2中任一项所述的方法，其用于无病毒蛋白质溶液的制备。
4.根据实施方案1至3所述的方法，其中所述辛酸溶液包含一定比例的i)辛酸盐和ii)无机或有机酸的组合，从而提供一种酸性溶液，以及如针对游离辛酸所测量的，大于1mM，如至少2mM，如至少2.2mM，通常至少2.5mM的辛酸浓度。
4.根据实施方案1至3所述的方法，其中所述辛酸溶液包含一定比例的i)辛酸盐和ii)无机或有机酸的组合，从而提供这样一种溶液：其pH低于7.0，如6.5或更低，并且如针对游离辛酸所测量的，其辛酸浓度为至少1mM，如至少2mM，如2至10mM的浓度。
5.根据实施方案1至4所述的方法，其中所述蛋白质选自抗体或其片段，凝血因子如FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI和FVIII，以及生长激素。
6.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述样品选自发酵液、细胞培养物、细胞系培养基、腹水、组织培养基、转基因细胞培养基、包含血浆成分的人类或动物血浆。
7.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述固定相是层析柱。
8.根据实施方案7所述的方法，其中将所述样品加载至选自离子交换层析柱、亲和层析柱、混合模式层析柱、快速蛋白质液相层析柱和膨胀床吸附(EBA)层析柱的固定相上。
9.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述辛酸溶液具有将所述病毒灭活而不使所述目标蛋白质变性的pH。
10.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中辛酸溶液的pH为6.1或更低，如2-6，如pH为2＜pH≤6，优选3＜pH≤6，更优选4＜pH≤6，如4.5＜pH≤6，如4.6≤pH＜6，如约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8和约5.9.如4.9＜pH＜6。
11.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中辛酸溶液是一种辛酸缓冲液，如针对游离辛酸所测量的，其浓度为1至20mM，如2至20mM或1至10mM，更优选2至10mM如2至8mM，如2至6mM。
12.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述样品包含有包膜病毒、无包膜病毒，或无包膜病毒和有包膜病毒两者。
13.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其为自动化的，或是自动化蛋白质纯化过程的一部分。
14.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其进一步将支原体灭活。
15.一种用于纯化选自凝血因子、抗体或其Fab的蛋白质的方法，其包括以下步骤：
i.将包含一种或多种所述蛋白质的样品加载至用于亲和层析的固定相上；
ii.使固相接触pH为4.9＜pH＜6.2的、如针对游离辛酸所测量的2至10mM如2至8mM，如2至6mM的辛酸溶液，以便灭活并洗掉病毒；
iii.洗脱所述目标蛋白质。
本发明方法的另一优点是提供了病毒灭活的样品或不含病毒的样品，以及其中支原体被灭活的样品。此外，本发明方法提供了杂质如宿主细胞蛋白质(HCP)的量降低的样品。
实施例
实施例1
将含有重组人Fab片段的细胞系培养基通过0.22μm过滤器过滤，然后掺加eMuLV病毒。将掺加病毒的培养基加载至填充有Capto L介质(GE-Healthcare)的柱子上。加载后，首先用平衡缓冲液(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.2)洗涤该柱，然后用pH 5.5的35mM辛酸缓冲液(5.8mM游离辛酸)洗涤。用辛酸缓冲液洗涤30分钟后，用pH 3.5的20mM甲酸从该柱上洗脱Fab片段。工艺温度为15-25℃。Fab片段的收率为97％，并且在含有Fab片段的洗脱级分中未检测到eMuLV(表1)。
表1
*该试验的检测极限
这表明在具有Capto L介质的柱子上使用辛酸洗涤进行的层析步骤完全清除了掺加的eMuLV，LRV大于6.0log10。
实施例2
将含有重组人抗体(IgG1)的细胞系培养基通过0.22μm过滤器过滤，并掺加eMuLV病毒。将掺加病毒的培养基加载至填充有蛋白A(Mab Select SuRe，Ge Healthcare)的柱子上。加载后，首先用平衡缓冲液(50mmol/kg磷酸盐，300mmol/kg NaCl，pH 7.0)洗涤该柱，然后用pH 5.8的32mmol/kg辛酸盐缓冲液(2.9mM游离辛酸)洗涤。使用低浓度的辛酸盐和高pH来说明该步骤在最差条件(低辛酸浓度)下的有效性。pH稳定后，继续洗涤30分钟。在另外3次洗涤(平衡缓冲液，50mmol/kg磷酸盐、1mol/kg NaCl，然后平衡缓冲液)之后，用pH 3.5的甲酸盐缓冲液从该柱上洗脱mAb。mAb的收率为100％，并且在含有mAb的洗脱级分中未检测到eMuLV(表2)。工艺温度为15-25℃。
表2
*该试验的检测极限
在具有蛋白A介质的柱子上也看到在实施例1中所看到的eMuLV的完全清除。因此，掺加的病毒载量的清除不依赖于柱中的介质。而且，低浓度的游离辛酸对eMuLV的完全清除仍然有效。
实施例3
将含有重组人抗体(IgG4)的细胞系培养基通过0.22μm过滤器过滤，并掺加eMuLV病毒。将掺加病毒的培养基加载至填充有蛋白A(Mab Select SuRe，Ge Healthcare)的柱子上。加载后，首先用平衡缓冲液(50mmol/kg磷酸盐，300mmol/kg NaCl，pH 7.0)洗涤该柱，然后用pH 5.8的32mmol/kg辛酸盐缓冲液(2.9mM游离辛酸)洗涤。在pH稳定后，继续洗涤30分钟。在另外3次洗涤(平衡缓冲液，(50mmol/kg磷酸盐、1mol/kg NaCl)，然后平衡缓冲液)之后，用pH 3.5的甲酸盐缓冲液从该柱上洗脱mAb。mAb的收率为90％，并且在含有mAb的洗脱级分中未检测到eMuLV(表3)。工艺温度为15-25℃。
表3
*该试验的检测极限
使用与实施例2不同的另一种人抗体的该实施例说明，eMuLV的完全清除与细胞系培养基中的单克隆抗体无关。
实施例4
将含有重组人抗体(IgG1)的细胞系培养基通过0.22μm过滤器过滤并掺加eMuLV病毒。将掺加病毒的培养基加载至填充有蛋白A(Mab Select SuRe，Ge Healthcare)的柱子上。加载后，首先用平衡缓冲液(50mmol/kg磷酸盐，300mmol/kg NaCl，pH 7.0)洗涤该柱，然后用pH 5.7的35mmol/kg辛酸盐缓冲液(3.9mM游离辛酸)洗涤。pH稳定后，继续洗涤30分钟。在另外3次洗涤(平衡缓冲液，50mmol/kg磷酸盐、1mol/kg NaCl，然后平衡缓冲液)之后，用pH 3.5的甲酸盐缓冲液从该柱上洗脱mAb。
mAb的收率为90％，并且在含有mAb的洗脱级分中未检测到eMuLV(表4)。工艺温度为2-8℃。
表4
*该试验的检测极限
与实施例3中使用的温度相比，该实施例中使用的低温表明，在低温(2-8℃)和更高温度下均实现了eMuLV的完全清除。
实施例5
将中试装置(pilot plant)中的含有重组人抗体(IgG1)的170升细胞系培养基分成两等份，然后分别在自动化层析系统(pilot，GE Healthcare)上通过具有蛋白A(Mab Select SuRe，Ge Healthcare)的柱子运行。
将一份加载至蛋白A柱(7.1升Mab Select SuRe，Ge Healthcare)上，之后用3个缓冲液(平衡缓冲液，(50mmol/kg磷酸盐、1mol/kg NaCl)，然后平衡缓冲液)洗涤该柱。用pH 3.5的甲酸盐缓冲液从该柱上洗脱mAb。在低pH(3.7)下手动处理洗脱物60分钟。
另一份如实施例4一样处理，其中在蛋白A层析(7.1升Mab Select SuRe，Ge Healthcare)期间使用程序化的辛酸洗涤步骤，并且未在低pH下处理洗脱物。
然后将洗脱物分别加载至阳离子交换柱(2.2升Poros 50HS，Life Technologies)。在用平衡缓冲液(37.4mM乙酸缓冲液，pH 5)洗涤该柱之后，通过pH 5的乙酸缓冲液中0至300mM NaCl的线性梯度洗脱该柱。
两种洗脱物中的HMWP水平约为2％，但在低pH处理后增加至3％(参见表格)。在阳离子交换之后，用低pH处理的等份和在蛋白A层析期间用辛酸洗涤处理的等份中，HMWP的水平均为约2％。与用低pH处理的洗脱物中的CHO-HCP水平相比，来自用辛酸洗涤的蛋白A柱的洗脱物中的CHO-HCP水平仅为其大约一半(参见表格)。在阳离子交换之后，在蛋白A层析期间用辛酸洗涤处理的等份中的CHO-HCP水平仍然是用低pH处理的等份中的CHO-HCP量的一半。
在蛋白A层析期间采用辛酸洗涤的过程比采用低pH处理来自蛋白A的洗脱物的过程快约45分钟。在阳离子交换之后，两份中单克隆抗体的收率几乎相同(表5)。
表5
*N/A：未进行低pH处理
该实施例显示，通过在蛋白A柱上层析期间使用辛酸洗涤步骤，获得了较低浓度的CHO-HCP。在下一个层析步骤(阳离子交换)之后仍然观察到较低量的CHO-HCP。此外，避免了低pH步骤后的HMWP增加。与具有低pH步骤的过程相比，使用具有辛酸洗涤的过程节省了45分钟的工艺时间。
实施例6
在不同辛酸浓度和不同pH下研究了MuLV的灭活(表6)。在5.0至6.0的pH范围内，如果在pH升高的同时提高辛酸浓度，使得游离辛酸浓度保持在至少约4mM，则在5分钟后实现了MuLV的完全灭活。在约2mM的辛酸浓度下反应时间延长，这些最困难的病毒在30分钟之后部分灭活。低于1mM时，没有观察到灭活。
表6：用不同浓度和pH的辛酸灭活后的MuLV病毒滴度
*病毒噬斑太多而无法计数
辛酸的浓度取决于pH，并且只有游离辛酸才灭活有包膜病毒。因此，在5.9至6.3的pH范围内进一步研究了60mM辛酸的效果。在该pH范围内，在5分钟内有超过5.4log 10的MuLV完全灭活(表7)。在pH 6.3下，辛酸浓度为2.2mM，并且该浓度在该测试中也是有效的。
当辛酸的总浓度为60mM时，在5.9至6.2的pH下，MuLV灭活是高度有效的。对于60mM辛酸，当pH保持在6.1或更低时，获得最佳结果。
表7：用不同pH水平的60mM辛酸灭活MuLV后的MuLV滴度
结果显示，为了成为有效的，游离辛酸的浓度应该为至少1mM，优选至少约2mM，如约2.2mM，如至少约2.5mM或至少2.8mM。
本领域技术人员将会容易地认识到，高浓度的其它盐，如CaCl2或NaCl，可能降低辛酸的溶解度。本领域技术人员将会容易地认识到，应该避免非辛酸盐的盐的浓度超过500mM，如超过100mM或超过50mM，因为这会影响生成游离辛酸的能力。然而，本领域技术人员将会容易地认识到，辛酸的浓度应当不高于其溶解度。
已经表明，包括使用辛酸灭活病毒的蛋白质纯化方法在高于1mM的游离辛酸浓度下，通常对包括MuLV病毒在内的有包膜病毒的灭活是非常有效且快速的。虽然本文已经说明并描述了本发明的某些特征，但本领域普通技术人员将会想到许多修改、替换、改变和等同方案。因此，应当理解，所附权利要求旨在涵盖落在本发明的真正精神内的所有这些修改和改变。