本发明涉及新的氨基取代的稠合的嘧啶、其制备方法、其单独或以结合物的形式用于治疗和/或预防疾病的用途，及其用于制备用于治疗和/或预防疾病的药物的用途，特别是用于制备用于治疗和/或预防心血管病症的药物的用途。
哺乳动物细胞中最重要的细胞传递系统之一是环磷酸鸟苷(cgmp)。其连同一氧化氮(no)一起形成no/cgmp系统，一氧化氮由内皮释放并且传递激素和机械信号。鸟苷酸环化酶催化由鸟苷三磷酸(gtp)生物合成cgmp。目前已知的鸟苷酸环化酶家族的代表可以根据结构特征或配体类型分为两组：可由利钠肽激发的颗粒状鸟苷酸环化酶和可由no激发的可溶性鸟苷酸环化酶。可溶性鸟苷酸环化酶由两个亚基构成，并且很可能每个异源二聚体含有一个血红素，其是调控中心的一部分。这对于激活机制来说是至关重要的。no能够与血红素的铁原子结合并因此显著增加酶的活性。相比之下，不含血红素的制剂不能被no激发。一氧化碳(co)也能够与血红素的中心铁原子结合，但是由co引起的激发远小于由no引起的激发。
通过形成cgmp，以及由于所引起的对磷酸二酯酶、离子通道和蛋白激酶的调节，鸟苷酸环化酶在各种生理过程中起着重要作用，特别是在平滑肌细胞的松弛和增殖中、在血小板凝集和血小板粘附中、在神经元信号传递中以及在基于上述过程中断的病症中。在病理生理条件下，no/cgmp系统可被抑制，这会导致例如高血压、血小板激活、增加的细胞增殖、内皮功能障碍、动脉硬化、心绞痛、心力衰竭、心肌梗塞、形成血栓、中风和性功能障碍。
由于预期的高效率和低水平的副作用，通过靶向生物体内cgmp信号通路的影响，可行的用于这类病症的no非依赖性治疗是一种有前景的方法。
迄今为止，对于治疗性激发可溶性鸟苷酸环化酶，仅使用作用基于no的化合物，例如有机硝酸酯。no通过生物转化形成，并且通过攻击血红素的中心铁原子来激活可溶性鸟苷酸环化酶。除了副作用外，耐受性的增长也是这种治疗模式的关键缺点之一。
几年前，已经记载了直接激发可溶性鸟苷酸环化酶的一些物质，即不预先释放no，例如3-(5'-羟甲基-2'-呋喃基)-1-苄基吲唑[yc-1；wu等人，blood84(1994)，4226；mülsch等人，brit.j.pharmacol.120(1997)，681]。最近的可溶性鸟苷酸环化酶的刺激物包括bay41-2272、bay41-8543和riociguat(bay63-2521)(参见，例如staschj.-p.等人，nat.rev.drugdisc.2006；5：755-768；staschj.-p.等人，chemmedchem2009；4：853-865.staschj.-p.等人，circulation2011；123：2263-2273)。令人感兴趣的是，除了直接的鸟苷酸环化酶激发以外，这些sgc刺激物的一些(例如yc-1或bay41-2272)还表现出pde-5-抑制作用。为了使cgmp通路最大化，在药理学上希望刺激cgmp的合成同时抑制经pde-5的降解。这种双重原理在药理学方面是特别有利的(参见，例如oudout等人，eur.urol.2011；60，1020-1026；albersen等人，jsexmed.2013；10，1268-1277)。
在本发明的上下文中，当本发明的化合物表现出对重组鸟苷酸环化酶报道细胞系有效(根据b-2中的研究，最小有效浓度(mec)≤3μm)，并且表现出对人类磷酸二酯酶-5(pde5)的抑制(根据b-3中的研究，ic50<100nm)时，满足双重原理。
磷酸二酯酶-5(pde5)是一种切断cgmp中的磷酸酯键并形成5'-一磷酸鸟苷(5′-gmp)的酶的名称。在人类中，磷酸二酯酶-5主要存在于阴茎海绵体和肺动脉的平滑肌中。通过抑制pde5来阻断cgmp降解(使用例如西地那非、伐地那非或他达拉非)导致松弛信号通道的信号增加，特别是导致阴茎海绵体中的血液供应增加和肺血管中的压力降低。它们用于治疗勃起功能障碍和肺动脉高压。除了pde5之外，还存在切断cgmp的磷酸二酯酶(stasch等人circulation2011；123，2263-2273)。
作为可溶性鸟苷酸环化酶的刺激物，wo00/06568和wo00/06569公开了稠合的吡唑衍生物，以及wo03/095451公开了氨基甲酸酯取代的3-嘧啶基吡唑并吡啶。具有苯基酰胺取代基的3-嘧啶基吡唑并吡啶记载于e.m.becker等人，bmcpharmacology1(13)，2001。wo2004/009590记载了用于治疗cns病症的具有取代基4-氨基嘧啶的吡唑并吡啶。wo2010/065275和wo2011/149921公开了作为sgc激活剂的取代的吡咯并嘧啶和二氢吡啶并嘧啶。作为sgc的刺激物，wo2012/004259记载了稠合的氨基嘧啶，以及wo2012/004258、wo2012/143510和wo2012/152629记载了稠合的嘧啶和三嗪。wo2012/28647公开了用于治疗心血管病症的具有各种氮杂环的吡唑并吡啶。
本发明的目的是提供用作可溶性鸟苷酸环化酶的刺激物的新物质，其还用作可溶性鸟苷酸环化酶的刺激物和磷酸二酯酶-5的抑制剂(双重原理)，并且与现有技术已知的化合物相比，所述物质具有相同或改进的治疗特征，例如关于它们的体内特性(例如它们的药代动力学和药效动力学特性)、它们的溶解性和/或它们的代谢特征和/或它们的剂量-活性关系。
本发明的化合物的显著特征在于改进的溶解性，同时高的细胞渗透性。
本发明涉及通式(i)的化合物及其n-氧化物、其盐、其溶剂合物、其n-氧化物的盐以及其n-氧化物和盐的溶剂合物
其中
a表示氮或碳，
r1表示苯基、吡啶基、3,3,3-三氟丙-1-基、4,4,4-三氟丁-1-基或3,3,4,4,4-五氟丁-1-基，
其中苯基被1至3个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自氟、氯、(c1-c4)-烷基、环丙基和(c1-c4)-烷氧基，
并且
其中吡啶基被1或2个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自氟、(c1-c4)-烷基、环丙基和(c1-c4)-烷氧基，
r2表示氢或(c1-c4)-烷基，
r3表示(c1-c6)-烷基，
其中(c1-c6)-烷基被氨基取代并且被氟取代至多5次，
r4表示(c1-c4)-烷基，
其中(c1-c4)-烷基可被氟取代至多五次，
r5表示(c1-c4)-烷基，
其中(c1-c4)-烷基可被氟取代至多五次，
或
r4和r5连同与它们连接的碳原子一起形成3至6元碳环，
r6表示氢，
r7表示氢或氟，
r8表示氢、氯、氟或(c1-c4)-烷基。
本发明的化合物为式(i)的化合物及其盐、其溶剂合物以及其盐的溶剂合物，包含于式(i)的下文所述式的化合物及其盐、其溶剂合物以及其盐的溶剂合物，及包含于式(i)并在下文中作为工作实施例示出的化合物及其盐、其溶剂合物及其盐的溶剂合物，在这个意义上，包含于式(i)并在下文中示出的化合物并不已经是盐、溶剂合物及盐的溶剂合物。
在本发明的上下文中，优选的盐为本发明的化合物的生理上可接受的盐。还包括其本身不适于药学应用但可用于例如分离或纯化本发明的化合物的盐。
本发明的化合物的生理上可接受的盐包括无机酸、羧酸和磺酸的酸加成盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、甲苯磺酸盐、苯磺酸盐、萘二磺酸盐、甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、马来酸盐和苯甲酸盐。
本发明的化合物的生理上可接受的盐还包括常规碱的盐，例如且优选碱金属盐(例如钠盐和钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)，和衍生自氨或具有1至16个碳原子的有机胺的铵盐，所述有机胺例如且优选乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二异丙基胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、二甲基氨基乙醇、普鲁卡因、二苄基胺、n-甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸、乙二胺和n-甲基哌啶。
在本发明的上下文中，溶剂合物是指本发明的化合物通过与溶剂分子配位而形成固态或液态的络合物的那些形式。水合物是一种具体形式的溶剂合物，其中配位是与水发生的。在本发明的上下文中，优选的溶剂合物是水合物。
根据其结构，本发明的化合物可以不同的立体异构体的形式存在，即以构型异构体的形式存在或如果合适作为构象异构体(对映异构体和/或非对映异构体，包括阻转异构体的那些)的形式存在。因此，本发明包括对映异构体和非对映异构体，以及其各自的混合物。可以用已知的方法从这些对映异构体和/或非对映异构体的混合物中分离出立体异构的均一组分；为此，优选使用色谱法，特别是在非手性相或手性相上的hplc色谱法。
如果本发明的化合物可以互变异构的形式存在，则本发明包括所有互变异构形式。
本发明还包括本发明化合物的所有适合的同位素变体。在本文中，本发明化合物的同位素变体应理解为意指这样的化合物：其中本发明的化合物中的至少一个原子被替换为原子序数相同但原子质量与在自然界中通常或主要存在的原子质量不同的另一原子。可引入本发明的化合物的同位素的实例为氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘的同位素，例如2h(氘)、3h(氚)、13c、14c、15n、17o、18o、32p、33p、33s、34s、35s、36s、18f、36cl、82br、123i、124i、129i和131i。本发明的化合物的特定的同位素变体，尤其是其中已引入一种以上的放射性同位素的那些变体可以有利于例如研究作用机制或活性化合物在机体内的分布；由于相对容易的可制备性和可检测性，用3h或14c同位素标记的化合物特别适于此目的。此外，引入同位素(例如氘)可因化合物的代谢稳定性更高而产生特别的治疗益处，例如延长在机体中的半衰期或降低所需的活性剂量；因此，在一些情况下，本发明的化合物的这种改性还可构成本发明的优选实施方案。本发明化合物的同位素变体可通过本领域技术人员已知的方法来制备，例如通过下文描述的方法以及在工作实施例中描述的步骤，通过使用相应同位素修饰的特定试剂和/或原料来制备。
另外，本发明还包括本发明的化合物的前药。在本发明的上下文中，术语“前药”是指这样的化合物：其本身可以是生物活性的或无生物活性的，但其在体内停留的期间反应(例如代谢或水解)得到本发明的化合物。
在本发明的上下文中，除非另有说明，取代基具有以下定义：
在本发明的上下文中，烷基为具有指定的特定碳原子数的直链或支链烷基基团。例如且优选地可述及以下基团：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、1-甲基丙基、叔丁基、正戊基、异戊基、1-乙基丙基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,4-二甲基戊基、4,4-二甲基戊基和1,4,4-三甲基戊基。
在本发明的上下文中，烷氧基为具有1至4个碳原子的直链或支链烷氧基基团。例如且优选地可述及以下基团：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基和叔丁氧基。
在本发明的上下文中，环烷基或碳环为具有各自指定的环碳原子数的单环饱和烷基。例如且优选地可述及以下基团：环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
在本发明的上下文中，卤素包括氟、氯、溴和碘。优选氯或氟。
在r1和r3可代表的基团的式中，由符号#或##标记的线的端点不代表碳原子或ch2基团，而是与r1或r3键合的各原子的键的一部分。
当本发明的化合物中的基团被取代时，所述基团可被单取代或多取代，除非另有说明。在本发明的上下文中，出现大于一次的所有基团以彼此独立的方式进行定义。优选被一个或两个相同或不同的取代基取代。非常特别优选被一个取代基取代。
在本发明的上下文中，术语“治疗(treatment或treating)”包括抑制、延迟、阻止、缓解、减轻、限制、降低、压制、消退或治愈疾病、病症、障碍、损伤或健康问题，或所述状态和/或所述状态的症状的发展、进程或演进。在本文中，术语“治疗(therapy)”应理解为术语“治疗(treatment)”的同义词。
在本发明的上下文中，术语“预防(prevention)”、“预防(prophylaxis)”或“阻止(preclusion)”同义使用，并且是指避免或降低感染、经受、遭受或患有疾病、病症、障碍、损伤或健康问题的风险，或避免或降低所述状态和/或所述状态的症状的发展或演进的风险。
可以部分或完全治疗或预防疾病、病症、障碍、损伤或健康问题。
在本发明的上下文中，优选式(i)的化合物及其n-氧化物、其盐、其溶剂合物、其n-氧化物的盐以及其n-氧化物和盐的溶剂合物，其中
a表示氮或碳，
r1表示苯基或吡啶基，
其中苯基被1至3个彼此独立地选自氟和甲基的取代基取代，
并且
其中吡啶基被1或2个彼此独立地选自氟和甲基的取代基取代，
r2表示氢或甲基，
r3表示
其中
##表示与氮原子连接的点，
r4表示甲基或乙基，
其中甲基和乙基可被氟取代至多三次，
r5表示甲基或乙基，
其中甲基和乙基可被氟取代至多三次，
r6表示氢，
r7表示氢或氟，
r8表示氢、氯、甲基或乙基。
在本发明的上下文中，优选式(i)的化合物及其n-氧化物、其盐、其溶剂合物、其n-氧化物的盐以及其n-氧化物和盐的溶剂合物，其中
a表示氮，
r1表示苯基或吡啶基，
其中苯基被1至3个氟取代基取代，
并且
其中吡啶基被氟取代，
r2表示氢，
r3表示
其中
##表示与氮原子连接的点，
r4表示甲基或三氟甲基，
r5表示甲基或三氟甲基，
r6表示氢，
r7表示氢或氟，
r8表示氢、甲基或乙基。
在本发明的上下文中，特别优选式(i)的化合物及其n-氧化物、其盐、其溶剂合物、其n-氧化物的盐以及其n-氧化物和盐的溶剂合物，其中
a表示氮，
r1表示下式的苯基
其中
#表示与亚甲基连接的点，
并且
r9表示氢或氟，
r10表示氟，
r11表示氢或氟，
或
表示3-氟吡啶-2-基，
r2表示氢，
r3表示
其中
##表示与氮原子连接的点，
r4表示甲基，
r5表示甲基或三氟甲基，
r6表示氢，
r7表示氢或氟，
r8表示氢或甲基。
在本发明的上下文中，还优选式(i)的化合物及其n-氧化物、其盐、其溶剂合物、其n-氧化物的盐以及其n-氧化物和盐的溶剂合物，其中
a表示氮或碳。
在本发明的上下文中，还优选式(i)的化合物及其n-氧化物、其盐、其溶剂合物、其n-氧化物的盐以及其n-氧化物和盐的溶剂合物，其中
a表示碳。
在本发明的上下文中，还特别优选式(i)的化合物及其n-氧化物、其盐、其溶剂合物、其n-氧化物的盐以及其n-氧化物和盐的溶剂合物，其中
a表示氮。
在本发明的上下文中，还优选式(i)的化合物及其n-氧化物、其盐、其溶剂合物、其n-氧化物的盐以及其n-氧化物和盐的溶剂合物，其中
r1表示下式的苯基
其中
#表示与亚甲基连接的点，
并且
r9表示氢或氟，
r10表示氟，
r11表示氢或氟，
或
表示3-氟吡啶-2-基。
在本发明的上下文中，还优选式(i)的化合物及其n-氧化物、其盐、其溶剂合物、其n-氧化物的盐以及其n-氧化物和盐的溶剂合物，其中
r1表示下式的苯基
其中
#表示与亚甲基连接的点，
并且
r9表示氢或氟，
r10表示氟，
r11表示氢或氟。
在本发明的上下文中，还优选式(i)的化合物及其n-氧化物、其盐、其溶剂合物、其n-氧化物的盐以及其n-氧化物和盐的溶剂合物，其中
r1表示3-氟吡啶-2-基。
在本发明的上下文中，还优选式(i)的化合物及其n-氧化物、其盐、其溶剂合物、其n-氧化物的盐以及其n-氧化物和盐的溶剂合物，其中
r3表示
其中
##表示与氮原子连接的点。
在本发明的上下文中，还优选式(i)的化合物及其n-氧化物、其盐、其溶剂合物、其n-氧化物的盐以及其n-氧化物和盐的溶剂合物，其中
r4表示甲基。
在本发明的上下文中，还优选式(i)的化合物及其n-氧化物、其盐、其溶剂合物、其n-氧化物的盐以及其n-氧化物和盐的溶剂合物，其中
r5表示甲基或三氟甲基。
在本发明的上下文中，还优选式(i)的化合物及其n-氧化物、其盐、其溶剂合物、其n-氧化物的盐以及其n-氧化物和盐的溶剂合物，其中
r5表示甲基。
在本发明的上下文中，还优选式(i)的化合物及其n-氧化物、其盐、其溶剂合物、其n-氧化物的盐以及其n-氧化物和盐的溶剂合物，其中
r5表示三氟甲基。
在本发明的上下文中，还优选式(i)的化合物及其n-氧化物、其盐、其溶剂合物、其n-氧化物的盐以及其n-氧化物和盐的溶剂合物，其中
r7表示氢或氟。
在本发明的上下文中，还优选式(i)的化合物及其n-氧化物、其盐、其溶剂合物、其n-氧化物的盐以及其n-氧化物和盐的溶剂合物，其中
r7表示氢。
在本发明的上下文中，还优选式(i)的化合物及其n-氧化物、其盐、其溶剂合物、其n-氧化物的盐以及其n-氧化物和盐的溶剂合物，其中
r7表示氟。
在本发明的上下文中，还优选式(i)的化合物及其n-氧化物、其盐、其溶剂合物、其n-氧化物的盐以及其n-氧化物和盐的溶剂合物，其中
r8表示氢或甲基。
在本发明的上下文中，还优选式(i)的化合物及其n-氧化物、其盐、其溶剂合物、其n-氧化物的盐以及其n-氧化物和盐的溶剂合物，其中
r8表示氢。
在本发明的上下文中，还优选式(i)的化合物及其n-氧化物、其盐、其溶剂合物、其n-氧化物的盐以及其n-氧化物和盐的溶剂合物，其中
r8表示甲基。
在基团的各个组合或优选的组合中，具体说明的各基团的定义还视需要独立于所述基团的各个组合而被其他组合的基团定义替代。
非常特别优选上述优选范围的两个以上的结合。
指定为优选、特别优选和非常特别优选的基团定义同时适用于式(i)的化合物并相应地适用于所有中间体。
此外，本发明提供了一种制备本发明的式(i)的化合物的方法，其特征在于，式(ii)的化合物
其中r1、r6、r7和r8各自具有上文给出的含义，
在惰性溶剂中，任选地在合适的碱的存在下与式(iii)的化合物反应
其中r4和r5各自具有上文给出的含义，并且
t1表示(c1-c4)-烷基，
得到式(iv)的化合物
其中r1、r4、r5、r6、r7和r8各自具有上文给出的含义，
然后，将式(iv)的化合物用亚硝酸异戊酯和碘等价物转化为式(v)的化合物
其中r1、r4、r5、r6、r7和r8各自具有上文给出的含义，
然后，在惰性溶剂中将式(v)的化合物用式(vi)的化合物进行转化
其中
r2和r3各自具有上文给出的含义，
并将所得的式(i)的化合物任选地用合适的(i)溶剂和/或(ii)碱或酸转化成其溶剂合物、其盐和/或其盐的溶剂合物。
用于方法步骤(ii)+(iii)→(iv)的惰性溶剂为，例如，醇类，例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇或叔丁醇；醚类，例如乙醚、二氧杂环己烷、二甲氧基乙烷、四氢呋喃、乙二醇二甲醚或二甘醇二甲醚；烃类，例如苯、二甲苯、甲苯、己烷、环己烷或矿物油馏分；或者其他溶剂，例如二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基亚砜(dmso)、n,n'-二甲基亚丙基脲(dmpu)、n-甲基吡咯烷酮(nmp)、吡啶、乙腈、环丁砜或水。也可以使用所述溶剂的混合物。优选叔丁醇、甲醇或乙醇。
用于方法步骤(ii)+(iii)→(iv)的合适的碱为碱金属氢氧化物，例如氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾；碱金属碳酸盐，例如碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾或碳酸铯；碱金属碳酸氢盐，例如碳酸氢钠或碳酸氢钾；碱金属醇盐，例如甲醇钠或甲醇钾、乙醇钠或乙醇钾或者叔丁醇钾；或者有机胺，例如三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(dbu)或1,5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(dbn)。优选叔丁醇钾或甲醇钠。
反应(ii)+(iii)→(iv)通常在+20℃至+150℃、优选+75℃至+100℃的温度范围内进行，任选地在微波中进行。转化可在大气压、加压或减压(例如0.5至5巴)下进行。通常，所述反应在大气压下进行。
在转化(iv)→(v)中，合适的卤素来源为，例如，二碘甲烷，碘化铯、碘和碘化亚铜(i)或溴化铜(ii)的混合物。
在二碘甲烷作为卤素来源的情况下，方法步骤(iv)→(v)使用基于1mol的式(iv)的化合物计5至30mol的亚硝酸异戊酯和5至30mol的碘等价物的摩尔比来进行。
方法步骤(iv)→(v)在存在或不存在溶剂的情况下进行。合适的溶剂为在反应条件下为惰性的全部有机溶剂。优选的溶剂为二氧杂环己烷。
反应(iv)→(v)通常在+20℃至+100℃、优选+50℃至+100℃的温度范围内进行，任选地在微波中进行。所述转化可在大气压、加压或减压下进行。
用于方法步骤(v)+(vi)→(i)的惰性溶剂为，例如，醚类，例如乙醚、二氧杂环己烷、二甲氧基乙烷、四氢呋喃、乙二醇二甲醚或二甘醇二甲醚；烃类，例如苯、二甲苯、甲苯、己烷、环己烷或矿物油馏分；或者其他溶剂，例如二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基亚砜(dmso)、n,n'-二甲基亚丙基脲(dmpu)、n-甲基吡咯烷酮(nmp)、吡啶、乙腈或环丁砜。也可以使用所述溶剂的混合物。优选nmp或dmso。
反应(v)+(vi)→(i)通常在+20℃至+100℃、优选+100℃至+200℃的温度范围内进行，任选地在微波中进行。所述转化可在大气压、加压或减压(例如0.5到5巴)下进行。
所述制备方法可以通过以下合成方案来举例说明(方案1和方案2)：
方案1
[a):叔丁醇，任选地叔丁醇钾，回流；b):二碘甲烷，亚硝酸异戊酯，二氧杂环己烷，85℃]。
方案2
[a):nmp，130℃；微波]。
式(iii)的化合物为市售的、文献已知的或可通过类似于文献已知的方法制备，
或者，
在式(iii)中，如果r5表示三氟甲基且r4表示甲基，则式(iii)的化合物可通过在惰性溶剂中使式(vii)的化合物与甲基卤化镁反应来制备
式(vii)的化合物是文献已知的(参见，例如，journaloffluorinechemistry，1991，第51卷，#3，第323–334页)。
式(ii)的化合物是文献已知的(参见，例如，wo03/095451，实施例6a；wo2013/104703，实施例52a；wo2013/030288，实施例54a)或可按照下面的合成方案(方案3)制备。
方案3
[a):水合肼，1,2-乙二醇；b):亚硝酸异戊酯，nai，thf；c):cs2co3，dmf；d):cucn，dmso，e):1.naome，meoh，2.nh4cl，乙酸]。
式(viii)的化合物是文献已知的[wo2007/041052]或可通过类似于文献已知的方法制备[wo2013/004785和wo2011/149921]。
详细步骤和其他文献参考也可参见实验部分关于制备起始化合物和中间体的部分。
本发明的其他化合物也可以任选地从通过上述方法获得的式(i)化合物起始，通过转化各个取代基的官能团(特别是针对r3列出的那些)来制备。这些转化通过本领域技术人员已知的常规方法进行，并且包括，例如，下列反应：例如亲核和亲电取代、氧化、还原、氢化、过渡金属催化的偶联反应、消去、烷基化、氨基化、酯化、酯水解、醚化、醚裂解、形成羧酰胺(carbonamide)，以及引入和除去临时保护基团。
本发明的化合物用作可溶性鸟苷酸环化酶的有效刺激物，具有有用的药理学特性且具有改善的治疗特征，例如关于其体内特性和/或其药代动力学特征和/或其代谢特性。因此，它们适用于治疗和/或预防人和动物中的疾病。
本发明的化合物导致血管舒张和抑制血小板凝集，并且导致血压降低和冠状血流增加。这些作用是通过直接激发可溶性鸟苷酸环化酶和细胞内增加cgmp进行介导的。此外，本发明的化合物增强了增加cgmp水平的物质的作用，所述物质例如edrf(内皮细胞衍生的松弛因子)、no供体、原卟啉ⅸ、花生四烯酸或苯肼衍生物。
本发明的化合物适用于治疗和/或预防心血管、肺、血栓栓塞和纤维化病症。
因此，本发明的化合物可以用在用于以下用途的药物中：用于治疗和/或预防心血管病症，例如高血压(hypertension)、难治性高血压、急性和慢性心力衰竭、冠心病、稳定型和不稳定型心绞痛、外周和心血管疾病、心律不齐、房性和室性心律失常和传导紊乱(例如i-iii度房室传导阻滞(ab阻滞i-iii))、室上性快速性心律失常、心房纤维颤动、心房扑动、心室纤颤、心室扑动、室性快速型心律失常、尖端扭转型室性心动过速、房性和室性期前收缩、房室交接区性期前收缩、病窦综合征、晕厥、房室结折返性心动过速、沃-帕-怀综合征、急性冠状动脉综合征(acs)、自身免疫性心脏疾病(心包炎、心内膜炎、心瓣炎、主动脉炎、心肌疾病)、休克(例如心源性休克、感染性休克和过敏性休克)、动脉瘤、拳师犬心肌病(心室早发性收缩(pvc))；用于治疗和/或预防血栓栓塞病症和缺血，例如心肌缺血、心肌梗塞、中风、心脏肥大、短暂的缺血性发作、先兆子痫、炎性心血管病症、冠状动脉和外周动脉痉挛、水肿形成(例如肺水肿、脑水肿、肾水肿或者心力衰竭导致的水肿)、外周循环障碍、再灌注损伤、动脉和静脉形成血栓、微白蛋白尿、心肌机能不全、内皮功能障碍；用于预防再狭窄，例如溶栓治疗、经皮腔内血管成形术(pta)、冠状动脉经腔血管成形术(ptca)、心脏移植和搭桥手术后的再狭窄，以及微血管和大血管损伤(血管炎)、血纤蛋白原和低密度ldl水平升高和纤溶酶原激活物抑制剂1(pai-1)浓度升高；以及用于治疗和/或预防勃起机能障碍和雌性性功能障碍。
在本发明的上下文中，术语“心力衰竭”包括急性和慢性形式的心力衰竭，以及更具体的或相关的疾病类型，例如急性代偿失调性心力衰竭、右心衰竭、左心衰竭、全心衰竭(globalfailure)、缺血性心肌病、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、特发性心肌病、先天性心脏缺陷、与心瓣膜缺陷相关的心力衰竭、二尖瓣狭窄、二尖瓣闭锁不全、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣闭锁不全、三尖瓣狭窄、三尖瓣闭锁不全、肺动脉瓣狭窄、肺动脉瓣闭锁不全、混合性心瓣膜缺陷、心肌炎症(心肌炎)、慢性心肌炎、急性心肌炎、病毒性心肌炎、糖尿病性心力衰竭、酒精中毒性心肌病、心脏贮积病(cardiacstoragedisease)、舒张性心力衰竭和收缩性心力衰竭，以及已存在的慢性心力衰竭的急性加重期(加重的心力衰竭)。
此外，本发明的化合物还可用于治疗/或预防动脉硬化、受损的脂类代谢、血脂蛋白过少症、血脂障碍、高甘油三酸酯血症、高脂血症、高胆固醇血症、无β脂蛋白血症、谷固醇血症、黄色瘤病、丹吉尔病、肥胖症，肥胖以及混合性高脂血症和代谢综合征。
此外，本发明的化合物可用于治疗和/或预防原发性和继发性雷诺现象、微循环病症、跛行、外周和自主神经病、糖尿病性微血管病、糖尿病视网膜病、糖尿病性四肢溃疡、坏疽、crest综合征、全身性红斑狼疮(erythematosis)、甲癣、风湿病，以及用于促进伤口愈合。
此外，本发明的化合物适用于治疗泌尿科病症，例如良性前列腺综合征(bps)、良性前列腺增生(bph)、良性前列腺肥大(bpe)、膀胱出口梗阻(boo)、下泌尿道综合征(luts，包括猫泌尿综合征(fus))、泌尿生殖系统疾病(包括神经原性膀胱过度活动症(oab)和(ic))、失禁(ui)(例如混合性尿失禁、急迫性尿失禁、压力性尿失禁或充溢性尿失禁(mui、uui、sui、oui))、骨盆痛、雄性和雌性泌尿生殖系统器官的良性和恶性病症。
本发明的化合物还适用于治疗和/或预防肾病，特别是急性和慢性肾功能不全以及急性和慢性肾衰竭。在本发明的上下文中，术语“肾功能不全”涵盖急性和慢性表现的肾功能不全，以及潜在的或相关的肾病，例如肾血流灌注不足、透析相关性低血压(intradialytichypotension)、梗阻性尿路病、肾小球病、肾小球肾炎、急性肾小球肾炎、肾小球硬化症、肾小管间质疾病、肾病障碍(nephropathicdisorder)例如原发性和先天性肾病、肾炎、免疫性肾病(例如肾移植排斥和免疫复合物诱导的肾病、毒性物质诱导的肾病、造影剂诱导的肾病)、糖尿病和非糖尿病性肾病、肾盂肾炎、肾囊肿、肾硬化、高血压性肾硬化以及可通过以下进行诊断性表征的肾病综合征：例如肌酐和/或水排泄的异常减少；尿素、氮、钾和/或肌酐的血液浓度的异常升高；肾脏酶(例如谷氨酰基合成酶)的活性改变；尿液渗透压或尿量的改变；微量白蛋白尿、巨量白蛋白尿(macroalbuminuria)的增加；肾小球和小动脉的损伤；肾小管扩张(tubulardilatation)；高磷酸盐血症和/或需要透析。本发明还涵盖本发明的化合物用于治疗和/或预防肾功能不全后遗症的用途，例如肺气肿、心力衰竭、尿毒症、贫血、电解质紊乱(例如高钙血症、低钠血症)以及骨代谢和碳水化合物代谢失调。
此外，本发明的化合物还适用于治疗和/或预防哮喘病症、肺动脉高血压(pah)以及其他形式的肺高血压(ph)，包括与左心室疾病、hiv、镰状细胞贫血、血栓栓塞(cteph)、结节病、copd或肺纤维化相关的肺高血压，慢性梗阻性肺疾病(copd)，急性呼吸窘迫综合症(ards)，急性肺损伤(ali)，α1抗胰蛋白酶缺失(aatd)，肺纤维化，肺气肿(例如由吸烟诱导的肺气肿)以及囊性纤维化(cf)。
本发明所述的化合物还为用于控制以no/cgmp系统紊乱为特征的中枢神经系统疾病的活性物质。更具体地，它们适用于在认知失调后改进感知、注意集中能力、学习能力或记忆力，其中认知失调为例如，特别是与下述状况/疾病/综合征相关的那些认知失调：例如轻度认知损害、年龄相关的学习和记忆力失调、年龄相关的失忆、血管性痴呆、颅脑损伤、中风、中风后发生的痴呆(中风后痴呆)、创伤后颅脑损伤、注意力集中的整体失调、在具有学习和记忆困难的儿童中的注意力集中失调、阿尔茨海默病、路维小体痴呆、伴随额叶退化的痴呆(包括皮克综合征、帕金森病、进行性核性麻痹)、伴随皮质基底节变性的痴呆、肌萎缩性侧索硬化症(als)、亨廷顿舞蹈病、脱髓鞘、多发性硬化、丘脑退化、creutzfeld-jacob痴呆、hiv痴呆、伴随痴呆的精神分裂症或科尔萨科夫精神病。它们还适用于治疗和/或预防中枢神经系统疾病，例如焦虑、紧张和抑郁状态，cns相关的性功能障碍和睡眠失调，以及适用于控制摄取食物、兴奋剂和成瘾性药物的病理性失调。
此外，本发明的化合物还适用于控制脑血流并为用于控制偏头痛的有效试剂。它们还适用于预防和控制脑梗死(脑卒中)后遗症，例如中风、脑缺血和颅脑损伤。本发明的化合物还可用于控制疼痛状态和耳鸣。
此外，本发明的化合物具有抗炎作用并因此可用作用于治疗和/或预防下述疾病的抗炎药：败血症(sirs)、多器官衰竭(mods、mof)、肾脏的炎性疾病、慢性肠炎症(ibd、克罗恩氏病、uc)、胰腺炎、腹膜炎、类风湿性疾病、炎性皮肤疾病和炎性眼病。
此外，本发明的化合物还可用于治疗和/或预防自身免疫性疾病。
本发明的化合物还适用于治疗和/或预防内脏器官——例如肺、心脏、肾脏、骨髓以及特别是肝脏——的纤维化病症，以及皮肤病学纤维化和眼的纤维化病症。在本发明的上下文上，术语“纤维化病症”特别涵盖以下术语：肝纤维化、肝硬化、肺纤维化、心内膜心肌纤维化、肾病、肾小球性肾炎、间质性肾纤维化、由糖尿病导致的纤维化损伤、骨髓纤维化及相似的纤维化病症、硬皮病、硬斑病、瘢痕疙瘩、增生性瘢痕(还包括外科手术后)、痣、糖尿病视网膜病、增生性玻璃体视网膜病及结缔组织病症(例如结节病)。
本发明的化合物还适用于控制术后瘢痕，例如由青光眼手术导致的瘢痕。
本发明的化合物还可在美容上用于老化和角质化的皮肤。
此外，本发明的化合物适用于治疗和/或预防肝炎、肿瘤、骨质疏松症、青光眼和胃轻瘫。
本发明还提供了本发明的化合物用于治疗和/或预防病症——特别是上文提及的病症——的用途。
本发明还提供了本发明的化合物用于治疗和/或预防下列病症的用途：心力衰竭、心绞痛、高血压、肺高血压、缺血、血管病症、肾功能不全、血栓栓塞病症、纤维化病症、动脉硬化、痴呆症和勃起功能障碍。
本发明还提供了在治疗和/或预防下列病症的方法中使用的本发明的化合物：心力衰竭、心绞痛、高血压、肺高血压、缺血、血管病症、肾功能不全、血栓栓塞病症、纤维化病症和动脉硬化。
本发明还提供了本发明的化合物用于制备用于治疗和/或预防病症——特别是上文提及的病症——的药物的用途。
本发明还提供了本发明的化合物用于制备用于治疗和/或预防下列病症的药物的用途：心力衰竭、心绞痛、高血压、肺高血压、缺血、血管病症、肾功能不全、血栓栓塞病症、纤维化病症、动脉硬化、痴呆症和勃起功能障碍。
本发明还提供了一种使用有效量的至少一种本发明的化合物治疗和/或预防病症——特别是上文提及的病症——的方法。
本发明还提供了一种使用有效量的至少一种本发明的化合物治疗和/或预防下列病症的方法：心力衰竭、心绞痛、高血压、肺高血压、缺血、血管病症、肾功能不全、血栓栓塞病症、纤维化病症和动脉硬化。
本发明的化合物可单独使用或——如果需要——与其他活性化合物结合使用。本发明还提供了包含至少一种本发明的化合物和一种以上的其他活性化合物的药物，特别是用于治疗和/或预防上述病症的药物。适用于组合物的活性化合物的优选实例包括：
·有机硝酸酯和no供体，例如硝普钠、硝化甘油、单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯、吗多明(molsidomine)或sin-1，以及吸入性no；
·抑制环磷酸鸟苷(cgmp)分解的化合物，例如磷酸二酯酶(pde)1、2和/或5的抑制剂，特别是pde5抑制剂，例如西地那非、伐地那非和他达拉非；
·抗血栓形成试剂，例如并优选血小板聚集抑制剂、抗凝血剂或血纤维蛋白溶酶物(profibrinolyticsubstance)；
·降血压的活性化合物，例如并优选钙拮抗剂、血管紧张素aii拮抗剂、ace抑制剂、内皮素拮抗剂、肾素抑制剂、α-受体阻断剂、β-受体阻断剂、盐皮质激素受体拮抗剂以及利尿剂；和/或
·改变脂类代谢的活性化合物，例如并优选甲状腺受体激动剂、胆固醇合成抑制剂，例如并优选hmg-coa还原酶抑制剂或鲨烯合成抑制剂、acat抑制剂、cetp抑制剂、mtp抑制剂、ppar-α、ppar-γ和/或ppar-δ激动剂、胆固醇吸收抑制剂、脂肪酶抑制剂、聚合胆汁酸吸附剂、胆汁酸再吸收抑制剂和脂蛋白(a)拮抗剂。
抗血栓形成试剂优选地理解为意指选自血小板聚集抑制剂、抗凝血剂或血纤维蛋白溶酶物的化合物。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与血小板聚集抑制剂联合给药，所述血小板聚集抑制剂例如并优选阿司匹林、氯吡格雷(clopidogrel)、噻氯匹定(ticlopidin)或双嘧达莫(dipyridamole)。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与凝血酶抑制剂联合给药，所述凝血酶抑制剂例如并优选希美加群(ximelagatran)、达比加群(dabigatran)、美拉加群(melagatran)、比伐卢定(bivalirudin)或克赛(clexane)。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与gpiib/iiia拮抗剂联合给药，所述gpiib/iiia拮抗剂例如并优选替罗非班(tirofiban)或阿昔单抗(abciximab)。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与xa因子抑制剂联合给药，所述xa因子抑制剂例如并优选利伐沙班(rivaroxaban，bay59-7939)、依度沙班(du-176b)、阿哌沙班(apixaban)、奥米沙班(otamixaban)、非地沙班(fidexaban)、雷扎沙班(razaxaban)、磺达肝癸钠(fondaparinux)、艾卓肝素(idraparinux)、pmd-3112、ym-150、kfa-1982、emd-503982、mcm-17、mln-1021、dx9065a、dpc906、jtv803、ssr-126512或ssr-128428。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与肝素或低分子量(lmw)肝素衍生物联合给药。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与维生素k拮抗剂联合给药，所述维生素k拮抗剂例如并优选香豆素。
降血压剂优选地理解为意指选自以下的化合物：钙拮抗剂、血管紧张素aii拮抗剂、ace抑制剂、内皮素拮抗剂、肾素抑制剂、α-受体阻断剂、β-受体阻断剂、盐皮质激素受体拮抗剂和利尿剂。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与钙拮抗剂联合给药，所述钙拮抗剂例如并优选硝苯地平(nifedipine)、氨氯地平(amlodipine)、维拉帕米(verapamil)或地尔硫卓(diltiazem)。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与α-1-受体阻断剂联合给药，所述α-1-受体阻断剂例如并优选哌唑嗪(prazosin)。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与β-受体阻断剂联合给药，所述β-受体阻断剂例如并优选普萘洛尔(propranolol)、阿替洛尔(atenolol)、噻吗洛尔(timolol)、吲哚洛尔(pindolol)、阿普洛尔(alprenolol)、氧烯洛尔(oxprenolol)、喷布洛尔(penbutolol)、布拉洛尔(bupranolol)、美替洛尔(metipranolol)、纳多洛尔(nadolol)、甲吲洛尔(mepindolol)、卡拉洛尔(carazalol)、索他洛尔(sotalol)、美托洛尔(metoprolol)、倍他洛尔(betaxolol)、塞利洛尔(celiprolol)、比索洛尔(bisoprolol)、卡替洛尔(carteolol)、艾司洛尔(esmolol)、拉贝洛尔(labetalol)、卡维地洛(carvedilol)、阿达洛尔(adaprolol)、兰地洛尔(landiolol)、奈比洛尔(nebivolol)、依泮洛尔(epanolol)或布新洛尔(bucindolol)。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与血管紧张素aii拮抗剂联合给药，所述血管紧张素aii拮抗剂的优选实例为洛沙坦(losartan)、坎地沙坦(candesartan)、缬沙坦(valsartan)、替米沙坦(telmisartan)或沙坦(embursatan)。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与ace抑制剂联合给药，所述ace抑制剂例如并优选依那普利(enalapril)、卡托普利(captopril)、赖诺普利(lisinopril)、雷米普利(ramipril)、地拉普利(delapril)、福辛普利(fosinopril)、奎诺普利(quinopril)、培哚普利(perindopril)或泉多普利(trandopril)。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与内皮素拮抗剂联合给药，所述内皮素拮抗剂例如并优选波生坦(bosentan)、达卢生坦(darusentan)、安倍生坦(ambrisentan)或西他生坦(sitaxsentan)。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与肾素抑制剂联合给药，所述肾素抑制剂例如并优选阿利吉仑(aliskiren)、spp-600或spp-800。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与盐皮质激素受体拮抗剂联合给药，所述盐皮质激素受体拮抗剂例如并优选螺内酯(spironolactone)或依普利酮(eplerenone)。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与下述物质联合给药：袢利尿剂，例如呋塞米(furosemide)、托拉塞米(torasemide)、布美他尼(bumetanide)和吡咯他尼(piretanide)；保钾利尿剂，例如阿米洛利(amiloride)和氨苯蝶啶(triamterene)；醛固酮拮抗剂，例如螺内酯(spironolactone)、坎利酸钾(potassiumcanrenoate)和依普利酮(eplerenone)；以及噻嗪类利尿剂，例如氢氯噻嗪(hydrochlorothiazide)、氯噻酮(chlorthalidone)、希帕胺(xipamide)和吲达帕胺(indapamide)。
脂类代谢调节剂优选地理解为意指选自以下的化合物：cetp抑制剂、甲状腺受体激动剂、胆固醇合成抑制剂如hmg-coa还原酶抑制剂或鲨烯合成抑制剂、acat抑制剂、mtp抑制剂，ppar-α、ppar-γ和/或ppar-δ激动剂，胆固醇吸收抑制剂、聚合胆汁酸吸附剂、胆汁酸再吸收抑制剂、脂肪酶抑制剂和脂蛋白(a)拮抗剂。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与cetp抑制剂联合给药，所述cetp抑制剂例如并优选达塞曲匹(dalcetrapib)、bay60-5521、安塞曲匹(anacetrapib)或cetp疫苗(ceti-1)。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与甲状腺受体激动剂联合给药，所述甲状腺受体激动剂例如并优选d-甲状腺素、3,5,3'-三碘甲状腺原氨酸(t3)、cgs23425或阿昔替罗(axitirome，cgs26214)。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与他汀类的hmg-coa还原酶抑制剂联合给药，所述他汀类的hmg-coa还原酶抑制剂例如并优选咯伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、普伐他汀(pravastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、罗伐他汀(rosuvastatin)或匹伐他汀(pitavastatin)。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与鲨烯合成抑制剂联合给药，所述鲨烯合成抑制剂例如并优选bms-188494或tak-475。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与acat抑制剂联合给药，所述acat抑制剂例如并优选阿伐麦布(avasimibe)、甲亚油酰胺(melinamide)、帕替麦布(pactimibe)、依鲁麦布(eflucimibe)或smp-797。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与mtp抑制剂联合给药，所述mtp抑制剂例如并优选英普他派(implitapide)、bms-201038、r-103757或jtt-130。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与ppar-γ激动剂联合给药，所述ppar-γ激动剂例如并优选吡格列酮(pioglitazone)或罗格列酮(rosiglitazone)。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与ppar-δ激动剂联合给药，所述ppar-δ激动剂例如并优选gw501516或bay68-5042。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与胆固醇吸收抑制剂联合给药，所述胆固醇吸收抑制剂例如并优选依泽替米贝(ezetimibe)、替奎安(tiqueside)或帕马苷(pamaqueside)。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与脂肪酶抑制剂联合给药，所述脂肪酶抑制剂例如并优选奥利司他(orlistat)。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与聚合胆汁酸吸附剂联合给药，所述聚合胆汁酸吸附剂例如并优选消胆胺(cholestyramine)、考来替泊(colestipol)、考来索文(colesolvam)、考来胶(cholestagel)或考来替兰(colestimide)。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与胆汁酸再吸收抑制剂联合给药，所述胆汁酸再吸收抑制剂例如并优选asbt(＝ibat)抑制剂，例如azd-7806、s-8921、ak-105、bari-1741、sc-435或sc-635。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的化合物与脂蛋白(a)拮抗剂联合给药，所述脂蛋白(a)拮抗剂例如并优选吉卡宾钙(gemcabenecalcium)(ci-1027)或烟酸。
本发明还提供包含至少一种本发明的化合物且通常连同一种以上的惰性的、非毒性的、药学上合适的赋形剂一起形成的药物，以及提供其用于上述目的的用途。
本发明的化合物可具有全身作用和/或局部作用。为此，它们可以合适的方式给药，例如通过口服、肠胃外、肺、鼻、舌下、舌、颊、直肠、真皮、透皮、结膜或耳途径，或作为移植物或支架给药。
本发明的化合物可以适于这些给药途径的给药形式给药。
合适的用于口服给药的给药形式为这样的给药形式：根据现有技术起作用且快速和/或以缓和的方式释放本发明的化合物，并且含有结晶和/或无定形和/或溶解形式的本发明的化合物，例如片剂(未包衣或包衣的片剂，例如具有耐胃液包衣或延缓溶解的包衣或不溶性包衣，所述包衣控制本发明的化合物的释放)、在口腔中迅速崩解的片剂或膜剂/扁片剂(oblate)、膜剂/冻干剂、胶囊剂(例如硬明胶或软明胶胶囊)、糖衣片剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、乳剂、悬液剂、气溶胶或溶液剂。
可进行肠胃外给药，同时避免吸收步骤(例如通过静脉内、动脉内、心内、椎内或腰髓内途径)或包括吸收(例如通过肌内、皮下、皮内、经皮或腹膜内途径)。适用于肠胃外给药的给药形式包括溶液剂、悬液剂、乳剂、冻干剂或无菌粉剂形式的注射和输注用制品。
对于其他给药途径，合适的实例为吸入药物形式(包括粉末吸入剂、喷雾剂)、滴鼻剂、溶液剂或喷雾剂；用于舌、舌下或颊给药的片剂、膜剂/扁片剂或胶囊剂；栓剂、耳部或眼部制剂、阴道胶囊剂、水性悬液剂(洗剂、振荡合剂(shakingmixture))、亲脂性悬液剂、软膏剂、乳膏剂(cream)、透皮治疗系统(例如贴剂)、乳、糊剂、泡沫剂、洒粉剂(sprinklingpower)、移植物或支架。
优选口服或肠胃外给药，特别是口服给药。
可将本发明的化合物转化成所述给药形式。这可用本身已知的方式通过与惰性的、非毒性的、药学上合适的赋形剂混合来进行。这些赋形剂包括载体(例如微晶纤维素、乳糖、甘露醇)、溶剂(例如液体聚乙二醇)、乳化剂和分散剂或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠、聚氧脱水山梨聚糖油酸酯)、粘结剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)、合成和天然的聚合物(例如白蛋白)、稳定剂(例如抗氧化剂，例如抗坏血酸)、着色剂(例如无机颜料，例如铁氧化物)以及调味剂和/或矫味剂。
一般来说，已发现有利的是，对于肠胃外给药，给药量为约0.001至1mg/kg、优选约0.01至0.5mg/kg体重以获得有效的结果。对于口服给药，剂量为约0.001至2mg/kg、优选约0.001至1mg/kg体重。
然而，在一些情况下，可能有必要偏离所述量，特别是随体重、给药途径、对活性成分的个体响应、制剂性质及进行给药的时间或间隔而变化。因此，在一些情况下，小于上述最小量可能是足够的，而在其他情况下，必须超过所述上限。当给予较大量时，可建议将其在一天内分成数个单独剂量。
下列工作实施例说明本发明。
除非另有说明，在下列试验和实施例中的百分比为重量百分比；份数为重量份数。液体/液体溶液的溶剂比例、稀释比例及浓度数值各自基于体积计。
a.实施例
缩写：
abs.绝对
aq.水溶液
calc.计算的
boc叔丁氧基羰基
br.s宽单峰(在nmr中)
cbz苄氧基羰基
δnmr谱中的位移(以ppm表示)
d双峰(nmr耦合模式)
tlc薄层色谱
dci直接化学电离(在ms中)
dd双二重峰(nmr耦合模式)
ddt双双三重峰(nmr耦合模式)
dmf二甲基甲酰胺
dmso二甲基亚砜
ent对映体纯
eq.当量
esi电喷雾电离(在ms中)
et乙基
h小时
hatu(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三唑并
[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐)
hplc高压高效液相色谱
hrms高分辨质谱
conc.浓的
lc-ms液相色谱-质谱联用
m多重峰
me甲基
min分钟
ms质谱
nmr核磁共振谱
pdcl2(dppf)ch2cl21,1'-双(二苯基膦基)二茂铁二氯化钯(ii)/二氯甲
烷复合物
ph苯基
q四重峰(nmr耦合模式)
quint.五重峰(nmr耦合模式)
rac外消旋
rel相对立体化学
rt室温
rt保留时间(在hplc中)
s单峰(nmr耦合模式)
sfc超临界流体色谱
t三重峰(nmr耦合模式)
tbtu(苯并三唑-1-基氧基)双二甲基氨基甲基氟硼酸盐
tfa三氟乙酸
thf四氢呋喃
uv紫外光谱
v/v(溶液的)体积比
hplc、gcms和lc-ms方法:
方法1(lc-ms):
仪器：watersacquitysqduplcsystem；柱：watersacquityuplchsst31.8μ，50x1mm；流动相a：1l水+0.25ml99％浓度的甲酸，流动相b：1l乙腈+0.25ml99％浓度的甲酸；梯度：0.0min90％a→1.2min5％a→2.0min5％a；柱温：50℃；流速：0.40ml/min；uv检测：208–400nm。
方法2(lc-ms):
仪器：watersacquitysqduplcsystem；柱：watersacquityuplchsst31.8μ，50x1mm；流动相a：1l水+0.25ml99％浓度的甲酸，流动相b：1l乙腈+0.25ml99％浓度的甲酸；梯度：0.0min95％a→6.0min5％a→7.5min5％a；柱温：50℃；流速：0.35ml/min；uv检测：210–400nm。
方法3(lc-ms):
仪器：micromassquattropremierwithwatersuplcacquity；柱：thermohypersilgold1.9μ50x1mm；流动相a：1l水+0.5ml50％浓度的甲酸，流动相b：1l乙腈+0.5ml50％浓度的甲酸；梯度：0.0min97％a→0.5min97％a→3.2min5％a→4.0min5％a；柱温：50℃；流速：0.3ml/min；uv检测：210nm。
方法4(lc-ms):
ms仪器：waters(micromass)quattromicro；hplc仪器：agilent1100系列；柱：ymc-triartc183μ50x3mm；流动相a：1l水+0.01mol碳酸铵，流动相b：1l乙腈；梯度：0.0min100％a→2.75min5％a→4.5min5％a；柱温：40℃；流速：1.25ml/min；uv检测：210nm。
方法5(lc-ms):
ms仪器：waters(micromass)qm；hplc仪器：agilent1100系列；柱：agilentzorbaxextend-c183.0x50mm3.5微米；流动相a：1l水+0.01mol碳酸铵，流动相b：1l乙腈；梯度：0.0min98％a→0.2min98％a→3.0min5％a→4.5min5％a；柱温：40℃；流速：1.75ml/min；uv检测：210nm。
方法6(gc-ms):
仪器：micromassgct，gc6890；柱：restekrtx-35，15mx200μmx0.33μm；恒定氦气流速：0.88ml/min；柱温：70℃；入口温度：250℃；梯度：70℃，30℃/min→310℃(保持3min)。
方法7(lc-ms):
仪器：agilentmsquad6150；hplc：agilent1290；柱：watersacquityuplchsst31.8μ50x2.1mm；流动相a：1l水+0.25ml99％浓度的甲酸，流动相b：1l乙腈+0.25ml99％浓度的甲酸；梯度：0.0min90％a→0.3min90％a→1.7min5％a→3.0min5％a；柱温：50℃；流速：1.20ml/min；uv检测：205–305nm。
方法8(gc-ms):
仪器：thermoscientificdsqii，thermoscientifictracegcultra；柱：restekrtx-35ms，15mx200μmx0.33μm；恒定氦气流速：1.20ml/min；柱温：60℃；入口温度：220℃；梯度：60℃，30℃/min→300℃(保持3.33min)。
方法9(lc-ms):
ms仪器：waterssqd；hplc仪器：watersuplc；柱：zorbaxsb-aq(agilent)，50mmx2.1mm，1.8μm；流动相a：水+0.025％甲酸，流动相b：乙腈(ulc)+0.025％甲酸；梯度：0.0min98％a-0.9min25％a–1.0min5％a-1.4min5％a–1.41min98％a–1.5min98％a；柱温：40℃；流速：0,600ml/min；uv检测：dad；210nm。
方法10(制备型hplc):
ms仪器：waters，hplc仪器：waters；柱：watersx-bridgec18，19mmx50mm，5μm，流动相a：水+0.05％氨水，流动相b：梯度乙腈(ulc)；流速：40ml/min；uv检测：dad；210–400nm)。
或：
ms仪器：waters，hplc仪器：waters(柱phenomenexluna5μc18(2)100a，axiatech.50x21.2mm，流动相a：水+0.05％甲酸，流动相b：梯度乙腈(ulc)；流速：40ml/min；uv检测：dad；210–400nm)。
方法11(lc-ms):
ms仪器：thermofisherscientificltq-orbitrap-xl；hplc仪器类型：agilent1200sl；柱：agilent，poroshell120，3x150mm，sb-c182.7μm；流动相a：1l水+0.1％三氟乙酸；流动相b：1l乙腈+0.1％三氟乙酸；梯度：0.0min2％b→1.5min2％b→15.5min95％b→18.0min95％b；柱温：40℃；流速：0.75ml/min；uv检测：210nm。
其他详细内容:
在使用上述方法通过制备型hplc纯化本发明的化合物的情况下(其中洗脱液包含添加剂，例如三氟乙酸、甲酸或氨水)，如果本发明的化合物含有足够的碱性或酸性官能团，则本发明的化合物可以盐的形式获得，例如以三氟乙酸盐、甲酸盐或铵盐的形式获得。通过本领域技术人员已知的多种方法可将这种盐转化为相应的游离碱或游离酸。
此外，脒可以游离化合物的形式存在，或部分地以乙酸盐或乙酸盐溶剂合物的形式存在(这取决于制备过程中是否涉及乙酸)。
在下文描述本发明的合成中间体和工作实施例的情况下，以相应碱或酸的盐的形式指定的任何化合物通常为具有未知的精确化学计量组成的盐，如通过各种制备和/或纯化方法获得的。因此，除非更详细地说明，添加名称和结构式例如“盐酸盐”、“三氟乙酸盐”、“钠盐”或“xhcl”、“xcf3cooh”、“xna+”不应理解为化学计量意义上的这种盐，而应理解为对于其中存在的成盐组分仅具有描述性特征。
这相应地适用于以下情况：如果合成中间体或工作实施例或其盐通过所述制备和/或纯化方法以未知的化学计量组成(如果它们是定义的类型)的溶剂合物(例如水合物)的形式获得。
此外，本发明的仲酰胺可以旋转异构体/异构体混合物的形式存在，特别是在nmr研究中。纯度数字通常基于lc/ms色谱图中相应的峰积分，但也可另外地借助1hnmr谱来确定。如果未指明纯度，则根据lc/ms色谱图中自动峰积分，纯度通常为100％，或纯度未明确测定。
如果指明纯度<100％，则以理论值的％表示的所述收率通常针对纯度进行校正。在含溶剂或受污染的批次中，正常收率可为“>100％”；在这些情况下，收率未针对溶剂或纯度进行校正。
在所有1hnmr谱数据中，化学位移δ以ppm表示。
在以下段落中记录的1hnmr谱中的质子信号的多重性表示在每种情况下观察到的信号形式且不考虑任何更高阶的信号现象。通常，所述化学位移是指所述信号的中心位置。在宽的多重峰的情况下，给出间隔。被溶剂或水遮蔽的信号暂时性地指定或未列出。显著变宽的信号——例如由分子部分的快速转动或由于交换质子导致——同样暂时性地指定(通常称为宽多重峰或宽单峰)或未列出。
熔点和熔点范围——如果说明——未作校正。
其制备未在下文中具体描述的所有反应物或试剂由通常可获得的来源购得。对于其制备同样未在下文中描述且其不能购得或不能由通常可获得的来源获得的所有其他反应物或试剂，参考其中记载了其制备的公开文献。
起始化合物和中间体:
实施例1a
5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-胺
首先，将58g(340.03mmol)2-氯-5-氟-6-甲基烟腈(其制备记载于wo2007/041052，实施例u-2，第80页)加入1,2-乙二醇(580ml)中，然后加入水合肼(24.81ml)和56.09ml(340.03mmol)n,n-二异丙基乙胺。将混合物在80℃下搅拌16h，然后在120℃下搅拌6h。冷却至室温后，加入水(2.5l)和乙酸乙酯(2.5l)，并抽滤出所得固体。将所得固体在减压下干燥。得到28.4g(理论值的47％)目标化合物。
lc-ms(方法4)：rt＝1.77min
ms(esipos)：m/z＝167[m+h]+
实施例2a
5-氟-3-碘-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶
首先，将28g(168.5mmol)来自实施例1a的5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-胺加入1.32lthf中，并将混合物冷却至0℃。然后缓慢加入41.45ml(337.03mmol)三氟化硼乙醚复合物。将反应混合物冷却至-10℃。然后缓慢加入25.66g(219.07mmol)亚硝酸异戊酯在166mlthf中的溶液，随后将混合物继续搅拌30min。然后将反应溶液浓缩至约其体积的三分之一。然后加入988ml丙酮，并将溶液冷却至0℃。向该溶液滴加32.84g(219.07mmol)碘化钠在412ml丙酮中的溶液，然后将混合物在室温下搅拌2h。将反应混合物倾入5l冰水中，并且每次用750ml乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机相用750ml饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥然后在减压下浓缩。使用硅胶纯化粗产物(硅胶，流动相：环己烷/乙酸乙酯，梯度9:1至1:1)。得到14.90g(理论值的32％)标题化合物。
lc-ms(方法1)：rt＝0.84min
ms(esipos)：m/z＝278[m+h]+
实施例3a
1-(2,3-二氟苄基)-5-氟-3-碘-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶
首先，将2.60g(9.37mmol)来自实施例2a的5-氟-3-碘-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶加入35mldmf中。然后加入3.67g(11.26mmol)碳酸铯和1.94g(9.37mmol)1-(溴甲基)-2,3-二氟苯在10mldmf中的溶液，随后将混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物加入200ml水中并用乙酸乙酯萃取两次。将合并的有机相用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残留物通过柱色谱进行纯化(硅胶，流动相：石油醚/乙酸乙酯＝10/1)，并将产物馏分浓缩。通过制备型hplc进一步纯化(柱：sunfirec18，5μm，250x20mm；流动相：12％水+85％甲醇+3％1％浓度的tfa水溶液；流速：25ml/min；温度：40℃；波长：210nm)。得到2.67g(理论值的71％)标题化合物。
lc-ms(方法1)：rt＝1.29min
ms(esipos)：m/z＝404[m+h]+
类似于实施例3a，表1a中所示的示例性化合物通过以下方法制备：将来自实施例2a的5-氟-3-碘-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶与1-(溴甲基)-2-氟苯、2-(溴甲基)-1,3,4-三氟苯或2-(氯甲基)-3-氟吡啶盐酸盐(1.1-1.5当量)和碳酸铯(1.2-2当量)在dmf中在所述反应条件(反应时间：2-72h；温度：室温至60℃)下反应。
反应混合物的示例性后处理：
方法a：将反应混合物加入水中，然后在室温下搅拌约1h。过滤出所形成的固体，用水洗涤并在高真空下干燥。
方法b：或者，将反应混合物加入水中并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机相用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残留物通过柱色谱在硅胶上进行纯化(流动相：石油醚/乙酸乙酯或二氯甲烷/甲醇)。
方法c：或者，将反应混合物用乙腈稀释并通过制备型hplc进行纯化(rp18柱，流动相：乙腈/水(加入0.1％tfa或0.05％甲酸)梯度)。
表1a：
1)该原料已记载于wo2013/104703(实施例50a)。
实施例7a
1-(2,3-二氟苄基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲腈
首先，在已通过加热干燥的烧瓶中，将2.47g(6.13mmol)来自实施例3a的1-(2,3-二氟苄基)-5-氟-3-碘-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶和0.576g(6.43mmol)氰化铜(i)的混合物加入12.1ml无水dmso中，并将混合物在150℃下搅拌3h。将乙酸乙酯加入冷却的反应溶液中，并将混合物用半饱和的氯化铵水溶液和浓氨水溶液(3/1)的混合物洗涤三次。将有机相用硫酸钠干燥，过滤并通过蒸发浓缩。将粗产物通过快速色谱法进行纯化(硅胶，流动相：环己烷/乙酸乙酯梯度：15/1至10/1；然后二氯甲烷/甲醇：10/1)。得到780mg目标化合物(理论值的42％)。
lc-ms(方法1)：rt＝1.19min
ms(esipos)：m/z＝303[m+h]+
1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝2.65(d,3h),5.87(s,2h),7.10-7.25(m,2h),7.39-7.48(m,1h),8.41(d,1h)。
类似于实施例7a，表2a中所示的示例性化合物通过下列方法制备：将合适的碘化物与氰化铜(i)(1.1-1.5当量)在dmso中在所述反应条件下(反应时间:1–5h；温度:150℃)反应。
反应混合物的示例性后处理：
方法a：在冷却后，将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将混合物用半饱和的氯化铵水溶液和浓氨水溶液(3/1)的混合物洗涤三次。将有机相用硫酸钠干燥并过滤，并在减压下除去溶剂。将粗产物通过柱色谱进行纯化(硅胶，流动相：环己烷/乙酸乙酯梯度：或二氯甲烷/甲醇梯度)。
方法b：或者，将反应混合物用乙腈稀释并通过制备型hplc进行纯化(rp18柱，流动相：乙腈/水(加入0.1％tfa或0.05％甲酸)梯度)。
表2a:
1)该原料已记载于wo2013/104703(实施例51a)。
实施例11a
1-(2,3-二氟苄基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲脒
首先，将960mg(3.18mmol)来自实施例7a的1-(2,3-二氟苄基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲腈加入9.47ml甲醇中。加入0.69ml(3.18mmol)甲醇钠的甲醇溶液，随后将混合物在室温下搅拌1h。然后加入另外的10ml甲醇，随后将反应混合物在60℃下搅拌1h。加入204mg(3.81mmol)氯化铵和0.71ml(12.39mmol)乙酸，并将反应混合物在回流下搅拌7h。在减压下除去溶剂，并将残留物在室温下用38ml的1n氢氧化钠水溶液搅拌1h。然后滤出沉淀并用水洗涤。得到1.0g目标化合物(理论值的90％，纯度90％)。
lc-ms(方法1)：rt＝0.68min
ms(esipos)：m/z＝320[m+h]+
1h-nmr(400mhz,dmso-d6)：δ[ppm]＝2.60(d,3h),5.77(s,2h),6.62(br.s,3h),6.91-6.98(m,1h),7.11-7.20(m,1h),7.34-7.44(m,1h),8.29(d,1h)。
类似于实施例11a，表3a中所示的示例性化合物通过下列方法制备：将合适的腈化物与甲醇钠(1.0-1.2当量)的甲醇溶液反应，随后与氯化铵(1.2-1.5当量)和乙酸(3.5-5当量)在所述反应条件(在加入氯化铵和乙酸后的反应时间：5-24h；温度：回流)下反应。
反应混合物的示例性后处理：
蒸发溶剂并将残留物在室温下用1n氢氧化钠水溶液搅拌0.5-2h。然后滤出沉淀，用水洗涤，随后干燥。
如果部分合适的话，所得目标化合物可以乙酸盐或乙酸盐溶剂合物的形式存在。
表3a:
1)该原料已以乙酸盐的形式记载于wo2013/104703(实施例52a)。
实施例15a
5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲脒乙酸盐
该化合物的制备记载于wo2013/004785，实施例14a，第69-70页。
实施例16a
6-氯-1-(2-氟苄基)-1h-吲唑-3-甲脒乙酸盐
该化合物的制备记载于wo2013/104598，实施例54a，第97-98页。
实施例17a
4-氨基-2-[1-(2,3-二氟苄基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5,5-二甲基-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
首先，将2.34g(6.67mmol；纯度90％)来自实施例11a的1-(2,3-二氟苄基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲脒加入50.5ml叔丁醇中。然后加入1.33g(8.00mmol)3,3-二氰基新戊酸甲酯，随后将混合物在回流下搅拌6h。加入另外的8ml叔丁醇，然后将混合物在回流下加热过夜。冷却至室温后，加入水并将反应混合物在室温下搅拌30min。滤出形成的沉淀并用水洗涤。在高真空下干燥固体。得到3.25g(理论值的99％；纯度：92％)标题化合物。
lc-ms(方法1):rt＝1.03min
ms(esipos):m/z＝454[m+h]+
类似于实施例17a，表4a中所示的示例性化合物通过下列方法制备：将合适的甲脒(脒)与3,3-二氰基新戊酸甲酯(1.1-1.5当量)在叔丁醇中[将0.2-1.4当量的叔丁醇钾加入存在形式为乙酸盐或乙酸盐溶剂合物的脒中]在所述反应条件下(反应时间:4-24h)反应。
反应混合物的示例性后处理：
将水加入反应混合物中，并将混合物在室温下搅拌30min。滤出形成的沉淀并用水洗涤。
表4a:
1)该原料已记载于wo2013/104703(实施例55a)。
实施例23a
3,3-二氰基-2-(三氟甲基)丙烯酸甲酯
该化合物的合成记载于journaloffluorinechemistry1991，第51卷，3，第323-334页。
实施例24a
2-(二氰基甲基)-3,3,3-三氟-2-甲基丙酸甲酯
将3.00g(14.70mmol)的实施例23a溶于四氢呋喃(30ml)中，并将溶液冷却至0℃。然后滴加7.35ml(22.05mmol)甲基氯化镁(3m于thf中)，使得温度不超过5℃。在结束加入后，将混合物继续搅拌10min。然后将1n盐酸水溶液加入该混合物中，随后用乙酸乙酯萃取混合物。分离相并用乙酸乙酯萃取水相两次以上。将合并的有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。然后粗产物通过柱色谱进行纯化(硅胶，流动相：环己烷，然后环己烷:乙酸乙酯9:1(v:v))。浓缩得到3.24g(理论值的63％)标题化合物。
1h-nmr(400mhz,cdcl3):δ[ppm]＝1.81(s,3h),3.95(s,3h),4.48(s,1h)。
实施例25a
rac-4-氨基-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
首先，将23.0g(66.02mmol)来自实施例15a的5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲脒乙酸盐加入叔丁醇(400ml)中，并加入13.43g(119.68mmol)叔丁醇钾。随后，加入21.08g(95.75mmol)来自实施例24a的2-(二氰基甲基)-3,3,3-三氟-2-甲基丙酸甲酯在叔丁醇(100ml)中的溶液，并将混合物加热回流过夜。冷却至室温后，加入水并将反应混合物在室温下继续搅拌30min。滤出形成的沉淀并用水和少量乙醚洗涤。在高真空下干燥固体。得到16.1g标题化合物(理论值的51％)。
lc-ms(方法1):rt＝0.95min；
ms(esipos):m/z＝477[m+h]+
1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.72(s,3h),5.96(s,2h),7.10(br.s,2h),7.42-7.48(m,1h),7.75-7.80(m,1h),8.27(d,1h),8.68(dd,1h),8.86(dd,1h),11.60(br.s,1h)。
类似于实施例25a，表5a中所示的示例性化合物表5a中所示的示例性化合物通过下列方法制备：将合适的甲脒(脒)与2-(二氰基甲基)-3,3,3-三氟-2-甲基丙酸甲酯(1.1-1.5当量)在叔丁醇中[将0.2-1.4当量的叔丁醇钾加入存在形式为乙酸盐或乙酸盐溶剂合物的脒中]在所述反应条件下(反应时间:0.5-24h)反应。
或者，反应可在微波[0.5-10h，100℃]中进行。
反应混合物的示例性后处理：
加入水，并将反应混合物在室温下搅拌30min。滤出形成的沉淀并用水洗涤。
表5a:
实施例30a
2-[1-(2,3-二氟苄基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4-碘-5,5-二甲基-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
首先，将3.25g(6.61mmol；纯度92％)来自实施例17a的4-氨基-2-[1-(2,3-二氟苄基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5,5-二甲基-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮加入64ml二氧杂环己烷中，加入4.42ml(33.04mmol)亚硝酸异戊酯和2.66ml(33.04mmol)二碘甲烷，然后将混合物在85℃下加热3h。在冷却后，将混合物在减压下浓缩，并将残留物在硅胶上进行色谱纯化(流动相：二氯甲烷/甲醇梯度)。在减压下除去溶剂，得到2.32g(理论值的51％，纯度82％)标题化合物。
lc-ms(方法1):rt＝1.34min
ms(esipos):m/z＝565[m+h]+
类似于实施例30a，表6a中所示的示例性化合物通过下列方法制备：将合适的苯胺与二碘甲烷(3-18当量)和亚硝酸异戊酯(3-10当量)在二氧杂环己烷中在所述反应条件下(温度:85℃；反应时间:2-10h)反应。
反应混合物的示例性后处理：
将反应混合物浓缩[如果适合的话，在水和有机溶剂之间分配然后浓缩]，并将残留物在硅胶上进行色谱纯化(流动相：二氯甲烷/甲醇或环己烷/乙酸乙酯梯度)。任选地，通过制备型hplc进一步纯化[柱:sunfirec18,5μm,100x30mm；流动相：水/乙腈+0.2％浓度的甲酸]。
表6a:
1)该原料已记载于wo2013/104703(实施例56a)。
实施例36a
rac-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-4-碘-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
将798μl(5.93mmol)亚硝酸异戊酯和286μl(3.56mmol)二碘甲烷加入565mg(1.19mmol)来自实施例25a的rac-4-氨基-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮在15ml二氧杂环己烷的溶液中，将混合物加热至85℃持续4h。在冷却后，将混合物在减压下浓缩，将残留物溶于二氯甲烷中，加入硅藻土，然后将混合物在减压下浓缩。然后将吸附于硅藻土上的粗化合物通过柱色谱进行纯化(硅胶，流动相：环己烷/乙酸乙酯梯度)。浓缩得到297mg(理论值的42％)标题化合物。
lc-ms(方法1):rt＝1.19min；
ms(esipos):m/z＝588[m+h]+
1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.81(s,3h),6.04(s,2h),7.43-7.47(m,1h),7.77-7.82(m,1h),8.26(d,1h),8.47(dd,1h),8.76(dd,1h),12.41(br.s,1h)。
类似于实施例36a，表7a中所示的示例性化合物通过下列方法制备：将合适的苯胺与二碘甲烷(4-18当量)和亚硝酸异戊酯(4-12当量)在二氧杂环己烷中在所述反应条件下(温度:85℃；反应时间:2-10h)反应。
反应混合物的示例性后处理：
将反应混合物浓缩并将残留物在硅胶上进行色谱纯化(流动相：二氯甲烷/甲醇梯度)。任选地，通过制备型hplc进一步纯化[柱:kinetexc18,5μm,100x300mm；流动相：水/乙腈35:65]。
表7a:
实施例41a
2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙腈
首先，将8.75g(178.6mmol)氰化钠加入132ml2n氨在甲醇中的溶液中。在室温下加入15.0g(159.5mmol)1,3-二氟丙酮和9.55g(178.6mmol)氯化铵。将悬浮液在70℃的油浴温度下搅拌2h。将300ml乙醚加入冷却的反应混合物中，将混合物搅拌10min并滤出固体。将滤液在减压下浓缩(50℃，70mbar)。得到19.2g(理论值的100％)目标化合物。将产物进一步反应而无需进一步纯化。
gc-ms(方法8):rt＝1.78min
ms(espos):m/z＝121(m+h)+
实施例42a
(2-氰基-1,3-二氟丙-2-基)氨基甲酸苄酯
首先，将5.0g(41.6mmol)来自实施例41a的2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙腈加入14.5ml(83.3mmol)n,n-二异丙基乙胺中。在室温下，缓慢滴加10.65g(62.5mmol)氯甲酸苄酯，并将混合物在室温下搅拌3天。将反应混合物用25ml二氯甲烷稀释，并在0℃下将其滴加至12.9g(124.9mmol)n-(2-氨基乙基)乙烷-1,2-二胺在225ml二氯甲烷中的溶液中，并将混合物搅拌10min。然后在室温下滴加200ml饱和氯化铵溶液。分离相并用二氯甲烷萃取水相三次。浓缩合并的有机相。然后将粗产物在硅胶上进行色谱纯化(流动相：环己烷：乙酸乙酯梯度)。得到4.40g(理论值的42％)标题化合物。
lc-ms(方法1):rt＝0.92min
ms(espos):m/z＝255(m+h)+
实施例43a
[1-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙-2-基]氨基甲酸苄酯
在室温下，首先将5.00g(16.32mmol)来自实施例42a的[1-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙-2-基]氨基甲酸苄酯加入80ml无水乙醇中。在室温下，加入3.09g(81.62mmol)硼氢化钠，并将混合物在室温下搅拌2h。在冰冷却时，非常缓慢地滴加250ml饱和的氯化铵溶液。然后加入1n的盐酸水溶液直至ph为4(约100ml)。然后用饱和氯化钠水溶液使反应混合物饱和，并用乙酸乙酯萃取六次。将合并的有机相用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤一次，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将起始化合物在-18℃下储存。得到4.16g(理论值的83％；纯度84％)标题化合物。
lc-ms(方法5):rt＝1.99min
ms(espos):m/z＝259(m+h)+
实施例44a
3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺
首先，将4.16g(13.53mmol)来自实施例43a的[1-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙-2-基]氨基甲酸苄酯加入12ml1-甲基-2-吡咯烷酮中，并在氩气下加入216mg(0.20mmol)10％活性炭负载钯。将反应混合物在室温和标准压力下进行氢化过夜。用硅藻土过滤反应混合物，然后用2.5ml1-甲基-2-吡咯烷酮洗涤过滤器。将合并的溶液直接用于下一反应。
目标化合物的浓度为1.07mol/l(133mg/ml)。
工作实施例:
实施例1
4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[1-(2,3-二氟苄基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5,5-二甲基-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
将144mg(1.16mmol)来自实施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)中的溶液[假定浓度：1.07mol/l]加入200mg(0.29mmol；纯度82％)来自实施例30a的2-[1-(2,3-二氟苄基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4-碘-5,5-二甲基-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮中，并将混合物用0.5ml1-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)稀释。将混合物在130℃下在微波中搅拌3.5h。加入水/乙腈/tfa，并将反应溶液用制备型hplc纯化(rp18柱，流动相：乙腈/水(加入0.1％tfa)梯度)。通过蒸发浓缩产物馏分。将所得残留物溶于二氯甲烷和少量甲醇中，并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次。将合并的水相用二氯甲烷萃取两次。将合并的有机相用硫酸钠干燥，过滤并通过蒸发浓缩。得到22mg(理论值的12％；纯度92％)标题化合物。
lc-ms(方法1):rt＝0.82min
ms(esipos):m/z＝561[m+h]+
1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.36(s,6h),1.84(br.s,2h),2.62(d,3h),3.73(d,2h),4.18-4.48(m,4h),5.82(s,2h),6.49(br.s,1h),6.99-7.06(m,1h),7.11-7.20(m,1h),7.34-7.43(m,1h),8.55(d,1h),11.08(br.s,1h)。
实施例2
4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5,5-二甲基-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
将273mg(2.20mmol)来自实施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液[假定浓度：1.07mol/l]加入300mg(0.55mmol)2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4-碘-5,5-二甲基-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮中，并将混合物用2.7ml1-甲基-2-吡咯烷酮稀释。将混合物在130℃下搅拌7h。将反应溶液通过制备型hplc直接纯化(rp18柱，流动相：甲醇/水(加入0.1％tfa)梯度)。通过蒸发浓缩产物馏分。通过制备型hplc进一步纯化[kinetexc18，5μm，100x21.2mm；流动相：水/乙腈/1％甲酸水溶液＝60/35/5，等度]。得到40mg(理论值的12％；纯度86％)标题化合物。
lc-ms(方法7):rt＝1.06min
ms(esipos):m/z＝543[m+h]+
1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.38(s,6h),2.62(d,3h),3.76(d,2h),4.21-4.31(m,1h),4.36(d,2h),4.47(d,1h),5.78(s,2h),6.56(t,1h),7.11-7.27(m,3h),7.32-7.40(m,1h),8.53(d,1h),11.07(s,1h)。
实施例3
4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-6-甲基-1-(2,3,6-三氟苄基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5,5-二甲基-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
将256mg(2.06mmol)来自实施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液[假定浓度:1.07mol/l]加入300mg(0.51mmol)来自实施例32a的2-[5-氟-6-甲基-1-(2,3,6-三氟苄基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4-碘-5,5-二甲基-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮中，并将混合物用2.5ml1-甲基-2-吡咯烷酮稀释。将混合物在130℃下搅拌4h。将反应溶液通过制备型hplc直接纯化(rp18柱，流动相：甲醇/水(加入0.1％tfa)梯度)。将产物馏分通过蒸发浓缩。将所得残留物溶于二氯甲烷和少量甲醇中，并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次。将合并的水相用二氯甲烷萃取两次。将合并的有机相用硫酸钠干燥，过滤并通过蒸发浓缩。得到20mg(理论值的6％；纯度86％)标题化合物。
lc-ms(方法5):rt＝2.55min
ms(esipos):m/z＝579[m+h]+
1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.37(s,6h),1.85(br.s.,2h),2.63(d,3h),3.73(d,2h),4.19(d,1h),4.31(d,2h),4.43(d,1h),5.80(s,2h),6.55(t,1h),7.18(ddt,1h),7.54(ddt,1h),8.52(d,1h),11.05(s,1h)。
实施例4
4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5,5-二甲基-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
将169mg(1.36mmol)来自实施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液[假定浓度：1.07mol/l]加入200mg(0.34mmol)来自实施例33a的2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-4-碘-5,5-二甲基-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮中，并将混合物用0.4ml1-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)稀释。将混合物在130℃下在微波中搅拌5h。加入水/乙腈/tfa，并将反应溶液通过制备型hplc纯化(rp18柱,流动相：乙腈/水(加入0.1％tfa)梯度)。通过蒸发浓缩产物馏分。将所得残留物溶于二氯甲烷和少量甲醇中，并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次。将合并的水相用二氯甲烷萃取两次。将合并的有机相用硫酸钠干燥，过滤并通过蒸发浓缩。得到19mg(理论值的10％)标题化合物。
lc-ms(方法1):rt＝0.72min
ms(esipos):m/z＝544[m+h]+
1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.37(s,6h),1.83(br.s,2h),2.60(d,3h),3.75(d,2h),4.17-4.47(m,4h),5.91(s,2h),6.51(t,1h),7.40-7.47(m,1h),7.72-7.80(m,1h),8.28(d,1h),8.53(d,1h),11.02(br.s,1h)。
实施例5
4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5,5-二甲基-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
将348mg(2.80mmol)来自实施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)中的溶液[假定浓度:1.07mol/l]加入450mg(0.70mmol；纯度83％)来自实施例34a的2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-4-碘-5,5-二甲基-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮中，并将混合物用1.2ml1-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)稀释。将混合物在130℃下在微波中搅拌4h。加入水/乙腈/tfa，并将反应溶液通过制备型hplc纯化(rp18柱,流动相：乙腈/水(加入0.1％tfa)梯度)。通过蒸发浓缩产物馏分。将所得残留物溶于二氯甲烷和少量甲醇中，并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次。将合并的水相用二氯甲烷萃取两次。将合并的有机相用硫酸钠干燥，过滤并通过蒸发浓缩。得到43mg(理论值的12％；纯度97％)标题化合物。
lc-ms(方法1):rt＝0.66min
ms(esipos):m/z＝530[m+h]+
1h-nmr(500mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.39(s,6h),1.85(br.s,2h),3.76(d,2h),4.20-4.46(m,4h),5.96(s,2h),6.53(t,1h),7.40-7.46(m,1h),7.73-7.80(m,1h),8.25-9.29(m,1h),8.63-8.69(m,2h),11.05(br.s,1h)。
实施例6
rac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[1-(2,3-二氟苄基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
将141mg(1.14mmol)来自实施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液[假定浓度:1.07mol/l]加入200mg(0.29mmol；纯度88％)来自实施例39a的rac-2-[1-(2,3-二氟苄基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4-碘-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮中，并将混合物用0.4ml1-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)稀释。将混合物在130℃下在微波中搅拌4.5h。加入水/乙腈/tfa，并将反应溶液通过制备型hplc纯化(rp18柱,流动相：乙腈/水(加入0.1％tfa)梯度)。通过蒸发浓缩产物馏分。将所得残留物溶于二氯甲烷和少量甲醇中，并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次。将合并的水相用二氯甲烷萃取两次。将合并的有机相用硫酸钠干燥，过滤并通过蒸发浓缩。得到57mg(理论值的31％；纯度95％)标题化合物。
lc-ms(方法1):rt＝0.91min
ms(esipos):m/z＝615[m+h]+
1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.66(s,3h),1.87(br.s,2h),2.61(d,3h),3.59-3.68(m,1h),3.73-3.84(m,1h),4.21(d,1h),4.28-4.36(m,2h),4.40-4.47(m,1h),5.83(s,2h),6.24(br.s,1h),6.97-7.05(m,1h),7.09-7.22(m,1h),7.32-7.44(m,1h),8.51(d,1h),11.69(br.s,1h)。
实施例7
ent-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[1-(2,3-二氟苄基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(对映异构体a)
将50mgrac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[1-(2,3-二氟苄基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(实施例6)在手性相上分离成对映异构体[柱:daicelchiralcelox-h,5μm,250x20mm,流动相：80％异己烷,20％乙醇+0.2％二乙胺,流速15ml/min；40℃,检测:220nm]。将产物馏分收集于干冰上，通过蒸发浓缩，然后冻干。
对映异构体a:14mg(纯度99％,99％ee)
rt＝5.36min[daicelchiralcelox-h,5μm,250x4.6mm；流动相：80％异己烷,20％乙醇+0.2％二乙胺；流速1.0ml/min；40℃；检测:220nm]。
实施例8
ent-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[1-(2,3-二氟苄基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(对映异构体b)
将50mgrac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[1-(2,3-二氟苄基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(实施例6)在手性相上分离成对映异构体[柱:daicelchiralcelox-h,5μm,250x20mm,流动相：80％异己烷,20％乙醇+0.2％二乙胺,流速15ml/min；40℃,检测:220nm]。将产物馏分收集于干冰上，通过蒸发浓缩，然后冻干。
对映异构体b:16mg(纯度99％,99％ee)
rt＝8.31min[daicelchiralcelox-h,5μm,250x4.6mm；流动相：80％异己烷,20％乙醇+0.2％二乙胺；流速1.0ml/min；40℃；检测:220nm]。
实施例9
rac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
将165mg(1.33mmol)来自实施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液[假定浓度:1.07mol/l]加入200mg(0.33mmol)来自实施例37a的rac-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4-碘-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮中，并将混合物用1.5ml1-甲基-2-吡咯烷酮稀释。将混合物在130℃下在微波中搅拌5h。将反应溶液通过制备型hplc直接纯化(rp18柱,流动相：甲醇/水(加入0.1％tfa)梯度)。将产物馏分从甲醇中分离并用二氯甲烷/甲醇(10/1)的混合物重复萃取。将合并的有机相用饱和碳酸氢钠水溶液和氯化钠洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并通过蒸发浓缩。将残留物通过制备型hplc再次纯化(rp18柱,流动相：甲醇/水(加入0.1％tfa)梯度)。浓缩产物馏分。得到37mg(理论值的16％；纯度85％)标题化合物。
lc-ms(方法7):rt＝1.11min
ms(esipos):m/z＝597[m+h]+
1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.75(s,3h),1.95(br.s,2h),2.63(d,3h),3.66(dd,1h),3.86(dd,1h),4.22(d,1h),4.30-4.36(m,2h),4.44(dd,1h),5.80(s,2h),6.52(t,1h),7.09-7.27(m,3h),7.32-7.41(m,1h),8.50(d,1h),11.72(br.s,1h)。
实施例10
ent-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(对映异构体a)
将36mgrac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(实施例9)在手性相上分离成对映异构体[柱:daicelchiralceloz-h,5μm,250x20mm,流动相：80％异己烷,20％乙醇,流速15ml/min；35℃,检测:220nm]。
对映异构体a:7mg(纯度>99％,>99％ee)
rt＝4.15min[daicelchiralceloz-h,5μm,250x4.6mm；流动相：70％异己烷,30％乙醇+0.2％二乙胺；流速1.0ml/min；30℃；检测:270nm]。
实施例11
ent-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(对映异构体b)
将36mgrac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-1-(2-氟苄基)-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(实施例9)在手性相上分离成对映异构体[柱:daicelchiralceloz-h,5μm,250x20mm,流动相：80％异己烷,20％乙醇,流速15ml/min；35℃,检测:220nm]。
对映异构体b:11mg(纯度95％,>99％ee)
rt＝5.60min[daicelchiralceloz-h,5μm,250x4.6mm；流动相：70％异己烷,30％乙醇+0.2％二乙胺；流速1.0ml/min；30℃；检测:270nm]。
实施例12
rac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-6-甲基-1-(2,3,6-三氟苄基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
将156mg(1.26mmol)来自实施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液[假定浓度:1.07mol/l]加入200mg(0.31mmol)来自实施例38a的rac-2-[5-氟-6-甲基-1-(2,3,6-三氟苄基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4-碘-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮中，并将混合物用1.5ml1-甲基-2-吡咯烷酮稀释。将混合物在130℃下在微波中搅拌5h。将反应溶液通过制备型hplc直接纯化(rp18柱,流动相：甲醇/水(加入0.1％tfa)梯度)。浓缩产物馏分，用二氯甲烷/甲醇(10/1)的混合物稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液和氯化钠洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并通过蒸发浓缩。得到84mg(理论值的35％；纯度82％)标题化合物。
lc-ms(方法1):rt＝0.86min
ms(esipos):m/z＝633[m+h]+
1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.74(s,3h),1.86(br.s,2h),2.64(d,3h),3.63(dd,1h),3.83(dd,1h),4.20(d,1h),4.27-4.35(m,2h),4.42(dd,1h),5.82(s,2h),6.53(t,1h),7.19(ddt,1h),7.54(ddt,1h),8.48(d,1h),11.71(br.s,1h)。
实施例13
ent-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-6-甲基-1-(2,3,6-三氟苄基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(对映异构体a)
将84mgrac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-6-甲基-1-(2,3,6-三氟苄基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(实施例12)在手性相上分离成对映异构体[柱:daicelchiralceloz-h,5μm,250x20mm,流动相：80％异己烷,20％乙醇,流速15ml/min；35℃,检测:220nm]。
对映异构体a:18mg(纯度>99％,>99％ee)
rt＝4.27min[daicelchiralceloz-h,5μm,250x4.6mm；流动相：70％异己烷,30％乙醇+0.2％二乙胺；流速1.0ml/min；30℃；检测:270nm]。
实施例14
ent-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-6-甲基-1-(2,3,6-三氟苄基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(对映异构体b)
将84mgrac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-6-甲基-1-(2,3,6-三氟苄基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(实施例12)在手性相上分离成对映异构体[柱:daicelchiralceloz-h,5μm,250x20mm,流动相：80％异己烷,20％乙醇,流速15ml/min；35℃,检测:220nm]。
对映异构体b:19mg(纯度>99％,约98％ee)
rt＝4.99min[daicelchiralceloz-h,5μm,250x4.6mm；流动相：70％异己烷,30％乙醇+0.2％二乙胺；流速1.0ml/min；30℃；检测:270nm]。
实施例15
rac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
将132mg(1.06mmol)来自实施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液[假定浓度:1.07mol/l]加入200mg(0.27mmol；纯度80％)来自实施例40a的rac-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-4-碘-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮中，并将混合物用0.4ml1-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)稀释。将混合物在130℃下在微波中搅拌4.5h。加入水/乙腈/tfa，并将反应溶液通过制备型hplc纯化(rp18柱,流动相：乙腈/水(加入0.1％tfa)梯度)。通过蒸发浓缩产物馏分。将所得残留物溶于二氯甲烷和少量甲醇中，并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次。将合并的水相用二氯甲烷萃取两次。将合并的有机相用硫酸钠干燥，过滤并通过蒸发浓缩。将残留物通过薄层色谱再次纯化(流动相：二氯甲烷/2n氨于甲醇中＝10/1)。得到37mg(理论值的23％)标题化合物。
lc-ms(方法1):rt＝0.81min
ms(esipos):m/z＝598[m+h]+
1h-nmr(500mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.73(s,3h),1.88(br.s,2h),2.61(d,3h),3.63-3.70(m,1h),3.82-3.88(m,1h),4.22(d,1h),4.30-4.36(m,2h),4.40-4.46(m,1h),5.94(s,2h),6.49(t,1h),7.40-7.46(m,1h),7.73-7.79(m,1h),8.28(d,1h),8.50(d,1h),11.68(br.s,1h)。
实施例16
ent-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(对映异构体a)
将32mgrac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(实施例15)在手性相上分离成对映异构体[柱:daicelchiralpakaz-h，5μm，250x30mm，流动相：70％异己烷，30％乙醇+0.2％二乙胺，流速30ml/min；40℃，检测:220nm]。将产物馏分收集于干冰上，通过蒸发浓缩，然后冻干。
对映异构体a:14mg(纯度99％，99％ee)
rt＝3.97min[daicelchiralpakaz-h，5μm，250x4.6mm；流动相：30％异己烷，70％乙醇+0.2％二乙胺；流速1.0ml/min；40℃；检测:220nm]。
实施例17
ent-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(对映异构体b)
将32mgrac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(实施例15)在手性相上分离成对映异构体[柱:daicelchiralpakaz-h，5μm，250x30mm，流动相：70％异己烷，30％乙醇+0.2％二乙胺，流速30ml/min；40℃，检测:220nm]。将产物馏分收集于干冰上，通过蒸发浓缩，然后冻干。
对映异构体b:15mg(纯度95％，98％ee)
rt＝6.33min[daicelchiralpakaz-h，5μm，250x4.6mm；流动相：30％异己烷，70％乙醇+0.2％二乙胺；流速1.0ml/min；40℃；检测:220nm]。
实施例18
rac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
将148mg(1.20mmol)来自实施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液[假定浓度:1.07mol/l]加入200mg(0.34mmol)来自实施例36a的rac-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-4-碘-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮中，并将混合物用0.4ml1-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)稀释。将混合物在130℃下在微波中搅拌4.5h。加入水/乙腈/tfa，并将反应溶液通过制备型hplc纯化(rp18柱，流动相：乙腈/水(加入0.1％tfa)梯度)。通过蒸发浓缩产物馏分。将所得残留物溶于二氯甲烷和少量甲醇中，并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次。将合并的水相用二氯甲烷萃取两次。将合并的有机相用硫酸钠干燥，过滤并通过蒸发浓缩。得到49mg(理论值的25％；纯度约92％)标题化合物。
lc-ms(方法1):rt＝0.77min
ms(esipos):m/z＝584[m+h]+
1h-nmr(500mhz，dmso-d6):δ[ppm]＝1.74(s,3h),1.89(br.s,2h),3.64-3.71(m,1h),3.81-3.88(m,1h),4.22(d,1h),4.30-4.36(m,2h),4.40-4.46(m,1h),5.98(s,2h),6.52(t,1h),7.40-7.46(m,1h),7.73-7.79(m,1h),8.26(d,1h),8.59-8.63(m,1h),8.68-8.71(m,1h),11.70(br.s,1h)。
实施例19
ent-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(对映异构体a)
将36mgrac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(实施例18)在手性相上分离成对映异构体[柱:daicelchiralpakaz-h，5μm，250x30mm，流动相：40％异己烷，60％乙醇+0.2％二乙胺，流速30ml/min；40℃，检测:220nm]。将产物馏分收集于干冰上，通过蒸发浓缩，然后冻干。
对映异构体a:13mg(纯度99％，99％ee)
rt＝4.05min[daicelchiralpakaz-h，5μm，250x4.6mm；流动相：30％异己烷，70％乙醇+0.2％二乙胺；流速1.0ml/min；40℃；检测:220nm]。
实施例20
ent-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(对映异构体b)
将36mgrac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(实施例18)在手性相上分离成对映异构体[柱:daicelchiralpakaz-h，5μm，250x30mm，流动相：40％异己烷，60％乙醇+0.2％二乙胺，流速30ml/min；40℃，检测:220nm]。将产物馏分收集于干冰上，通过蒸发浓缩，然后冻干。
对映异构体b:17mg(纯度约92％，97％ee)
rt＝5.56min[daicelchiralpakaz-h，5μm，250x4.6mm；流动相：30％异己烷，70％乙醇+0.2％二乙胺；流速1.0ml/min；40℃；检测:220nm]。
实施例21
4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[6-氯-1-(2-氟苄基)-1h-吲唑-3-基]-5,5-二甲基-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮三氟乙酸盐
将70mg(0.57mmol)来自实施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液[假定浓度:1.07mol/l]加入80mg(0.14mmol)来自实施例35a的2-[6-氯-1-(2-氟苄基)-1h-吲唑-3-基]-4-碘-5,5-二甲基-5,7-二氢-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮中，并将混合物用0.2ml1-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)稀释。将混合物在130℃下在微波中搅拌4h。然后加入另一35mg(0.28mmol)来自实施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液[假定浓度:1.07mol/l]，并将混合物在130℃下在微波中搅拌2h。加入水/乙腈/tfa，并将反应溶液通过制备型hplc纯化(rp18柱，流动相：乙腈/水(加入0.1％tfa)梯度)。得到3mg(理论值的3％；纯度约93％)标题化合物。
lc-ms(方法1):rt＝0.84min
ms(esipos):m/z＝544.4[m+h]+
1h-nmr(400mhz，dmso-d6):δ[ppm]＝1.38(s,6h),3.75-3.81(m,2h),4.58-4.69(m,2h),4.71-4.82(m,2h),5.83(s,2h),6.90(t,1h),7.06-7.11(m,1h),7.12-7.18(m,1h),7.21-7.28(m,1h),7.32-7.42(m,2h),7.94(s,1h),8.50(d,1h),8.98(br.s,3h),11.22(s,1h)。
b.药效评估
在下文中使用以下缩写：
bsa牛血清白蛋白
edta乙二胺四乙酸
μci微居里
tris三(羟甲基)氨基甲烷
本发明的化合物的药理活性可在下述测定中证实：
b-1.体外血管舒张作用
本发明的化合物在分离的血管上进行舒张活性测定，如记载于jpstasch等人，brjpharmacol.2002；135，333-343。将兔通过重击颈部打昏，并放血。取出主动脉，除去粘附组织，并分割成1.5mm宽的环，在37℃下，将所述环在预应力下单独地放置于含有卡波金冲洗(carbogen-sparged)的krebs-henseleit溶液的5ml器官浴槽中，所述溶液具有下述组成(各自以mm计)：氯化钠：119；氯化钾：4.8；二水合氯化钙：1；七水合硫酸镁：1.4；磷酸二氢钾：1.2；碳酸氢钠：25；葡萄糖：10。用stathamuc2细胞测定收缩力，使用a/d转换器(das-1802hc，keithleyinstrumentsmunich)放大并数字化，然后平行记录在线性记录器(linerecorder)中。
为了产生收缩，将苯肾上腺素以增加的浓度累积地加入浴槽中。在几轮对照循环后，将待研究的物质在每下一轮中以每次增加的剂量加入，并且将收缩程度与在紧邻的上一轮中获得的收缩程度进行比较。这用于计算将对照值的幅度减小50％所需的浓度(ic50值)。标准给药体积为5μl；在浴槽溶液中的dmso含量相当于0.1％。
b-2.对重组鸟苷酸环化酶报告细胞系的作用
本发明的化合物的细胞活性使用重组鸟苷酸环化酶报告细胞系测定，如f.wunder等人，anal.biochem.339，104-112(2005)所述。
本发明的化合物的代表值(mec＝最小有效浓度)在下表中示出(表1；在一些情况下作为单独测量的平均值)：
表1:
b-3.人磷酸二酯酶5(pde5)的抑制
pde5制剂通过以下方式获得：将人血小板破裂(
为测定其对人pde5的体外作用，将测试物质溶于100％dmso中并连续稀释。通常，制备从200μm至0.091μm稀释系列(1:3)(在测试中所得最终浓度：4μm至0.0018μm)。在每种情况下，将2μl稀释的物质溶液置于微量滴定板的孔中(isoplate-96/200w；perkinelmer)。随后，加入50μl上述pde5制剂的稀释液。选择pde5制剂的稀释液，使得在之后的孵育过程中小于70％的物质被转化(典型的稀释：1:100；稀释缓冲液：50mmtris/盐酸ph7.5、8.3mm氯化镁、1.7mmedta、0.2％bsa)。使用测定缓冲液(50mmtris/盐酸ph7.5、8.3mm氯化镁、1.7mmedta)将物质[8-3h]环鸟苷酸-3',5'-单磷酸盐(1μci/μl；perkinelmer)以1:2000稀释至浓度为0.0005μci/μl。通过加入50μl(0.025μci)稀释的底物，最后启动酶反应。将测试混合物在室温下孵育60min，并通过加入25μl18mg/ml钇闪烁亲近珠的水悬浮液(用于spa测定的磷酸二酯酶珠，rpnq0150，perkinelmer)停止反应。将微量滴定板用膜密封并在室温下放置60min。随后，将板在microbeta闪烁计数器(perkinelmer)中以每孔30s进行分析。使用物质浓度随pde5抑制百分比变化的绘制图来测定ic50值。
本发明的化合物的代表性ic50值在下表中示出(表2；在一些情况下作为单独测量的平均值)：
表2:
b-4.对有意识的、自发性高血压大鼠血压的无线电遥测测量
使用市售的来自datasciencesinternationaldsi，usa的遥测系统对下文描述的有意识的大鼠进行血压测量。
所述系统由3个主要组件组成：
-可植入发射器(
-接收器(
-所述遥测系统使得可以连续记录有意识的动物在其通常的栖息地中的血压、心率和身体动作。
动物材料
在体重>200g的成年雌性自发性高血压大鼠(shrokamoto)中进行研究。来自okamotokyotoschoolofmedicine，1963的shr/ncrl是具有大大升高的血压的雄性wistarkyoto大鼠与具有稍微升高的血压的雌性大鼠的杂交种，且将其在f13递送至美国国立卫生研究院(u.s.nationalinstitutesofhealth)。
在将发射器植入后，试验动物被单独圈养在3型makrolon笼中。它们可自由摄取标准饲料和水。
在实验室内的昼/夜节律由在6:00am以及在7:00pm的室内照明改变。
发射器植入
在第一次实验应用至少14天之前，将所用的ta11pa-c40遥测发射器在无菌条件下手术植入到试验动物中。以这种方式安装仪器的动物可在伤口愈合以及安放植入物后被重复使用。
对于植入，将禁食的动物用戊巴比妥(耐波他(nembutal)，sanofi：50mg/kg腹膜内给药)麻醉，然后在其腹部的一大块面积上剃毛并消毒。在沿着腹白线打开腹腔后，将该系统的装满液体的测量导管在二根分叉部上方沿颅骨方向插入到降主动脉中并用组织胶(vetbondtm，3m)固定。发射器外壳在腹膜内被固定至腹壁肌肉，且伤口被一层层地闭合。
为了预防感染，在术后给予抗生素(tardomyocelcomp，bayer，1ml/kg，皮下注射)。
物质和溶液
除非另有说明，将待研究的物质各自通过管饲法口服给予一组动物(n＝6)。按照5ml/kg体重的给药体积，将测试物质溶于合适的溶剂混合物中或悬浮在0.5％的甲基纤维素(tylose)中。
溶剂处理组的动物用作对照。
试验方法
将所述遥测测量装置分配给24只动物。每个实验以实验编号(v年月日)记录。
在所述系统中生存的安装仪器的每只大鼠被分配单独的接收天线(1010receiver，dsi)。
所述植入的发射器可通过内置式磁开关在外部激活。在实验启动阶段将其切换到传输。发射的信号可通过数据采集系统(dataquesttma.r.t.forwindows，dsi)在线检测并相应地处理。数据被各自储存在为此目的创建的文件中并带有实验编号。
在标准程序中，在每种情况下以10秒为周期测量下述指标：
-收缩压(sbp)
-舒张压(dbp)
-平均动脉压(map)
-心率(hr)
-活性(act)。
在计算机控制下以5分钟间隔重复采集测量值。作为绝对值获得的源数据在图表中用当前测量的气压校正(环境压力参考监视器；apr-1)并作为单独数据储存。其他技术细节记载于制造商公司(dsi)的大量文件中。
除非另有说明，在实验当天的9.00am给予测试物质。在给药后，在24小时内测量上述参数。
评估
在实验结束后，使用分析软件(dataquesttma.r.t.tmanalysis)分类所采集的单个数据。在此，将给药前2小时设定为空白值，因此所选择的数据集包括从实验当天上午7.00至第二天上午9.00的时期。
通过测定平均值(15分钟平均)使数据在预先定义的时间上平滑，并作为文本文档转移至储存介质中。将以此方式预分类并压缩的测量值转移到excel模板中并制表。对于每日的实验，将所获得的数据储存在带有实验编号的专用文件中。将结果和测试方案以按编号分类的纸件形式归档。
参考文献
klauswitte，kaihu，johannaswiatek，claudiamüssig，georgertland
b-5.在长期实验中对大鼠的器官保护作用的测定
本发明的化合物的器官保护作用示于大鼠中的治疗相关的“低一氧化氮(no)/高肾素”高血压模型中。该研究的进行类似于最近发表的文章(sharkovskay等人jhypertension2010；28:1666-1675)。其涉及处理肾素转基因大鼠(tgr(mren2)27)，通过数周同时饮用水与本发明的化合物或赋形剂来向所述大鼠给予no合酶抑制剂l-name。在处理过程中测定血液动力学和肾参数。在长期研究结束时，通过组织病理学研究、生物指标、表达分析和心血管血浆参数来表明器官保护(肾脏、肺、心脏、主动脉)。
b-6.在缺氧条件下对有意识的犬的肺动脉压(pap)的测量
例如，使用来自datasciencesinternationaldsi，usa的遥测系统对下文描述的有意识的犬进行血压测量。所述系统由可植入血压发射器、接收器和数据采集计算机组成。所述遥测系统使得可以连续监测有意识的动物的血压和心率。在第一次实验应用之前，将所用的遥测发射器在无菌条件下手术植入到试验动物中。以该方式安装仪器的动物可在伤口愈合以及安放植入物后被重复使用。该测试使用成年雄性比格犬进行。技术细节可参见制造商公司(dsi)的文件。
物质和溶液
将待测试的物质各自通过明胶胶囊口服或在合适的溶剂混合物中通过静脉注射给予一组犬(n＝3-6)。将用载体处理的一组动物用作对照。
试验方法
对于在缺氧条件下的测量，将动物转移至缺氧气氛(氧气含量约10％)的室内。这种缺氧气氛使用市售的缺氧发生器(hypoxiagenerators)(购自hoehenbalance，cologne，germany)建立。在标准试验中，例如在给予物质1小时和5小时后，将犬转移至缺氧室内30min。在进入缺氧室之前和之后约10min，以及在缺氧室中停留期间，通过遥测测量血压和心率。
评估
在健康的犬中，在缺氧情况下，其pap快速增加。通过给予物质，可降低这种增加。为了量化pap增加以及心率和全身血压的变化，对在缺氧之前和期间的数据(通过测定平均值来平滑)进行比较。使用prism软件(graphpad，usa)以图形方式示出测量参数的过程。
b-7.静脉和口服给药后的药物代谢动力学参数的测定
本发明的化合物的药物代谢动力学参数是在雄性cd-1小鼠、雄性wistar大鼠、雌性比格犬和雌性猕猴中测定的。对于小鼠和大鼠，静脉给药通过物种特异性的血浆/dmso制剂进行，对于犬和猴通过水/peg400/乙醇制剂进行。在所有物种中，口服给予基于水/peg400/乙醇制剂溶解的物质是通过管饲法进行的。在给予物质之前，通过将硅酮导管插入右侧颈外静脉中以简化大鼠采血。手术是在使用异氟醚麻醉并给予止痛剂(阿托品/卡布洛芬(rimadyl)(3/1)0.1ml皮下给药)的实验之前至少一天时进行的。在包括给予物质后至少24小时至最长72小时的终末时间点的时间窗内采血(通常超过10个时间点)。将血液转移到肝素化的管中。然后通过离心获得血浆；如果需要，可将其储存在-20℃下直至进一步处理。
将内标(其也可以是化学上不相关的物质)加入本发明的化合物的样品、校准样品和合格品(qualifier)中，然后使用过量乙腈沉淀蛋白质。加入与lc条件匹配的缓冲溶液，随后涡旋，然后以1000g离心。通过lc-ms/ms使用c18反相柱和可变流动相混合物分析上清液。通过具体选择的离子监测实验或高分辨lc-ms实验的提取离子色谱图的峰高或峰面积来量化所述物质。
使用所测定的血浆浓度/时间曲线以经验证的药物代谢动力学计算程序来计算药物代谢动力学参数，例如auc、cmax、f(生物利用度)、t1/2(终末半衰期)、mrt(平均滞留时间)和cl(清除率)。
由于物质量化是在血浆中进行的，因此有必要测定所述物质的血液/血浆分布，从而能够相应调节药物代谢动力学参数。为此，在滚辊混合器(rockingrollermixer)中，将限定量的物质在所述物种的肝素化全血中孵育20min。通过以1000g离心而获得血浆。在测量血浆和血液浓度后(通过lc-ms(/ms)；参见上文)，通过形成的商来测定c血液/c血浆值。
b-8.代谢研究
为了测定本发明的化合物的代谢特性，将它们用重组人细胞色素p450(cpy)酶、肝微体或来自各种动物物种(例如大鼠、犬)及人来源的原代新鲜肝细胞孵育，以获得并比较基本上非常完整的i期和ii期肝代谢的信息以及参与代谢的酶的信息。
将本发明的化合物以约0.1-10μm的浓度孵育。为此，制备浓度为0.01-1mm的本发明的化合物在乙腈中的储备液，然后以1:100的稀释度移液到孵育混合物中。在37℃下，将肝微体和重组酶在50mm磷酸钾缓冲液(ph7.4)中孵育，所述磷酸钾缓冲液具有或不具有由1mmnadp+、10mm葡萄糖-6-磷酸和1个单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成的nadph生成系统。同样在37℃下，将原代肝细胞悬浮孵育在williamse培养基中。在孵育0-4h后，用乙腈(终浓度为约30％)终止孵育混合物，并且以约15000xg将蛋白质离心出来。直接分析由此终止的样品，或将其储存在-20℃下直至进行分析。
所述分析通过带有紫外和质谱检测的高效液相色谱法(hplc-uv-ms/ms)进行。为此，将孵育样品的上清液用合适的c18反相柱和可变的流动相混合物(乙腈和10mm甲酸铵水溶液或0.05％甲酸)进行色谱分析。uv色谱图结合质谱数据用于对代谢物进行鉴定、结构解析和定量测定，以及用于在孵育混合物中本发明的化合物的定量代谢降低。
b-9.caco-2渗透性测试
借助于caco-2细胞系测定测试物质的渗透性，caco-2细胞系是一种用于在胃肠屏障处预测渗透性而建立的体外模型[artursson，p.andkarlsson，j.(1991)correlationbetweenoraldrugabsorptioninhumansandapparentdrugpermeabilitycoefficientsinhumanintestinalepithelial(caco-2)cells.biochem.biophys.175(3)，880-885]。将caco-2细胞(accno.169，dsmz，deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturen，braunschweig，germany)接种在具有插入物的24孔板中并孵育15至16天。对于渗透性研究，将测试物质溶于dmso中并用输送缓冲液(hanksbufferedsaltsolution，gibco/invitrogen，具有19.9mm葡萄糖和9.8mmhepes)稀释至最终测试浓度。为了测定测试物质的顶端至基底外侧的渗透性(pappa-b)，将包含测试物质的溶液施用至caco-2细胞单层的顶侧，并将输送缓冲液施用至基底侧。为了测定测试物质的基底外侧至顶端的渗透性(pappb-a)，将包含测试物质的溶液施用至caco-2细胞单层的基底侧，并将输送缓冲液施用至顶端。在试验开始时，从相应的供体隔室(donorcompartment)取样以确保质量平衡。在37℃下，在孵育2小时后，将样品从两个隔室中取出。通过lc-ms/ms分析样品并计算表观渗透系数(papp)。对于各细胞单层，测定荧光黄的渗透性以确保细胞层的完整性。在每次测试运行时，还测定阿替洛尔(低渗透性标记物)和柳氮磺胺吡啶(主动分泌的标记物)的渗透性作为品质对照。
b-10.测定物质在ph6.5的缓冲液中的溶解度
将40μldmso加入2mg测试物质中[50g/l]。移出10μl该溶液并将其引入990μlph6.5的pbs缓冲液中(c＝500μg/ml)。将该溶液/悬浮液在室温下摇晃24h。在114000g下超速离心30min后，移出上清液，用8:2的acn/水稀释并通过lc-msms分析。
对于校准，同样从dmso储备液中移出10μl并将其引入823μldmso中(c＝600μg/ml)。使用五点校准曲线进行量化。
lc-msms量化的仪器：
absciextriplequad4500；agilent1260，具有初始泵(g1312binfinity)、脱气器(g4225ainfinity)、柱恒温器(g1316cinfinity)；ctcanalyticspal注射系统thc-xt
hplc方法:
流动相:
a:0.5ml甲酸(50％浓度)/l水
b:0.5ml甲酸(50％浓度)/l乙腈
梯度:
流速:2.5ml
注射体积:5μl
柱:watersoasishlb，2.1x20mm，25μ
柱温:30℃
分离器(ms的上游)1:20
ms方法:
用于优化的流动注射分析(fia)
用于量化的多重反应监测(mrm)
流动相:
a:0.5ml甲酸(50％浓度)/l水
b:0.5ml甲酸(50％浓度)/l乙腈
流速:0.25ml
注射体积:5μl
柱:不锈钢毛细管
毛细管温度:22℃
本发明的化合物的代表性溶解度示于表3。
表3
b-11.在具有不同ph值的缓冲液中测定物质的溶解度
每种物质和缓冲液，各自精确称重0.5-0.6mg(8个称重部分)。对于dmso校准溶液，需要0.5-0.6mg的另一称重部分(称重部分9)。在每种情况下，将缓冲液加入样品中，以获得c＝500μg/ml的浓度。将该样品溶液在室温和1400rpm下摇晃24h。
将具有用于校准的称重部分的eppendorf容器用dmso填充至浓度c＝600μg/ml。由该储备液制备2种校准溶液。首先，将1000μldmso加入2mleppendorf容器中，并吸取34.4μl储备液(c＝20μg/ml)。在另一2mleppendorf容器中，将71.4μl该溶液(c＝20μg/ml)加入500μldmso(c＝2.5μg/ml)中。将两种校准溶液转移至hplc小瓶。
在摇晃样品溶液后，在每种情况下，将200μl上清液转移至离心管中，并在114000g下离心30min。然后移取150μl上清液，用dmso以1:5和1:100稀释并转移至hplc小瓶。通过hplc分析两种校准溶液和经稀释的样品溶液。使用各峰面积进行量化。
溶剂和缓冲液
蒸馏水
高氯酸(fluka；77227)
乙腈(tap品质)
dmso(merck；8.02912.2500)
缓冲液
仪器
agilent1100或具有uv检测、可变波长(如二极管阵列)的类似仪器
超声波浴
janke&kunkelvibromix
eppendorfthermomixer
hplc方法:
流动相a:5mlhclo4/l水
流动相b:乙腈
梯度:
柱：kromasil100c18，60x2.1mm，3.5μm
柱温：30℃
流速：0.75ml/min
检测器：210nm
注射体积：60μl
c.药物组合物的工作实施例
可将本发明的化合物转化成以下药物制剂：
片剂:
组分:
100mg本发明的化合物、50mg乳糖(一水合物)、50mg玉米淀粉(天然)、10mg聚乙烯吡咯烷酮(pvp25)(basf，ludwigshafen，germany)和2mg硬脂酸镁。
片剂重量212mg。直径8mm，曲率半径12mm。
制备:
将本发明的化合物、乳糖和淀粉的混合物使用5％(重量/重量)的pvp水溶液制粒。将颗粒干燥，然后与硬脂酸镁混合5分钟。使用常规的压片机压片该混合物(对于片剂形式，参见上文)。用于压片的指导值为15kn压力。
用于口服给药的悬浮剂:
组成：
1000mg本发明的化合物、1000mg乙醇(96％)、400mg
10ml口服悬液剂相当于100mg本发明的化合物的单次剂量。
制备：
将rhodigel悬浮在乙醇中；将本发明的化合物加入悬浮液中。在搅拌下加入水。将所述混合物搅拌约6h直到rhodigel完全溶胀。
用于口服给药的溶液剂：
组成：
500mg本发明的化合物、2.5g聚山梨酸酯和97g聚乙二醇400。20g口服溶液剂相当于100mg本发明的化合物的单次剂量。
制备：
在搅拌下，将本发明的化合物悬浮在聚乙二醇和聚山梨酸酯的混合物中。持续搅拌操作直至本发明的化合物完全溶解。
静脉给药溶液剂：
将本发明的化合物以低于饱和溶解度的浓度溶于生理上可接受的溶剂(例如等渗生理盐水、5％葡萄糖溶液和/或30％peg400溶液)中。将该溶液进行无菌过滤并分配到无菌且无热原的注射容器中。