经由物理吸附将修饰的寡核苷酸固定至聚合物基体上的制作方法

发明领域

用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的基体上的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供包含液体和标记的寡核苷酸的混合物，b)将步骤a)的混合物施加在未修饰的聚合物基体上，其中经由物理吸附将寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上。本发明还涉及通过该方法实现的微阵列。本发明还涉及与寡核苷酸附接的标记用于通过物理吸附将标记的寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上的用途。此外，本发明涉及通过本文所述的方法实现的微阵列用于包含此类微阵列的测定和诊断试剂盒的用途。

发明背景

在现代分子生物学和医学中，生物芯片或生物学微阵列，特别是dna微阵列，已经成为重要的工具。通常，芯片由排列的一系列大量寡核苷酸的微小点组成，每个微小点含有小量的特异性核酸序列。这可以是，例如，基因或其他dna元件的短区段，其被用作捕获探针，以便在允许捕获探针和相应靶标之间的结合的条件下与cdna或crna样品(靶标)杂交。

塑料经常用于生产一次性基体，因为它们是低成本的并且可以用于大规模生产。对于核酸检测的生物化学测定，需要将dna寡核苷酸探针固定在这些基体上。已经公开了几种用于将dna寡核苷酸固定在塑料(即聚合物)基体诸如环烯烃共聚物(coc)上的方法。在大多数情况下，基于塑料的微阵列具有修饰/功能化的表面以使寡核苷酸能够附接。其他固定方法描述了(接头)修饰的寡核苷酸在未修饰的聚合物基体上的结合。短暂的uv暴露将含有聚(t)和/或聚(c)标签的dna寡核苷酸固定至各种未修饰的聚合物基体上(y.sun等人,(2012);d.sabourin等人(2010);n.kimura,(2006))。

由于聚合物基体的必要修饰，这些方法是昂贵且耗时的。此外，它们可能对检测方法具有负面影响。具体而言，用uv光照射核酸通常导致对核酸分子的损伤，这可能对分子与互补序列杂交的能力产生影响，因此可能损害其在微阵列系统中的可用性。因此，需要开发微阵列的成本和生产时间降低的改进方法，所述微阵列不会损害用这些微阵列实施的测定的质量。

发明概述

本发明解决了对于不太费时且成本较低地生产微阵列（其不损害用这些微阵列进行的测定的质量）的方法的需求。

上述目标通过用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上的方法来实现，所述方法包括以下步骤：a)提供包含液体和标记的寡核苷酸的混合物，和

b)将步骤a)的混合物施加在未修饰的基体上；其中经由物理吸附将寡核苷酸固定在未修饰的基体上。

在一个具体实施方案中，所述聚合物基体选自聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚降冰片烯、环烯烃共聚物(coc)、氟化聚酰亚胺、聚苯乙烯(ps)、苯乙烯丁二烯共聚物(sbc)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(abs)、苯乙烯丙烯腈(san)、聚乙烯(pe)、聚丙烯(pp)和聚砜。

在一个优选实施方案中，所述聚合物基体是环烯烃共聚物(coc)。

在另一个优选实施方案中，所述标记的寡核苷酸是dna、rna或lna。

在进一步优选实施方案中，所述标记的寡核苷酸是dna或lna。

在一个额外优选实施方案中，所述标记的寡核苷酸是ssdna或sslna。

在另一个优选实施方案中，所述标记的寡核苷酸包含至少一个化学基团与其附接的寡核苷酸，其中所述化学基团适合于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的基体上。

在另一个实施方案中，所述标记的寡核苷酸包含至少一个化学基团与其附接的寡核苷酸，其中所述化学基团优选具有0.1至1000kda、0.1至50kda、0.1至1.5kda、0.15至1kda、0.2至0.8kda的分子量。

在进一步的实施方案中，所述化学基团是这样的化学基团，其优选地选自生物素或磺酰罗丹明101酰基氯(cas号82354-19-6；德克萨斯红)。

在另一个实施方案中，所述标记的寡核苷酸的长度为约2至约2000个核苷酸、约2至500个、约2至约200个核苷酸、约2至约100个、约2至50个核苷酸。

在进一步的实施方案中，所述方法不包括uv暴露的步骤，且所述寡核苷酸不共价结合至基体。

在又另一个实施方案中，步骤b)之后是步骤孵育基体。

在一个额外实施方案中，上面提及的方法步骤之后是步骤基体干燥。

在进一步的实施方案中，上面提及的方法步骤之后是步骤清洗基体，其任选地之后是步骤干燥基体。

本发明的另一个方面涉及与寡核苷酸附接的标记用于通过物理吸附将标记的寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上的用途。

本发明的一个额外方面是指通过如上所述的方法实现的微阵列。

本发明的进一步的方面涉及包含未修饰的聚合物基体和固定在所述基体上的标记的寡核苷酸的微阵列；其中在所述寡核苷酸和未修饰的聚合物基体之间不存在共价键。

在一个实施方案中，所述标记的寡核苷酸还包含与标记的寡核苷酸附接的目标分子。

进一步的实施方案是指包含未修饰的聚合物基体、固定在所述基体上的标记的寡核苷酸和目标分子与其附接的寡核苷酸的微阵列；其中所述寡核苷酸与固定在所述聚合物基体上的标记的寡核苷酸杂交，且其中固定在所述基体上的标记的寡核苷酸和未修饰的聚合物基体之间不存在共价键。

在本发明的一个实施方案中，通过物理吸附将标记的寡核苷酸固定在未修饰的基体上。

本发明的进一步的方面涉及诊断试剂盒，其包含根据如本文所述的方法固定的寡核苷酸的阵列和含有确定量的与所述固定的寡核苷酸中的至少一种互补的已知、标记的核酸的对照探针。

本发明的一个额外方面是指如上所限定的微阵列用于杂交测定、用于表面扩增、用于定量和/或多重检测dna或rna分子、用于表达分析、用于比较基因组杂交、用于检测单核苷酸多态性或用于基于基因组选择的测序的用途。

本发明的另一个方面涉及用于将目标分子固定在未修饰的聚合物基体上的方法，所述方法包括如本文所述的固定标记的寡核苷酸的方法的步骤，其中步骤a)中提供的标记的寡核苷酸还包含与所述寡核苷酸附接的目标分子。

本发明的另一个方面涉及用于将目标分子固定在未修饰的聚合物基体上的方法，所述方法包括如本文所述的固定标记的寡核苷酸的方法的步骤，且此外至少包括步骤：

c)将目标分子与其附接的寡核苷酸杂交。

附图简述

图1.展现用未修饰的寡核苷酸斑点印刷的coc基体的测定结果，其在与靶标杂交和用纳米颗粒标记后没有展现可见斑点。

图2显示用德克萨斯红-修饰的寡核苷酸斑点印刷的coc基体的结果，其在杂交后具有清晰可见的斑点。

图3显示用生物素-修饰的寡核苷酸斑点印刷的coc基体的结果，其在杂交后具有清晰可见的斑点。

图4显示实施例2的杂交测定的示意图。

实施方案的详述

尽管本发明将关于具体实施方案进行描述，但不在限制性的意义上理解该描述。

在详细描述本发明的示例性实施方案之前，给出对于理解本发明重要的定义。

如在此说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/种(a)”和“一个/种(an)”也包括各自的复数，除非上下文明确另外指示。

在本发明的上下文中，术语“约”和“大约”表示本领域技术人员将理解为仍然确保讨论中的特征的技术效果的精确区间。所述术语通常指示偏离所示数值±20%，优选±15%，更优选±10%，和甚至更优选±5%的偏差。

应当理解，术语“包含”不是限制性的。用于本发明的目的，认为术语“由...组成”是术语“包含(comprisingof)”的优选实施方案。如果在下文中将组定义为包含至少特定数目的实施方案，则这表示也包含优选地仅由这些实施方案组成的组。

此外，在说明书和权利要求中的术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”等和类似术语被用于区分相似的要素且不一定用于描述相继或时间顺序。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，且本文所述的本发明的实施方案能够以除了本文描述或说明的顺序以外的其他顺序操作。

在术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”等涉及方法或用途的步骤的情况下，在步骤之间没有时间或时间间隔连贯性，即所述步骤可同时进行，或在此类步骤之间可存在数秒、数分钟、数小时、数天、数周、数月或甚至数年的时间间隔，除非在如本文下述的申请中另外指出。

应当理解，本发明不受限于本文所述的具体方法、方案、试剂等，因为这些可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅为了描述具体实施方案的目的，且无意限制仅通过所附权利要求限制的本发明的范围。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员一般理解的相同的含义。

本发明的一个方面是指用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含液体和标记的寡核苷酸的混合物，将所述混合物施加在未修饰的聚合物基体上，其中经由物理吸附将寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上。

如本文所用的术语“未-修饰的”和“未修饰的”是指未例如通过具有官能化基团(如聚乙二醇、胺、环氧化物、异硫氰酸酯、聚-l-赖氨酸、抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白)的硅烷层修饰或官能化的聚合物基体。这尤其意味着聚合物基体不具有修饰或官能化的表面，诸如由烷基链形成的疏水性单层或由聚乙二醇或低聚乙二醇(oligoethylenglycol)链形成的亲水层，含环氧基的聚合物层，氨基硅烷化表面，并且未用促进磷酸键键合(phosphatebonding)的物质(诸如胺、胍基、脒基、咪唑鎓基团、不带电荷的h-键供体诸如醛、醇或甲酰胺或不带电荷的无机h-键供体诸如sio2、tio2、alo2)涂覆。该术语进一步意味着聚合物基体例如未与有机薄膜接触，其覆盖聚合物基体的所有或一些表面。没有反应性基团或官能团附接至聚合物基体。具体而言，术语“未-修饰的”和“未修饰的”意味着基体的结合特性未改变。更具体地，这意味着没有分子，特别是没有增强寡核苷酸的结合的分子被加入聚合物基体中，或者聚合物基体的结合基团未被活化。

术语“将标记的寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上”涉及经由阻碍寡核苷酸的分离(例如在洗涤、冲洗或化学杂交步骤中)的分子相互作用将标记的寡核苷酸与未修饰的聚合物基体的缔合。在本发明的方法中，此类分子相互作用不是基于共价化学键，而是基于吸附，特别是底物和待固定的标记的寡核苷酸之间的物理吸附。使核苷酸与基体结合的吸附力可以选自氢键键合、静电相互作用、范德华相互作用、疏水相互作用或其组合。

基体和寡核苷酸之间的吸附通过标记的寡核苷酸的标记来赋予。这从图1至3变得清楚，其显示没有标记的寡核苷酸未固定在coc基体上(图1)，而当用德克萨斯红(图2)或生物素(图3)标记寡核苷酸时，可以检测到包含几个标记的寡核苷酸的清晰斑点，显示标记的寡核苷酸被固定在基体上。这清楚地显示，只有如本文所限定的具有标记的寡核苷酸被固定在聚合物基体诸如coc上。

因此，在本发明中，标记的寡核苷酸的固定通过将标记的寡核苷酸的标记吸附至未修饰的聚合物基体来介导。

如本文所用的“靶标”或“靶分子”可以是允许如本文上述的特异性相互作用的任何合适的分子。靶分子的实例为核酸，蛋白，肽，任何形式和格式的配体，抗体，抗原，小分子如有机结构、无机结构或有机和无机结构的混合物，例如碳水化合物或糖，聚合物，实体如细胞或细胞碎片或细胞亚部分，例如细菌细胞或其碎片，真核细胞或其碎片，病毒颗粒或病毒，或上述任何衍生物或组合。

如本文所用的术语“施加”是指液体沉积的任何方法，例如接触印刷或非接触印刷。在一个优选实施方案中，使用非接触印刷来将步骤a)的混合物施加在未修饰的基体上。

如本文所用的术语“非接触印刷”是指本领域中适合于在聚合物基体上印刷包含寡核苷酸的混合物的任何非接触印刷方法，诸如喷墨印刷、点样或分配。对于非接触印刷，可以采用点样器诸如sciflexarrayers11(scienion)。

本发明的一个具体实施方案是指用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含液体和标记的寡核苷酸的混合物，将所述混合物非接触印刷在未修饰的聚合物基体上，其中经由物理吸附将寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上。

如本文所用的术语“基体”是指本领域技术人员已知的任何合适的基体。所述基体可以具有任何合适的形式或格式，例如其可以是平的，弯曲的，例如凸起或凹入地弯曲，其可以是卷曲的或包括波浪样格式。阵列还可以包含含有捕获分子的磁性颗粒。如本文所用的术语基体可以包括固体物体，诸如固体载片室或固体微流体装置，以及涂覆层，例如载片的涂覆层，腔室的涂覆层或微流体装置的涂覆层。在一个实施方案中，所述基体是指固体物体。在具体实施方案中，所述基体是指固体载片或固体室。

在本发明的一个实施方案中，所述聚合物基体选自聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚降冰片烯、环烯烃共聚物(coc)、氟化聚酰亚胺、聚苯乙烯(ps)、苯乙烯丁二烯共聚物(sbc)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(abs)、苯乙烯丙烯腈(san)、聚乙烯(pe)、聚丙烯(pp)和聚砜。

在一个优选实施方案中，所述聚合物基体选自聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚降冰片烯、环烯烃共聚物(coc)、氟化聚酰亚胺、苯乙烯丁二烯共聚物(sbc)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(abs)、苯乙烯丙烯腈(san)、聚乙烯(pe)、聚丙烯(pp)和聚砜。

在更优选实施方案中，所述聚合物基体选自聚降冰片烯、环烯烃共聚物(coc)、氟化聚酰亚胺、苯乙烯丁二烯共聚物(sbc)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(abs)、苯乙烯丙烯腈(san)、聚乙烯(pe)和聚砜。在本发明的一个甚至更优选实施方案中，所述聚合物基体是环烯烃共聚物(coc)。

在另一个优选实施方案中，所述标记的寡核苷酸包含至少一个化学基团与其附接的寡核苷酸，其中所述化学基团适合于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的基体上。

术语“附接的”是指共价和非共价结合。优选地，“附接的”意味着用于固定的标记与寡核苷酸共价结合。优选地，“附接的”意味着目标分子与寡核苷酸共价结合。

“适合于固定标记的寡核苷酸”应被理解为在至少一种化学基团与未修饰的基体之间建立吸附力，特别是物理吸附力，使得将标记的寡核苷酸固定至基体。这可以尤其遵循实施例1至3的方案使用用待测试的化学基团标记的寡核苷酸进行测试。例如如图2和图3中所示的斑点的形成表明化学基团适合于将标记的寡核苷酸固定至基体。相反，例如如图1所示的斑点的不存在表明化学基团不适合于将标记的寡核苷酸固定至基体。因此，借助将具有磁珠的探针与样品杂交并通过受抑全内反射(f-tir)检测珠粒，可以测试固定至基体的寡核苷酸的适合性。然而，用不同标记进行标记的其他探针也可以与适合于检测探针的标记的检测方法组合用于检测。

在另一个实施方案中，所述标记的寡核苷酸包含至少一个化学基团与其附接的寡核苷酸，其中所述化学基团优选具有0.1至1000kda、0.1至50kda、0.1至1.5kda、0.15至1kda、0.2至0.8kda的分子量。

在进一步的实施方案中，至少一个化学基团是疏水性化学基团。在一个具体实施方案中，例如，所述疏水性化学基团可以是疏水性发色团、长疏水链、胆甾醇基、peg或生物素。

如本文所用的术语“疏水性”是指在水中不容易溶解(即，缔合)的倾向。通过优先与其他疏水部分或分子键合或缔合、从而排除水分子，部分(moiety)可以是疏水性的。

在一个优选实施方案中，化学基团是蛋白或非蛋白有机荧光团，诸如花青衍生物、萘衍生物、噁二唑衍生物、蒽衍生物、芘衍生物、噁嗪衍生物、吖啶衍生物、芳基次甲基衍生物或四吡咯衍生物，优选呫吨衍生物，诸如荧光素或其衍生物或罗丹明或其衍生物。

在一个优选实施方案中，所述化学基团是罗丹明或其衍生物，诸如羧基四甲基罗丹明(tamra)、四甲基罗丹明(tmr)及其异硫氰酸酯衍生物(tritc)和磺酰罗丹明101和磺酰罗丹明101氯化物(德克萨斯红)。

在一个优选实施方案中，所述化学基团选自生物素或磺酰罗丹明101酰基氯(cas号82354-19-6；德克萨斯红)。

所述化学基团可以附接在寡核苷酸的3'末端或5'末端。

在一个优选实施方案中，所述标记的寡核苷酸是标记的rna、标记的lna或标记的dna。在一个甚至更优选实施方案中，所述寡核苷酸是标记的dna或标记的lna。

标记的寡核苷酸还可以包含核苷酸适体，诸如dna适体、rna适体或lna适体。

待根据本发明的一个优选实施方案固定的寡核苷酸可以是dna、rna、pna、cna、hna、lna或ana。dna可以是例如a-dna、b-dna或z-dna的形式。rna可以是例如p-rna，即吡喃基(pyranosysl)-rna的形式，或结构修饰形式如发夹rna或茎-环rna。

术语“pna”涉及肽核酸，即人工合成的类似于dna或rna的聚合物，其被用于生物学研究和药物治疗，但已知其不天然存在。pna骨架一般由通过肽键连接的重复的n-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成。多种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键与骨架连接。pna一般被描述为类似肽，其中n-端在第一(左)位且c端在右边。

术语“cna”涉及氨基环己基乙烷酸核酸。此外，该术语涉及环戊烷核酸，即包含例如2'-脱氧氨基甲酸鸟苷(2'-deoxycarbaguanosine)的核酸分子。

术语“hna”涉及己糖醇核酸，即由标准的核碱基和磷酸化的1,5-失水己糖醇骨架构建的dna类似物。

术语“lna”涉及锁核酸。通常，锁核酸是修饰的且因此难以接近的rna核苷酸。lna核苷酸的核糖部分可被连接2’和4’碳的额外的桥修饰。此桥以3’-内结构构象锁定核糖。锁定的核糖构象增强碱基堆积和骨架预组织。这可显著提高热稳定性，即寡核苷酸的解链温度。

术语“ana”涉及阿拉伯糖核酸或其衍生物。在本发明的上下文中优选的ana衍生物是2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核苷(2'f-ana)。

在进一步优选实施方案中，寡核苷酸可以包含dna、rna、pna、cna、hna、lna和ana中的任一种的组合。特别优选具有dna或rna碱基的lna核苷酸的混合物。

在另一个优选实施方案中，本文如上所定义的寡核苷酸可以是单链的、双链的或可以由单链和双链区段的组合构成。术语“单链核酸”涉及包含单糖-磷酸酯骨架和/或不以螺旋形式组织的寡核苷酸。优选地，这些寡核苷酸不表现出二级结构或分子间缔合。术语“双链核酸”涉及包含两个糖-磷酸酯骨架的核酸分子。在一个优选实施方案中，双链核酸以双螺旋形式组织。在进一步优选实施方案中，根据本发明的双链核酸可以由不同类型的核酸分子构成，例如由dna和rna、dna和pna、dna和cna、dna和hna、dna和lna、dna和ana、或rna和cna、rna和pna、rna和cna、rna和hna、rna和lna、rna和ana、或pna和cna、pna和hna、pna和lna、pna和ana或cna和hna、cna和lna、cna和ana、或hna和lna、hna和ana、或lna和ana构成。它们或者也可以由上面提及的核苷酸变体的任一种的区段的组合构成。最优选的是单链dna(ssdna)或单链lna(sslna)。

所述寡核苷酸可以对靶分子具有结合亲和力。

所述寡核苷酸可以包含对靶分子没有结合亲和力的间隔物。所述间隔物可以是寡核苷酸或不同的聚合物，例如碳水化合物链。所述间隔物可以是具有例如至少15个核苷酸、优选至少20个核苷酸或至少50个核苷酸的长度的寡核苷酸。所述间隔物可以是聚合物，诸如具有至少4nm、6nm或15nm的长度的碳水化合物链。所述间隔物可以在寡核苷酸的末端，其用适合于将标记的寡核苷酸固定在基体上的化学基团标记，因此所述间隔物可以在接近于所述基体的寡核苷酸的末端。

一个具体实施方案是指用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含液体和标记的寡核苷酸的混合物，将所述混合物施加在未修饰的聚合物基体上，其中经由物理吸附将所述寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上且其中标记的寡核苷酸是标记的ssdna。

一个具体实施方案是指用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含液体和标记的寡核苷酸的混合物，将所述混合物施加在未修饰的聚合物基体上，其中经由物理吸附将所述寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上且其中标记的寡核苷酸是标记的sslna。

所述寡核苷酸可以源自天然存在或人工制备的核酸分子。它们可以包括编码和/或非编码区域。根据本发明，寡核苷酸可以具有约2至约2000个核苷酸、更优选约2至约500个核苷酸、或约2至200个、特别优选约2至约100个核苷酸的长度。还优选的是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的长度。

具体而言，本发明克服了附接寡核苷酸特别是100个核苷酸或更低吸附力的寡核苷酸不是非常有效的问题。增加核苷酸和基体之间的吸附力的基体和方法阻碍寡核苷酸形成双链体或促进非特异性靶标与微阵列结合的能力。通过使用附接至少一个适用于通过吸附、特别是物理吸附将寡核苷酸与聚合物基体结合的化学基团的寡核苷酸，已经克服了该问题。

本发明的方法不包括光化学交联诸如uv暴露的步骤。本发明的方法也不采用化学交联步骤。所述方法不包括改变聚合物基体的电荷，使得聚合物基体的表面具有特定电荷。

在一个具体实施方案中，施加在未修饰的聚合物基体上的混合物包含液体和标记的寡核苷酸。所述液体可以是适合于溶解寡核苷酸用于施加和固定在基体上的任何液体，诸如水或缓冲溶液诸如pbs、碳酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液。所述缓冲溶液可以包含例如蔗糖、三甲基甘氨酸(甜菜碱)、海藻糖、甘油、吐温、n-十二烷酰基肌氨酸(sarkosyl)、pva和/或peg。在一个优选实施方案中，所述缓冲液包含蔗糖和甜菜碱。

在一个具体实施方案中，所述液体可以不包括阳离子去垢剂类化合物，诸如十六烷基三甲基溴化铵(ctab)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)、辛基二甲基胺(oda)。在另一个具体实施方案中，所述液体可以不包括ctab、edc或oda。

蔗糖的浓度可以是1％至50％、5％至40％、10％至30％、优选20％。三甲基甘氨酸的浓度可以是1mm至50mm、5mm至30mm、10mm至20mm、优选15mm。

在一个具体实施方案中，缓冲液包含pbs、蔗糖和三甲基甘氨酸。

本发明的一个具体实施方案是指用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含缓冲液和标记的寡核苷酸的混合物，将所述混合物施加在未修饰的聚合物基体上，其中经由物理吸附将寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上。

本发明的一个具体实施方案是指用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含缓冲液和标记的寡核苷酸的混合物，将所述混合物非接触印刷在未修饰的聚合物基体上，其中经由物理吸附将寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上。

本发明的另一个实施方案是指用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含液体和标记的寡核苷酸的混合物，将所述混合物施加在未修饰的聚合物基体上，其中经由物理吸附将所述寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上，且其中所述方法不包括uv暴露的步骤，且所述寡核苷酸不共价结合至基体。

本发明的另一个实施方案是指用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含缓冲液和标记的寡核苷酸的混合物，将所述混合物非接触印刷在未修饰的聚合物基体上，其中经由物理吸附将所述寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上，且其中所述方法不包括uv暴露的步骤，且所述寡核苷酸不共价结合至基体。

本发明的另一个实施方案是指用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含液体和标记的寡核苷酸的混合物，将所述混合物施加在未修饰的聚合物基体上，其中经由物理吸附将寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上，其中所述未修饰的聚合物基体是coc，其中所述标记的寡核苷酸包含化学基团，其为生物素或有机非蛋白荧光团，诸如磺酰罗丹明101酰基氯(cas号82354-19-6；德克萨斯红)，且其中所述方法不包括uv暴露的步骤，且所述寡核苷酸不共价结合至基体。

本发明的另一个实施方案是指用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含缓冲液和标记的寡核苷酸的混合物，将所述混合物非接触印刷在未修饰的聚合物基体上，其中经由物理吸附将寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上，其中所述未修饰的聚合物基体是coc，其中所述标记的寡核苷酸包含化学基团，其为生物素或有机非蛋白荧光团，诸如磺酰罗丹明101酰基氯(cas号82354-19-6；德克萨斯红)，且其中所述方法不包括uv暴露的步骤，且所述寡核苷酸不共价结合至基体。

本发明的另一个实施方案是指用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含液体和标记的寡核苷酸的混合物，将所述混合物施加在未修饰的聚合物基体上，其中经由物理吸附将寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上，其中标记的寡核苷酸是ssdna，其中所述未修饰的聚合物基体是coc，其中所述标记的寡核苷酸包含化学基团，其为生物素或有机非蛋白荧光团，诸如磺酰罗丹明101酰基氯(cas号82354-19-6；德克萨斯红)，且其中所述方法不包括uv暴露的步骤，且所述寡核苷酸不共价结合至基体。

本发明的另一个实施方案是指用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含缓冲液和标记的寡核苷酸的混合物，将所述混合物非接触印刷在未修饰的聚合物基体上，其中经由物理吸附将寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上，其中标记的寡核苷酸是ssdna，其中所述未修饰的聚合物基体是coc，其中所述标记的寡核苷酸包含化学基团，其为生物素或有机非蛋白荧光团，诸如磺酰罗丹明101酰基氯(cas号82354-19-6；德克萨斯红)，且其中所述方法不包括uv暴露的步骤，且所述寡核苷酸不共价结合至基体。

本发明的另一个实施方案是指用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含液体和标记的寡核苷酸的混合物，将所述混合物施加在未修饰的聚合物基体上和孵育所述聚合物基体，其中经由物理吸附将寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上。

聚合物基体的孵育可以在室温、例如18℃至25℃、优选20℃至22℃下进行30秒至5小时、5分钟至4小时、10分钟至3小时、15分钟至1小时、优选30分钟。

所述孵育可以在10％至90％、20％至80％、30％至70％、40％至60％、优选50％的相对湿度下进行。

本发明的另一个实施方案是指用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含液体和标记的寡核苷酸的混合物，将所述混合物施加在未修饰的聚合物基体上，和基体干燥，其中经由物理吸附将寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上。

本发明的另一个实施方案是指用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含液体和标记的寡核苷酸的混合物，将所述混合物施加在未修饰的聚合物基体上，孵育所述基体，和基体干燥，其中经由物理吸附将寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上。

如本文所用的术语“基体干燥”是指将基体在约25℃至70℃、约30℃至45℃、优选约35℃至39℃、更优选约37℃的温度下孵育。由此，混合物的液体蒸发。在该步骤期间，不发生标记的核酸和基体之间的交联。

步骤基体干燥可以持续本领域技术人员已知的任何合适时段、例如30分钟至36小时、持续1小时至30小时、持续10至22小时进行。基体干燥可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方式、例如干燥室或烘箱或培养箱进行。除了温度之外，还可以将其他参数如湿度、通气或通风调节至本领域技术人员已知的合适值。

未修饰的基体可以例如通过常规蒸汽灭菌(高压灭菌)或伽玛辐照来灭菌。优选地，将未修饰的基体进行伽马处理。

本发明的另一个实施方案是指用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含液体和标记的寡核苷酸的混合物，将所述混合物施加在未修饰的基体上，孵育所述基体，基体干燥，和洗涤所述基体，其中经由物理吸附将寡核苷酸固定在未修饰的基体上。

本发明的另一个实施方案是指用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的基体上的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含液体和标记的寡核苷酸的混合物，将所述混合物施加在未修饰的基体上，基体干燥，和洗涤所述基体，其中经由物理吸附将寡核苷酸固定在未修饰的基体上。

本发明的另一个实施方案是指用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的基体上的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含液体和标记的寡核苷酸的混合物，将所述混合物施加在未修饰的基体上，孵育所述基体，和洗涤所述基体，其中经由物理吸附将寡核苷酸固定在未修饰的基体上。

本发明的另一个实施方案是指用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的基体上的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含液体和标记的寡核苷酸的混合物，将所述混合物施加在未修饰的基体上，和洗涤所述基体，其中经由物理吸附将寡核苷酸固定在未修饰的基体上。

为了洗涤基体，可以使用含有pbs和tween20的洗涤缓冲液。所述缓冲液可以是例如0.5xpbs和0.01%tween20。

将所述基体置于洗涤缓冲液中1秒至1小时、10秒至30分钟、30秒至10分钟、45秒至5分钟、优选1分钟。

可以通过本领域技术人员已知的方法，诸如将基体置于干燥柜中，从基体去除洗涤缓冲液。

本发明的另一个实施方案是指用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的基体上的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含液体和标记的寡核苷酸的混合物，将所述混合物施加在未修饰的基体上，孵育所述基体，基体干燥，洗涤所述基体，和从基体去除洗涤缓冲液，其中经由物理吸附将寡核苷酸固定在未修饰的基体上。

本发明的另一个实施方案是指用于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的基体上的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含液体和标记的寡核苷酸的混合物，将所述混合物施加在未修饰的基体上，孵育所述基体，基体干燥，洗涤所述基体，和从基体去除洗涤缓冲液，其中经由物理吸附将寡核苷酸固定在未修饰的基体上。

本发明的另一个方面涉及与寡核苷酸附接的标记用于通过物理吸附将标记的寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上的用途。

基体和寡核苷酸之间的吸附通过标记的寡核苷酸的标记来赋予。这从图1至3变得清楚，其显示没有标记的寡核苷酸未固定在coc基体上(图1)，而当用德克萨斯红(图2)或生物素(图3)标记寡核苷酸时，可以检测到包含几个标记的寡核苷酸的清晰斑点，显示标记的寡核苷酸被固定在基体上。这清楚地显示，只有如本文所限定的具有标记的寡核苷酸被固定在聚合物基体诸如coc上。

因此，在本发明中，标记的寡核苷酸的固定通过将标记的寡核苷酸的标记吸附至未修饰的聚合物基体来介导。

本发明的一个额外方面是指通过本文所述的方法实现的微阵列。

如本文所用的术语“微阵列”是指呈现阵列中的捕获分子和周围环境(例如介质、反应溶液、优选杂交溶液)中的潜在相互作用物之间的相互作用的有序或随机阵列。微阵列可以包括可寻址区域的任何二维或三维排列，优选二维排列。典型的微阵列可以含有多个斑点、特征、单个固定的区域或单个分子身份的区域。例如，阵列可以含有多于2、5、10、50、100、500、750、1000、1500、3000、5000、10,000、20,000、40,000、50,000、70,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、750,000、800,000、1,000,000、1,200,000、1,500,000、1,750,000、2,000,000或2,100,000个斑点、特征、捕获分子或单个固定的区域或单个分子身份的区域。这些区域可以包含在小于约20cm²、小于约10cm²、小于约5cm²、小于约1cm²、小于约1mm²、小于约100µm²的区域中。在进一步实施方案中，微阵列内的斑点大小可以在约1至300μm的范围内，例如具有10、50、100、150、200或250μm的大小，或者具有在所述值之间的任何合适的值。在进一步实施方案中，探针(寡核苷酸)密度可以根据需要变化。探针密度的实例是1000至5,000,000个探针/μm²的密度，例如，2000、10,000、50,000、75,000或1,000,000个探针/μm²的探针密度。

在具体实施方案中，此类斑点、特征或单个固定的区域可以包含任何合适的覆盖度，例如，一个或多个特定序列、或基因组或基因组部分中的1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的覆盖度。因此，微阵列可以例如包含相同捕获分子的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多拷贝。可选地或另外，其可以包含捕获分子的变型，例如，错配变体，具有单个或多个核苷酸多态性的变型，单个或多个核苷酸多态性的不同版本，具有不同起始或终止序列(例如，标签、引物结合位点、内切核酸酶识别位点)、但具有相同的核心部分的捕获分子等。

本文提及的微阵列可以包含与寡核苷酸分子附接的“一种或多种”寡核苷酸分子或“一种或多种”目标分子，即微阵列中可以存在一种或多种不同类型的分子。或者，术语“一种或多种”也涉及相同类别或具有相同形式或格式(例如，dna)、但它们在其分子身份(例如，序列)上不相同或相似的寡核苷酸。因此，根据本发明的反应区或捕获区可以包含不同的寡核苷酸。如果根据本发明的反应区或捕获区中存在不同分子身份的寡核苷酸，特别是核酸，则这些寡核苷酸可以是部分相同或部分相似的，即特别是在核酸的情况下，在序列方面具有重叠或可能没有重叠。根据本发明的寡核苷酸可以例如包含、覆盖或代表基因组的任何合适区域或百分比的序列，例如，基因组的约0.00001%至约30%，诸如生物体的基因组、优选地哺乳动物基因组、更优选人类基因组的至少约0.00001、0.00005、0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、0.8、0.9、1、1.5、2、3、4、5、10、15、20或30％，和/或与此类区域互补。此区域或百分比可以包含例如约2至5,000个基因，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、50、100、150、200、350、500、750、1000、1200、1500、2000、2500、3000、4000、5000或超过5000个基因的组。此类基因可位于邻近的基因组区或区域中，或者可以可选地分散在整个基因组中。也设想基因的亚组、组合、模式，例如源自表达数据的模式等。

本发明的进一步的方面涉及包含未修饰的聚合物基体和固定在所述基体上的标记的寡核苷酸的微阵列；其中在所述寡核苷酸和未修饰的聚合物基体之间不存在共价键。

在本发明的一个实施方案中，所述聚合物基体选自聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚降冰片烯、环烯烃共聚物(coc)、氟化聚酰亚胺、聚苯乙烯(ps)、苯乙烯丁二烯共聚物(sbc)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(abs)、苯乙烯丙烯腈(san)、聚乙烯(pe)、聚丙烯(pp)和聚砜。

在本发明的一个优选实施方案中，所述聚合物基体是环烯烃共聚物(coc)。

在另一个优选实施方案中，所述标记的寡核苷酸包含至少一个化学基团与其附接的寡核苷酸，其中所述化学基团适合于将标记的寡核苷酸固定在未修饰的基体上。

在一个具体实施方案中，所述标记的寡核苷酸包含至少一个化学基团与其附接的寡核苷酸，其中所述化学基团优选具有0.1至1000kda、0.1至50kda、0.1至1.5kda、0.15至1kda、0.2至0.8kda的分子量。

在进一步的实施方案中，所述化学基团是这样的化学基团，其优选地选自生物素或磺酰罗丹明101酰基氯(cas号82354-19-6；德克萨斯红)。

在另一个实施方案中，所述标记的寡核苷酸的长度为约2至约2000个、约2至500个、约2至约200个核苷酸、约2至约100个核苷酸、约2至约50个核苷酸。

本发明的一个具体方面涉及包含未修饰的聚合物基体和固定在所述未修饰的聚合物基体上的标记的寡核苷酸的微阵列；其中在所述寡核苷酸和未修饰的聚合物基体之间不存在共价键，且其中通过吸附、具体地物理吸附将寡核苷酸固定在未修饰的聚合物基体上。

本发明的一个具体方面涉及包含未修饰的聚合物基体和固定在所述未修饰的聚合物基体上的标记的寡核苷酸的微阵列；其中在所述寡核苷酸和未修饰的聚合物基体之间不存在共价键，且其中通过吸附、具体地物理吸附将标记的寡核苷酸经由其标记固定在未修饰的聚合物基体上。

本发明的一个具体方面涉及包含未修饰的coc基体和固定在所述未修饰的coc基体上的标记的寡核苷酸的微阵列；其中在所述寡核苷酸和未修饰的coc基体之间不存在共价键。

本发明的一个具体方面涉及包含未修饰的coc基体和固定在所述未修饰的coc基体上的标记的寡核苷酸的微阵列；其中在所述寡核苷酸和未修饰的coc基体之间不存在共价键，且其中标记的寡核苷酸是标记的ssdna。

本发明的一个具体方面涉及包含未修饰的coc基体和固定在所述未修饰的coc基体上的标记的寡核苷酸的微阵列；其中在所述寡核苷酸和未修饰的coc基体之间不存在共价键，且其中通过吸附、具体地物理吸附将寡核苷酸固定在未修饰的coc基体上。

本发明的一个具体方面涉及包含未修饰的coc基体和固定在所述未修饰的coc基体上的标记的寡核苷酸的微阵列；其中在所述寡核苷酸和未修饰的coc基体之间不存在共价键，且其中通过吸附、具体地物理吸附将标记的寡核苷酸经由其标记固定在未修饰的coc基体上。

本发明的一个具体方面涉及包含未修饰的coc基体和固定在所述未修饰的coc基体上的标记的寡核苷酸的微阵列；其中在所述寡核苷酸和未修饰的coc基体之间不存在共价键，且其中用至少一个适合于将标记的寡核苷酸固定至coc未修饰的基体的化学基团标记所述寡核苷酸。

本发明的一个具体方面涉及包含未修饰的coc基体和固定在所述未修饰的coc基体上的标记的寡核苷酸的微阵列；其中在所述寡核苷酸和未修饰的coc基体之间不存在共价键，且其中所述寡核苷酸用至少一个选自发色团或生物素的化学基团标记。

本发明的一个具体方面涉及包含未修饰的coc基体和固定在所述未修饰的coc基体上的标记的寡核苷酸的微阵列；其中在所述寡核苷酸和未修饰的coc基体之间不存在共价键，且其中所述寡核苷酸用至少一个选自磺酰罗丹明101酰基氯(cas号82354-19-6；德克萨斯红)或生物素的化学基团标记。

本发明的一个具体方面涉及包含未修饰的coc基体和固定在所述未修饰的coc基体上的标记的寡核苷酸的微阵列；其中在所述寡核苷酸和未修饰的coc基体之间不存在共价键，其中所述寡核苷酸用至少一个选自磺酰罗丹明101酰基氯(cas号82354-19-6；德克萨斯红)或生物素的化学基团标记，且其中标记的寡核苷酸是标记的ssdna。

在本发明的一个实施方案中，通过物理吸附将标记的寡核苷酸固定在未修饰的基体上。

本发明的进一步的方面涉及诊断试剂盒，其包含根据如本文所述的方法固定的寡核苷酸的阵列和含有确定量的与所述固定的寡核苷酸中的至少一种互补的已知、标记的核酸的对照探针。

本发明的进一步的方面涉及诊断试剂盒，其包含含有根据如本文所述的方法固定的寡核苷酸的微阵列和含有确定量的与所述固定的寡核苷酸中的至少一种互补的已知、标记的核酸的对照探针。

术语“含有确定量的与…互补的已知、标记的核酸的对照探针”涉及充分定义的寡核苷酸，其被提供有标记，优选荧光标记，且用于校准和/或测试或质量检查以阵列的形式存在的固定的寡核苷酸中的至少一种。

一个额外的实施方案是指如上所限定的微阵列用于杂交测定、用于表面扩增、用于定量和/或多重检测dna或rna分子、用于表达分析、用于比较基因组杂交、用于检测单核苷酸多态性或用于基于基因组选择的测序的用途。

本发明的微阵列特别适合于核酸检测，诸如微阵列，杂交测定诸如夹心杂交测定，表面扩增。本发明的基体可以与磁珠组合使用。

为了说明性目的，提供以下实施例和附图。因此，应当理解，实施例和附图不应被视为限制性的。本领域技术人员将清楚地能够设想本文展示的原理的进一步修改。

本发明的另一个方面涉及用于将目标分子固定在未修饰的聚合物基体上的方法，所述方法包括如本文所述的固定标记的寡核苷酸的方法的步骤，其中步骤a)中提供的标记的寡核苷酸还包含与所述寡核苷酸附接的目标分子。

目标分子可以附接至用于固定的标记与其附接的寡核苷酸的相对侧。这意味着，如果在寡核苷酸的3'末端附接用于固定的标记，则目标分子可以附接至寡核苷酸的5'末端。反之亦然，如果在寡核苷酸的5'末端附接用于固定的标记，则目标分子可以附接至寡核苷酸的3'末端。

在一个具体实施方案中，如果目标分子附接至用于固定的标记与其附接的寡核苷酸，则寡核苷酸可以对目标分子没有结合亲和力。在该情况下，寡核苷酸充当接头以将目标分子固定至聚合物基体，并且不参与目标分子和靶分子的结合。

本发明的另一个方面涉及用于将目标分子固定在未修饰的聚合物基体上的方法，所述方法包括如本文所述的固定标记的寡核苷酸的方法的步骤，且此外至少包括步骤：c)将目标分子与其附接的寡核苷酸杂交。

如本文所用的术语“目标分子”是指例如蛋白、肽或抗体、小分子、分子印迹聚合物、蛋白适体或肽适体。“目标分子”可以对靶分子具有结合亲和力。

实施例

实施例1–将ssdna固定在coc基体上

用scienionsciflexarrayers11喷墨打印机在封闭环境中在室温(21℃)和约50％的相对湿度下将含有德克萨斯红标记或生物素标记的ssdna寡核苷酸(40个核苷酸)或生物素标记的、具有20％蔗糖和15mm甜菜碱的1xpbs的印刷缓冲液印刷在伽玛处理的coc基体上。印刷后，将基体保持在该环境中半小时，然后将其转移至温度为37℃的恒温箱中用于干燥过夜。第二天，通过将这些基体倒置在含有洗涤缓冲液的洗涤浴中1分钟(具有0.01%tween20的0.5xpbs)来将它们轻轻洗涤。通过在纸巾上轻轻敲击基体来除去过量液体，并将基体置于干燥柜中1小时(室温，相对湿度~10%)。所述基体现在容易用于进一步组装，并保存在4℃下的密封袋中，并加入二氧化硅珠粒以保持低于10％的湿度以使冷凝最小化。

实施例2–夹心杂交测定

为了测试斑点质量，在具有固定的标记寡核苷酸的基体上进行夹心杂交测定。与用探针标记的磁性颗粒和靶寡核苷酸(溶解在缓冲溶液中)一起进行杂交。通过在特定温度(40℃至60℃)下在缓冲溶液中用磁性脉冲驱动磁性颗粒来促进夹心杂交。用磁石洗掉未结合的磁性颗粒。图4显示具有固定的德克萨斯红标记的寡核苷酸的基体的示意性横截面，磁性颗粒经由探针与德克萨斯红标记的寡核苷酸杂交。在该具体实施方案中，所述寡核苷酸包含在3'末端的20nt长度的间隔物区和在其5'末端的对于探针具有结合活性的20nt长度的区域。因此，所述探针与固定的寡核苷酸和磁性颗粒杂交。

实施例3–磁性颗粒的检测

通过使用ccd照相机的受抑全内反射(f-tir)将结合的磁性颗粒进行成像。来自发光二极管的准直光束(λ=625nm)在全内反射的条件下照射传感器表面。在基体/流体界面处生成所谓的渐逝光场，其以指数方式衰减并仅通过亚波长距离穿透至流体中。在磁性颗粒不存在的情况下，从渐逝光场没有提取光(图1)。当磁性纳米颗粒存在于传感器表面时，所述颗粒吸收并散射部分光，因此使全内反射受抑，从而降低反射光的强度(图2、图3)。将基体表面成像至ccd相机上。

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