用于靶核酸多重检测的双重猝灭测定的制作方法
发明领域
本发明涉及一种基于解链温度测定间接检测多个靶dna序列的qpcr方法。本发明还涉及一种由多个部分构成的试剂盒。
发明背景
通过pcr检测dna样品中的特定序列已成为一种标准方法。该技术用于从基因缺失分析到病原体鉴定以及模板定量的一系列不同目的。通常使用不同颜色的荧光团来检测不同的靶。然而，由于可以容易地彼此区分的荧光团的数目有限，这对可以检测到的特定靶的数目产生限制。
此外，pcr反应期间的dna杂交步骤受离子强度、碱基组成、核酸已经减少到的片段长度、错配程度和变性剂的存在影响。基于dna杂交的技术是在核酸序列测定以及临床诊断、遗传研究和法医实验室分析中非常有用的工具。然而，缺点是大部分依赖于杂交的常规方法可能由于探针和非靶核酸序列之间的非特异性杂交而产生假阳性结果。因此，仍然存在提高它们的可靠性的待解决问题。
韩国首尔的seegene已经开发了一种还可以通过解链曲线分析来适应多重化的技术。如wo2013115442a1中所述，seegene的toce技术基于在水解时释放引物片段的探针。此片段然后需要充当第二人工靶上的引物，其中产生具有特定解链轮廓、可与该特定探针连接的双链靶。虽然该体系也可以通过解链来适应高多重化，但因为要求释放的片段在人工靶上启动并完成第二延伸，所以其固有地比本发明更复杂。在本发明中产生的片段将直接提供标记的解链片段。
荷兰马斯特里赫特的pathofinderbv已开发了一种也可以通过解链曲线分析来适应多重化的技术。如美国专利申请20100297630a1中所述，此体系基于提供2个靶特异性探针，这2个靶特异性探针当在靶上相邻地杂交时可以通过连接酶结合，此结合产生具有特异于特定靶探针的解链轮廓的可解链片段。然而，如美国专利申请20100297630a1所述，此体系不是真正均相的测定，而是需要在第一次pcr反应之后打开样品管来添加例如连接酶溶液。此额外步骤在本发明的方法中是不需要的，并且由于被pcr产物污染的风险而是高度不期望的，并且还涉及附加处理步骤。
罗氏诊断公司(rochediagnostics)已经开发了一种用于脓毒症检测方法和测定法，该方法和测定法也通过解链曲线分析来适应多重化。此体系依赖于fret探针，其中具有相互作用标记的2个探针被设计成与单个靶相邻地结合，在结合的情况下第一探针的荧光团与第二探针相互作用以产生信号。可以设计2个探针，使得当经受温度梯度时，探针可以产生特定的解链曲线。此体系的缺点是解链轮廓必须在特定靶序列内设计，其中本发明的方法提供一旦优化就可附接至任何靶特异性探针的解链标签。此外，由于fret探针需要2个标记，所以相较于每个探针携带一个荧光团的本发明，这样的体系可以适应在使用5个荧光团检测通道的pcr体系上的较低水平的多重化。
多重dna靶检测的其他方法取决于固体表面缀合，例如基于芯片的探针的固体表面缀合。尽管这些基于芯片的方法可能能够区分多种靶核酸序列，但是芯片组装过程是麻烦的并且通常涉及复杂、昂贵和精巧的设备。
因此，仍然需要对多个靶核酸序列的方便、可靠和可再现的检测。此外，需要不受荧光标记数目限制的新颖靶检测方法。此外，还需要降低多重核酸序列分析中的复杂性和步骤数目，从而促进更具成本效益和简单的临床诊断方法、遗传研究方案和法医实验室分析。
发明概要
本发明提供了一种检测多个靶dna序列的简单、方便、可靠和可再现的方法。本发明使用解链曲线测定来按照荧光团检测若干靶序列。通过这种方法，可以用单个荧光团检测众多个靶，和/或可以通过采用不同的解链温度和不同荧光团两者来检测大量的靶。本发明人已经开发了一种双重猝灭测定以与解链曲线测定结合用于使用不同的探测和标记寡核苷酸(pto)和单一捕获和猝灭寡核苷酸(cqo)来对靶dna序列进行多重检测，所述pto各自包含不同的解链温度依赖区(mtdr)。使用本发明的若干cqo和pto进一步增加了可以在单次测定中检测到的靶序列的数目。本发明的构思(被称为meltplex体系)于图1中示出。
本发明通过以下项的组合来防止对靶核酸序列的假阳性检测：1)与靶核酸序列的序列特异性杂交，以及2)靶信号检测所需的激活的标签双链片段的序列特异性酶促释放(图1)。通过激活的标签双链片段的存在而对靶核酸序列进行的此间接测量确保了极好的准确性，但是如果不能完全克服假阳性结果的问题，则准确性会降低。
meltplex体系的一个优点是一个cqo可以检测用数个独特的pto鉴定的多个靶序列。对于每个待检测的靶核酸序列，设计具有mtdr序列(解链温度依赖区)的pto，所述mtdr序列在具有相同荧光团的pto内是独特的。因此，能够仅使用单个荧光标记检测到的靶核酸序列的数目增加。具有与相同cqo相容的相似荧光团的不同pto可被称为pto组，因为它们含有相似和/或相同的荧光标记。每个pto组可以用单一cqo检测，由此形成激活的标签双链体，其中基于由于组中各个pto上的独特mtdr导致的解链温度差异来区分各个激活的标签双链体片段。也可以用单一cqo检测若干pto组，任选地通过在cqo中包含多于一个猝灭剂(quencher)以允许用相同的cqo猝灭众多荧光团。因此，本发明能够增加在测定中可以检测到的靶核酸序列的数目，而不需要使用针对每个检测到的核酸靶核酸序列的不同类型的荧光标记。本发明可以应用针对不同pto组的若干荧光标记，这进一步增加了能够在测定中使用标准实验室设备检测到的靶核酸序列的数目。
此外，本发明的cqo不依赖于所述靶序列。因此，已被证明在某些测定中得到可靠结果的cqo可以在其他测定中重新使用。当设计新的测定时，探针的这种重复使用可以节省大量资源。
污染是基于pcr的技术的主要问题。限制污染风险的一种选择是使用在测定开始后不需要重新打开反应管瓶的技术。本发明不需要在测定开始后重新打开反应管瓶，因此较不易发生污染。
本发明的主要方面涉及一种用于检测靶核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将靶核酸序列与pto(探测和标记寡核苷酸)杂交；所述pto包含(i)包含与所述靶核酸序列基本上互补的核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含与靶核酸序列不互补的核苷酸序列的解链温度决定区(mtdr)，以及(iii)至少一组相互作用标记，包括至少一个荧光团和至少一个猝灭剂；其中所述pto的所述靶向部分能够与所述靶核酸序列杂交，并且所述pto的所述mtdr不与所述靶核酸序列杂交；
(b)将所述pto与cqo(捕获和猝灭寡核苷酸)杂交；其中所述cqo包含(i)捕获部分，其包含与所述pto的mtdr反向互补的核苷酸序列，以及(ii)至少一个猝灭分子；其中所述pto的所述mtdr被配置为与所述cqo的所述捕获部分杂交以形成标签双链体；
(c)使所述标签双链体与具有核酸酶活性的酶接触；其中当所述标签双链体与所述靶核酸序列杂交时，所述具有核酸酶活性的酶诱导所述标签双链体的切割，从而释放激活的标签双链体片段，所述激活的标签双链体片段包含pto片段，所述pto片段包含与所述cqo的所述捕获部分杂交的所述mtdr和所述至少一个荧光团，其中所述pto片段与所述cqo的所述捕获部分杂交；
(d)使所述激活的标签双链体片段解链和/或杂交以获得来自所述至少一个荧光团的信号；以及
(e)通过测量来自所述至少一个荧光团的所述信号来检测所述激活的标签双链体片段；其中所述信号指示所述靶核酸序列的存在。
所述方法的步骤a)和b)可以按任何顺序进行，即标签双链体可以在将pto/标签双链体与靶核酸结合之前形成。
在另一个实施方案中，步骤(c)和(b)被互换，因此所述方法包括以下步骤：(a)将pto与靶杂交，(c)使pto和靶与具有核酸酶活性的酶接触，从而释放激活的pto，以及(b)将所述激活的pto与cqo杂交，从而形成激活的标签双链体，随后如上文所公开进行步骤(d)和(e)。
可以重复所述方法的各步骤。
记录激活的pto或激活的标签双链体的存在。
记录标签双链体解链(步骤d)时的温度。
本发明的测定具有多种应用。应用的非详尽清单包括：
●人和/或兽医诊断
●食品和/或饲料质量和安全性
●环境监测
●科学研究
本发明的测定可以作为由多个部分构成的试剂盒出售。因此，本发明的一个方面涉及用于检测如本文所述的靶核酸序列的由多个部分构成的试剂盒，所述试剂盒包括：
i.任选地至少一个本文所述的pto，以及
ii.至少一个本文所述的cqo，以及
iii.关于如何检测靶核酸序列的说明。
因此，本发明的一个实施方案是用单一cqo检测一个或多个靶核酸序列。
附图简述
图1：本发明的一个实施方案的非限制性图解。
图2：ntc(无模板对照)pcr反应产物的解链曲线分析：如期望的，在阴性对照中dec486p不产生解链曲线，而所有其他设计在ntc反应中显示出增大水平的解链曲线信号。(结果一式三份地进行——示出为单重方式)。○：dec486p，△：dec487p，x：dec488p，□：dec489p，◇：dec490p。
图3：针对标记探针dec486p的具有和不具有模板的pcr反应产物的解链曲线分析。在阴性对照中ntc(x)不产生解链曲线，但是存在与使用模板(◇)的反应明显可区分的信号。此外，在没有猝灭探针(○)的反应中未看到解链曲线。(结果一式三份地进行——示出为单重方式)。
图4：针对标记探针dec487p的具有和不具有模板的pcr反应产物的解链曲线分析。在阴性对照中ntc(x)产生小解链曲线，但是存在与使用模板(◇)的反应明显可区分的信号。此外，在没有猝灭探针(○)的反应中未看到解链曲线。(结果一式三份地进行——示出为单重方式)。
图5：针对标记探针dec488p的具有和不具有模板的pcr反应产物的解链曲线分析。在阴性对照中ntc(x)产生适度的解链曲线，但是存在与使用模板(◇)的反应明显可区分的信号。此外，在没有猝灭探针(○)的反应中未看到解链曲线。(结果一式三份地进行——示出为单重方式)。
图6：针对标记探针dec489p的具有和不具有模板的pcr反应产物的解链曲线分析。在阴性对照中ntc(x)产生清晰的解链曲线，但是存在与使用模板(◇)的反应明显可区分的信号。此外，在没有猝灭探针(○)的反应中未看到解链曲线。(结果一式三份地进行——示出为单重方式)。
图7：针对标记探针dec490p的具有和不具有模板的pcr反应产物的解链曲线分析。在阴性对照中ntc(x)产生显著的解链曲线，其与使用模板(◇)的反应不是明显可区分的。此外，在没有猝灭探针(○)的反应中未看到解链曲线。(结果一式三份地进行——示出为单重方式)。
图8：阳性样品上标记探针dec486p至dec490p的q-pcr扩增曲线。○：dec486p，△：dec487p，x：dec488p，□：dec489p，◇：dec490p，实线：dec464。尽管标记探针的信号强度低于taqman型探针，但所有探针均明显地产生ct值介于16与20之间的阳性信号读数。
图8a：是本发明的一个实施方案的非限制性图解。
图9：靶阳性和ntc(无模板对照)pcr反应产物的解链曲线分析：如期望的，dec500p在阳性样品中产生解链曲线而在阴性对照中不产生解链曲线(结果一式三份进行——示出为单重方式)。□：dec500p，-：dec500pntc(无模板对照)
图10：靶阳性和ntc(无模板对照)pcr反应产物的扩增曲线：如期望的，dec500p在阳性样品中产生扩增曲线而在阴性对照中不产生扩增曲线(结果一式三份进行——示出为单重方式)。□：dec500p，-：dec500pntc(无模板对照)
图11：靶阳性和ntc(无模板对照)pcr反应产物的解链曲线分析：如期望的，dec502p在阳性样品中产生解链曲线而在阴性对照中不产生解链曲线(结果一式三份进行——示出为单重方式)。□：dec500p，◇：dec502p，-：dec502pntc(无模板对照)
图12：靶阳性和ntc(无模板对照)pcr反应产物的扩增曲线：如期望的，dec502p在阳性样品中产生扩增曲线而在阴性对照中不产生扩增曲线(结果一式三份进行——示出为单重方式)。□：dec500p，◇：dec502p，-：dec502pntc(无模板对照)
图13：靶阳性和ntc(无模板对照)pcr反应产物的解链曲线分析：如期望的，dec503p在阳性样品中产生解链曲线而在阴性对照中不产生解链曲线(结果一式三份进行——示出为单重方式)。x：dec503p，-：dec503pntc(无模板对照)
图14：靶阳性和ntc(无模板对照)pcr反应产物的扩增曲线：如期望的，dec503p在阳性样品中产生扩增曲线而在阴性对照中不产生扩增曲线(结果一式三份进行——示出为单重方式)。x：dec503p，-：dec503pntc(无模板对照)
图15：如所期望的，使用dec500p和dec502p的靶阳性和ntc(无模板对照)pcr反应的解链曲线分析在阳性样品中产生了2个单独可区分的解链曲线，而在阴性对照中则不产生(结果一式三份进行——示出为单重方式)。○：dec500p+dec502p，-：dec500p+dec502pntc(无模板对照)。
图16：如所期望的，使用dec500p和dec502p的靶阳性和ntc(无模板对照)pcr反应产物的扩增曲线在阳性样品中产生扩增曲线，而在阴性对照中则不产生(结果一式三份进行——示出为单重方式)。○：dec500p+dec502p，-：dec500p+dec502pntc(无模板对照)。
图17：使用dec500p和dec503p的靶阳性和ntc(无模板对照)pcr反应产物的解链曲线分析在阳性样品中产生了2个单独可区分的解链曲线，而在阴性对照中则不产生(结果一式三份进行——示出为单重方式)。△：dec500p+dec503p，-：dec500p+dec503pntc(无模板对照)
图18：如所期望的，使用dec500p和dec503p的靶阳性和ntc(无模板对照)pcr反应产物的扩增曲线在阳性样品中产生扩增曲线而在阴性对照中不产生扩增曲线(结果一式三份进行——示出为单重方式)。△：dec500p+dec503p，-：dec500p+dec503pntc(无模板对照)
图19：靶阳性和ntc(无模板对照)pcr反应产物的解链曲线分析：如期望的，rmd7p在阳性样品中产生解链曲线而在阴性对照中不产生解链曲线(结果一式三份进行——示出为单重方式)。○：rmd7p，-：rmd7pntc(无模板对照)。
图20：靶阳性和ntc(无模板对照)pcr反应产物的扩增曲线：如期望的，rmd7p在阳性样品中产生扩增曲线而在阴性对照中不产生扩增曲线(结果一式三份进行——示出为单重方式)。○：rmd7p，-：rmd7pntc(无模板对照)。
图21：靶阳性和ntc(无模板对照)pcr反应产物的解链曲线分析：如期望的，rmd8p在阳性样品中产生解链曲线而在阴性对照中不产生解链曲线(结果一式三份进行——示出为单重方式)。x：rmd8p，-：rmd8pntc(无模板对照)。
图22：靶阳性和ntc(无模板对照)pcr反应产物的扩增曲线：如期望的，rmd8p在阳性样品中产生扩增曲线而在阴性对照中不产生扩增曲线(结果一式三份进行——示出为单重方式)。x：rmd8p，-：rmd8pntc(无模板对照)。
图23.rmd测定的平均cq值，作为聚合酶浓度的函数绘制成曲线图。x轴：任意单位。
图24.mvalidprime测定的平均cq值，作为聚合酶浓度的函数绘制成曲线图。x轴：任意单位，其中1是制造商推荐的浓度。
图25.步骤2(95℃)中的rmd扩增曲线的幅度为聚合酶浓度的函数。x轴：任意单位，其中1是制造商推荐的浓度。
图26.步骤2(95℃)中的mvalidprime扩增曲线的幅度为聚合酶浓度的函数。x轴：任意单位，其中1是制造商推荐的浓度。
图27.rmd探针/猝灭剂双链体的解链温度作为聚合酶浓度的函数。x轴：任意单位，其中1是制造商推荐的浓度。
图28：(a)靶阳性和ntc(无模板对照)pcr反应产物的扩增曲线：如期望的，dec486p在对应于靶浓度的阳性样品中产生具有cq值的扩增曲线，而在阴性对照中则不产生(结果一式两份进行——示出为单重方式)。△：5倍稀释液，x：25倍稀释液，□：125倍稀释液，◇：625倍稀释液，○：3125倍稀释液，-：15625倍稀释液，ntc：(无模板对照)。(b)靶阳性和ntc(无模板对照)pcr反应产物的解链曲线分析：如期望的，dec486p在对应于靶浓度的阳性样品中产生解链曲线幅度，而在阴性对照中则不产生(结果一式两份进行——示出为单重方式)。△：5倍稀释液，x：25倍稀释液，□：125倍稀释液，◇：625倍稀释液，○：3125倍稀释液，-：15625倍稀释液，ntc：(无模板对照)。
发明详述
多重pcr的主要挑战是使用简单、方便且可靠的方法容易地检测多个靶dna序列。本发明人已经开发了一种双重猝灭测定法以与解链曲线测定结合用于按照标记物(即按照荧光团)检测若干种靶dna序列。本发明的非限制性构思于图1中示出。
定义
如本文所用的术语“双重猝灭测定”是指对于至少一个荧光团使用至少两个猝灭剂。在一个实施方案中，一个猝灭剂位于cqo上，而另一个猝灭剂位于pto上。在一个实施方案中，荧光团位于pto上。
如本文所用的术语“相互作用标记”或“一组相互作用标记”是指至少一个荧光团和至少一个猝灭剂，它们当相邻定位时能够相互作用。当相互作用标记相邻定位时，猝灭剂能够猝灭荧光团信号。该相互作用可以由荧光共振能量转移(fret)介导。
如本文所用的术语“相邻定位”是指两个对象之间的物理距离。如果荧光团和猝灭剂相邻地定位，则猝灭剂能够部分或全部地猝灭荧光团信号。fret猝灭通常可以在至多约
如本文所用的术语“探测和标记寡核苷酸”或“pto”是指包含至少一组相互作用标记的寡核苷酸。本发明的pto被配置为与靶核酸序列杂交。pto包括靶向部分、“解链温度决定区”或“mtdr”(见下文定义)，以及任选地在靶向部分与mtdr之间的接头。
如本文所用的术语“pto组”是指具有相同组相互作用标记的多个pto，其中该组中的每个pto具有独特的靶向序列和mtdr区。一组中的每个pto可以被配置用于检测不同的靶核酸序列，并且独特的mtdr有助于利用如本文所述的解链温度来区分该组中各个pto。
如本文所用的术语“捕获和猝灭寡核苷酸”或“cqo”是指包含至少一个猝灭剂和捕获部分的寡核苷酸。cqo的捕获部分被配置为与本发明的pto杂交。
如本文所用的术语“标签双链体”是指杂交的pto和cqo。pto还可以与靶核酸序列杂交。
本文所用的术语“标签双链体片段”或“激活的标签双链体片段”或激活的标签双链体是指杂交的pto片段和cqo，其中不存在pto的猝灭剂。作为具有核酸酶活性的酶诱导标签双链体的切割和pto猝灭剂的释放的结果，pto的猝灭剂已被释放。“激活的pto”是指猝灭剂已被去除的pto。激活的pto的存在可以使用qpcr和/或实时pcr来测量。根据本文公开的方法的步骤顺序，测量激活的pto或激活的标签双链体的存在。在优选实施方案中，仅激活的标签双链体能够通过实时pcr检测到。在最优选的实施方案中，由于pto荧光团被cqo猝灭剂完全猝灭，所以仅激活的标签双链体能够通过实时pcr检测。在其他实施方案中，在由激活的pto检测到任何信号之后校准测定。
如本文所用的术语“荧光标记”或“荧光团”是指在光激发时可以重新发射光的荧光化学化合物。荧光团吸收特定波长的光能并重新发射更长波长的光。吸收的波长、能量转移效率和发射前的时间取决于荧光团结构及其化学环境，因为分子在其激发态时与周围的分子相互作用。最大吸收(≈激发)和发射的波长(例如，吸收/发射＝485nm/517nm)是用于指代给定荧光团的典型术语，但考虑完整光谱可能也是重要的。
如本文所用的术语“猝灭(quench/quenching)”是指降低给定物质诸如荧光团的荧光强度的任何方法。猝灭可以由荧光共振能量转移(fret)介导。fret基于供体(例如荧光团)和受体(例如猝灭剂)的跃迁偶极之间的经典偶极-偶极相互作用，并且取决于供体-受体距离。fret通常可以发生在至多
如本文所用的术语“猝灭剂”是指能够猝灭给定物质诸如荧光团的化学化合物。
在多重pcr中，可以检测多于一个靶核酸序列。
如本文所用的术语“解链温度决定区”或“mtdr”是指位于pto的5'端的多核苷酸区。mtdr中多核苷酸的性质和/或数目对于例如包含pto片段和cqo的激活的标签双链体的解链温度具决定性。同样，mtdr对于例如包含pto片段和cqo的激活的标签双链体的杂交温度具决定性。
如本文所用的术语“解链温度”或“tm”是指dna双链体的一半将解离而变成单链的温度，因此指示双链体稳定性。影响tm的主要因素是盐浓度、dna浓度、ph和变性剂(诸如甲酰胺或dmso)的存在。诸如序列、长度和杂交条件等其他影响因素也很重要。序列的gc含量和盐浓度可以很好地指示引物的tm。使用如kibbe等人在2007年描述的最邻近热力学理论来计算在本发明中提及的解链温度。相应的tm计算器可在url:http://basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html处获得。已经基于800nmcqo(“引物”)和50nm(na+)计算本发明中给出的tm值。在包含腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和/或鸟嘌呤的类似物的寡核苷酸的解链温度计算中，将类似物用其相应的核酸替代。计算解链温度时不应考虑寡核苷酸上的荧光团和猝灭剂。可以通过加热dna双链体或通过冷却(杂交)两条基本上互补的单链dna链来进行解链温度的测定。
如本文所用的术语“变性”是通过破坏dna的互补碱基之间的氢键而变成单链的解离。其也可以指pcr反应循环事件，并且可以例如包括将反应加热至90℃至100℃，持续3至240秒。
如本文所用的术语“即用丸粒”是指基本上无水的组合物，其包含本发明的至少一个pto和/或至少一个cqo。
如本文所用的术语“背景解链曲线生成”是指在解链曲线分析期间的背景信号。如果pto上的至少一个荧光团的信号未被pto的至少一个猝灭剂完全猝灭，则可能会存在背景信号。
如本文所用的术语“tina”是指扭曲插入核酸，并且是如在美国专利9,102,937中描述的一组核酸插入分子。
如本文所用的术语“锁核酸”(lna)是指经修饰的rna核苷酸。lna核苷酸的核糖部分由连接2'氧和4'碳的额外桥修饰。桥将核糖“锁”在3'-内型(north)构象中，其通常存在于a型双链体中。lna核苷酸可以在需要时与寡核苷酸中的dna或rna残基混合，并根据watson-crick碱基配对法则与dna或rna杂交。此类寡聚物是化学合成的并且可商购获得。锁定的核糖构象增强了碱基堆积和主链预组织。这通过增加双链体的热稳定性而显著地增加了寡核苷酸的杂交性质。lna及其合成方法为本领域中的技术人员已知，并且描述于例如欧洲专利ep1015469和ep1015469中。
如本文所用的术语“反向互补”表示核酸序列能够与作为其反向互补序列的另一核酸序列杂交。例如，序列5’-n1n2n3n4...nx-3’的反向互补序列是5’-nx’...n4’n3’n2’n1’-3’，其中nx’、n4’、n3’、n2’、n1’表示分别与nx、n4、n3、n2、n1互补的核苷酸。
靶检测
本发明涉及一种新颖的双重猝灭测定法，其允许每个荧光标记物同时检测多个靶核酸。样品中多个靶核酸序列的存在导致形成多个标签双链体片段，所述多个标签双链体片段可以基于标签双链体片段解链温度和/或杂交温度的差异来区分。标签双链体包含杂交的pto和cqo。当每个激活的标签双链体片段解链时，获得来自pto的标记的信号。因此，在特定温度下的信号指示pto所特异于的靶序列的存在。当每个激活的标签双链体片段杂交时，来自pto的标记的信号被猝灭。因此，在特定温度下的猝灭信号指示pto所特异于的靶序列的存在。本发明的基本构思于图1中示出。本发明通过以下方式的组合来防止假阳性信号：1)利用pto靶向部分与靶核酸序列进行序列特异性杂交，以及2)利用在靶序列的上游延伸寡核苷酸的聚合酶的核酸酶活性，序列特异性地酶促释放靶信号检测所需的激活的标签双链体片段。通过激活的标签双链体片段的存在间接测量靶核酸序列确保了极好的准确性并且克服了假阳性的问题。单一cqo可以与许多pto和/或许多组pto杂交。因此，本发明涉及在单一cqo的辅助下检测一种或多种此类多重核酸。
多个靶核酸序列的解链温度介导鉴定
使用一个cqo检测具有独特mtdr的若干pto产生更简单的测定设置，其可以按照荧光团(例如按照pto组)检测若干靶核酸序列。能够使用一个荧光团区分的pto组中的pto的数目取决于用于在激活的标签双链体片段解链时检测荧光标签信号的分析设备的灵敏度。在此处通过举例方式提供的简单设置中：可以使用一个cqo来鉴定pto组中的至少三个pto；因此，使用具有两种不同荧光团的两个pto组可以有助于在单次反应中检测至少6个pto。每个pto指示靶核酸序列的存在。通过使用具有不同荧光标签的三个或三个以上pto组，可以进一步增加待鉴定的靶数目。单一cqo当然可以能够与两个以上的pto杂交，诸如三个、四个或四个以上pto。pto组可以包括2个、3个、4个、5个、6个、7个或7个以上pto，并且可以使用单一cqo来检测这些pto中的每一个。同时，也可以使用相同的cqo来检测其他pto组(具有不同荧光团的pto)。以这种方式，可以使用单一cqo来检测多个靶。在一个实施方案中，单一cqo能够因此检测2个、4个、6个、8个、10个、15个、20个、30个、40个、50个或50个以上pto，因此该测定能够检测相应数目的靶核酸。
本发明的双重猝灭测定的设置产生了一种用于靶核酸的多重检测的简单可靠的测定法。本发明的简单测定法具有多种应用。本发明的测定法的非详尽应用清单可以是：
●使用本发明的方法用于人和/或兽医诊断。例如，对来自受试者的身体样品中至少一种微生物诸如病原体或致癌基因或微卫星的靶核酸的临床鉴定和/或定量。
●使用本发明的方法进行环境监测。例如，对来自任何样品(例如水样品)中的至少一种(微)生物体的靶核酸的鉴定和/或定量。
●使用本发明的方法用于食品和/或饲料质量和安全性测定，例如对来自任何样品(诸如饲料和/或食物产品诸如饮料样品)中的至少一种生物体的靶核酸的鉴定和/或定量。
●使用本发明的方法进行科学研究。
在一个主要方面，本发明涉及一种用于检测靶核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤(a)将靶核酸序列与pto(探测和标记寡核苷酸)杂交；所述pto包含(i)包含与所述靶核酸序列基本上互补的核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含与所述靶核酸序列不互补的核苷酸序列的解链温度决定区(mtdr)，以及(iii)至少一组相互作用标记，包括至少一个荧光团和至少一个猝灭剂；
步骤(b)将所述pto与cqo(捕获和猝灭寡核苷酸)杂交；其中所述cqo包含(i)捕获部分，其包含与所述pto的mtdr反向互补的核苷酸序列，以及(ii)至少一个猝灭分子；其中所述pto的mtdr被配置为与所述cqo的捕获部分杂交以形成标签双链体；
步骤(c)使所述标签双链体与具有核酸酶活性的酶接触；其中当所述标签双链体与靶核酸序列杂交时，所述具有核酸酶活性的酶诱导所述标签双链体的切割，从而释放激活的标签双链体片段，所述激活的标签双链体片段包含pto片段，所述pto片段包含与cqo的捕获部分杂交的mtdr和至少一个荧光团；
步骤(d)使所述激活的标签双链体片段解链和/或杂交以获得来自所述至少一个荧光团的信号，以及
步骤(e)通过测量来自所述至少一个荧光团的信号来检测所述激活的标签双链体片段；其中所述信号指示所述靶核酸序列的存在。
所述方法的任何本文实施方案的步骤(a)、(b)和(c)可以形成pcr反应的一部分。添加一组寡核苷酸引物，所述组寡核苷酸引物将扩增靶序列。此扩增将由于存在具有外切核酸酶活性的聚合酶而导致由此激活的pto或激活的标签双链体的释放。术语激活的是指pto上猝灭剂不存在。可以记录/检测激活的pto或激活的标签双链体的任何存在。如果pcr反应是qpcr反应，则可以定量激活的pto或激活的标签双链体的量。所述寡核苷酸引物对包含与所述靶核酸互补并引发与所述靶核酸互补的第一延伸产物的合成的第一引物，以及与所述第一延伸产物互补并引发第二延伸产物的合成的第二引物。pto可与靶核苷酸序列杂交，尤其与扩增产物杂交。
在一个实施方案中，检测激活的pto和/或激活的标签双链体的存在。在另一个实施方案中，定量激活的pto和/或激活的标签双链体的量。激活的pto和/或激活的标签双链体的存在的检测和/或定量可以是一旦激活的pto和/或激活的标签双链体形成就可以包括的任选步骤。
步骤(d)和(e)构成了解链测定的一部分，其中基于激活的标签双链体的tm来确定靶的存在和/或不存在。解链测定可以在pcr机中进行。
步骤(a)和(b)可以任何顺序发生。因此，在本发明的一个实施方案中，本文所述的方法包括以下步骤：
步骤(b)将pto(探测和标记寡核苷酸)与cqo(捕获和猝灭寡核苷酸)杂交；所述pto包含(i)包含与所述靶核酸序列基本上互补的核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含与所述靶核酸序列不互补的核苷酸序列的解链温度决定区(mtdr)，以及(iii)至少一组相互作用标记，包括至少一个荧光团和至少一个猝灭剂；并且其中所述cqo包含(i)捕获部分，其包含与所述pto的mtdr反向互补的核苷酸序列，以及(ii)至少一个猝灭分子；其中所述pto的所述mtdr被配置为与所述cqo的所述捕获部分杂交以形成标签双链体；
步骤(a)将所述靶核酸序列与标签双链体的pto杂交；
步骤(c)使所述标签双链体与具有核酸酶活性的酶接触；其中当所述标签双链体与所述靶核酸序列杂交时，所述具有核酸酶活性的酶诱导所述标签双链体的切割，从而释放激活的标签双链体片段，所述激活的标签双链体片段包含pto片段，所述pto片段包含与cqo的捕获部分杂交的mtdr和至少一个荧光团；
步骤(d)使所述激活的标签双链体片段解链和/或杂交以获得来自所述至少一个荧光团的信号，以及
步骤(e)通过测量来自所述至少一个荧光团的信号来检测所述激活的标签双链体片段；其中所述信号指示所述靶核酸序列的存在。
在另一个实施方案中，步骤(b)和步骤(c)以相反顺序进行。因此，在本发明的一个实施方案中，本文所述的方法包括以下步骤：
步骤(a)将靶核酸序列与pto(探测和标记寡核苷酸)杂交；所述pto包含(i)包含与所述靶核酸序列基本上互补的核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含与所述靶核酸序列不互补的核苷酸序列的解链温度决定区(mtdr)，以及(iii)至少一组相互作用标记，包括至少一个荧光团和至少一个猝灭剂；
步骤(c)使所述杂交的pto与具有核酸酶活性的酶接触；其中当所述pto与所述靶核酸序列杂交时，所述具有核酸酶活性的酶诱导所述pto的切割，从而释放激活的pto片段，所述激活的pto片段包含所述mtdr和所述至少一个荧光团；
步骤(b)将所述激活的pto与cqo(捕获和猝灭寡核苷酸)杂交；其中所述cqo包含(i)捕获部分，其包含与所述pto的mtdr反向互补的核苷酸序列，以及(ii)至少一个猝灭分子；其中所述pto的所述mtdr被配置为与所述cqo的所述捕获部分杂交以形成激活的标签双链体；
步骤(d)使所述激活的标签双链体片段解链和/或杂交以获得来自所述至少一个荧光团的信号，以及
步骤(e)通过测量来自所述至少一个荧光团的信号来检测所述激活的标签双链体片段；其中所述信号指示所述靶核酸序列的存在。
在所有的测定中，可以重复这些步骤。具体地，以上针对各种测定所示的顺序的步骤(a)和(c)可以重复一次或多次。重复次数可以如进行pcr反应所惯用的。
记录标签双链体在所述方法的步骤(d)中解链的温度。因此，在本发明的一个实施方案中，步骤(d)包括：
步骤(d)使所述激活的标签双链体片段解链和/或杂交以获得来自所述至少一个荧光团的信号，以及记录所述激活的标签双链体片段的解链温度。
在一个实施方案中，上述方法还包括重复步骤(a)-(b)、(a)-(c)、(a)-(d)和/或(a)-(e)，其中在重复循环之间变性。因此，在以步骤(b)开始的一个实施方案中，重复步骤(b)-(a)、(b)-(c)和/或(b)至(e)，其中[smei]在重复循环之间变性。在另一个实施方案中，各步骤在一个反应容器中进行，或者步骤(a)-(e)或(b)-(e)中的一些在一个或多个分开的反应容器中进行。在一个以步骤(a)、(c)和(b)开始的实施方案中，可以通过重复步骤(a)-(c)、(a)-(b)、(a)-(d)和/或(a)-(e)并在重复循环之间变性来重复各步骤。在所有方法的另一个实施方案中，步骤(a)、(b)和(c)同时发生或大致同时发生且/或步骤(d)和(e)同时发生或大致同时发生。
说明两个靶序列的检测的非限制性实例可以是：
一种混合物，其包含：
1)pto#1，其包含靶向部分#1和被配置以产生50℃的解链温度的mtdr#1，其中pto#1可以与靶核酸序列#1杂交，以及
2)pto#2，其包含靶向部分#2和被配置以产生60℃的解链温度的mtdr#2，其中pto#2可以与靶核酸序列#2杂交，以及
3)cqo，其配置为与如上文所述的mdtr#1和mdtr#2杂交。
在靶核酸序列#1和靶核酸序列#2的存在下，本发明的方法产生激活的标签双链体片段#1，其中cqo与pto#1的mtdr#1杂交；和激活的标签双链体片段#2，其中cqo与pto#2的mtdr#2杂交。当在某一温度范围内解链包含激活的标签双链体片段#1和标签双链体片段#2的混合物时，当温度达到50℃时产生第一信号，并且当温度达到60℃时产生第二信号。在此简化实例中，第一信号(在50℃时)指示靶核酸序列#1的存在，并且第二信号指示靶核酸序列#2的存在。因此，使用一个荧光团能够检测至少两个不同的靶。技术人员可以容易地看出如何通过本发明的方法来测定众多个靶。
本发明还可以包括包含至少一组相互作用标记的至少一个标签双链体或dna双链体，所述组相互作用标记包括至少一个荧光团和至少一个猝灭剂，所述猝灭剂可用作对照样品以例如用于校准分析设备的tm。寡核苷酸的tm可以根据例如盐浓度、dna浓度、ph和变性剂(诸如甲酰胺或dmso)的存在而变化。如果要分析的样品含有不同的即各种盐浓度，则可能需要包括对照样品。在一个实施方案中，本文所述的方法还包括分析对照样品和/或对照标签双链体。在另一个实施方案中，本文所述的方法还包括分析对照样品和/或对照标签双链体以校准分析设备的tm输出。因此，在不存在靶序列的情况下，本发明的方法将检测pto和未因pto上的猝灭剂去除而被激活的标签双链体的存在。如本领域的技术人员已知：当如本文所公开的那些测定进行测定时，可以包括阴性对照(不存在靶)和阳性对照(存在靶)。所述对照可用于校准测定。用于基因组dna的存在的市售对照的一个实例是validprime:http://www.tataa.com/wp-ontent/uploads/2012/10/tataa-manualvalidprimeprobev011.pdf。
如本领域的技术人员已知，双链体的解链温度通常不取决于序列的性质，而是取决于各个核苷酸的相对量。技术人员还知晓避免可能导致可能妨碍反应的二级或三级结构生成的特定序列。如实施例中所示，本发明方法利用具有不同序列的mtdr作用。
mtdr包含与靶核酸序列不互补的核苷酸序列。在此背景下，术语“不互补”将被技术人员理解为是指在正常pcr条件和/或严格条件下与靶核酸序列基本上不互补，即基本上不能杂交的序列。
类似地，术语“与靶核酸序列基本上互补的核苷酸序列”是指能够以用聚合酶延伸为有效的或甚至可行的方式与靶核酸序列杂交的核苷酸序列。如对于技术人员将显而易见的，可以存在一些错配，前提条件是它们不会妨碍核苷酸序列与靶核酸序列的杂交到不能用聚合酶延伸的程度。
pto
针对要鉴定的各个靶核酸序列，获得配置为与各个靶核酸序列杂交的pto。每个pto具有mtdr，所述mtdr在共用相同或相似的荧光团的pto中是独特的。pto的mtdr对于激活的标签双链体片段的解链温度具决定性。每个标签双链体片段包含具有唯一mtdr和至少一个荧光团的pto片段，其中pto片段的mtdr与cqo的捕获部分杂交。独特的mtdr意指赋予标签双链体和/或标签双链体片段的解链温度具独特性的mtdr。因此，独特的mtdr在一组pto中是独特的。独特的mtdr因此可以用于具有不同标记/荧光团的若干pto中。
在一个实施方案中，靶向部分位于pto的5'端。在另一个实施方案中，mtdr位于pto的3'端。
在另一个实施方案中，pto包含非核酸分子和/或核酸类似物。
解链温度决定区(mtdr)
形成激活的标签双链体片段的pto的mtdr的长度改变了所述标签双链体片段的解链温度。使用短mtdr区(例如短于10个核酸)将产生低解链温度。本发明人已使用不同长度(诸如约16至约40个核酸)的mtdr。然而，本发明的mtdr区可以包含5至100个核酸和/或核酸类似物，诸如10至80个，诸如15至70个，优选诸如13至60个，更优选诸如16至39个核酸和/或核酸类似物。因此，在本发明的一个实施方案中，mtdr包含5至50个核酸和/或核酸类似物，诸如10至40个，诸如13至30个核酸和/或核酸类似物。当使用长mtdr区(例如超过50个核酸)时，应注意避免在mtdr本身内形成二级结构。在一个优选实施方案中，本发明的mtdr区包含13至25个核酸和/或核酸类似物，诸如锁核酸(lna)。核酸类似物的具体实例还包括但不限于碱基对组合形式的以下碱基：iso-c/iso-g、iso-dc/iso-dg。
在一个实施方案中，步骤(a)包括将靶核酸序列与pto杂交；所述pto包含(i)包含与靶核酸序列基本上互补的杂交核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含与靶核酸序列不互补的核苷酸序列的mtdr，其中所述mdtr包含5至50个核酸和/或核酸类似物，诸如10至40个，诸如13至30个核酸和/或核酸类似物，以及(iii)至少一组相互作用标记，包括至少一个荧光团和至少一个猝灭剂；其中pto的靶向部分被配置为与靶核酸序列杂交，并且pto的mtdr不被配置为与靶核酸序列杂交。
本发明的一个优点是一个cqo可以检测由多个独特的pto鉴定的多个靶序列。对于要检测的每个靶核酸序列，设计具有mtdr序列的pto，所述mtdr序列对于具有相同或相似荧光标记的pto是独特的，如果这些不同的pto含有相似和/或相同的荧光标记，则它们可被称为pto组。每个pto组可以用单一cqo检测，由此形成激活的标签双链体片段，其中基于由于组中各个pto上的独特mtdr导致的解链温度差异来区分激活的标签双链体片段。因此，能够仅使用单个荧光标记来检测的靶核酸序列的数量增加。
在另一个实施方案中，对于每个可区分的荧光标记，本文所述的方法可以基于靶核酸序列的相应标签双链体片段的解链温度差异来将至少一个靶核酸序列彼此区分，诸如至少两个、诸如至少三个、诸如至少四个、诸如至少五个、诸如至少十个靶核酸序列，其中每个标签双链体片段的解链温度由mtdr的长度和组成决定。在另一个实施方案中，如本文所述的mtdr的长度和/或组成决定了如上文所述的激活的标签双链体片段的解链温度。激活的标签双链体片段的解链温度可以是任何温度；然而，优选是高于室温的温度。pcr反应在通常具有接近100℃的沸点的水性缓冲液中进行。因此，在一个实施方案中，本文所述的激活的标签双链体片段的解链温度在30℃至100℃之间，诸如在35℃至90℃之间，诸如在40℃至75℃之间，诸如在45℃至75℃之间。在一个优选实施方案中，所述激活的标签双链体片段的解链温度在35℃至90℃之间，诸如在50℃至85℃之间。在另一个实施方案中，形成标签双链体片段的pto的mtdr被配置为产生在30℃至100℃之间，诸如在35℃至80℃之间，诸如在40℃至75℃之间，诸如在45℃至75℃之间的激活的标签双链体片段的解链温度。在一个优选实施方案中，形成标签双链体片段的pto的mtdr被配置成产生在50℃至75℃之间，诸如在50℃至70℃之间的解链温度。优选选择一组pto的mtdr，使得容易检测和记录它们各自的解链温度。因此，一组pto的mtdr各自的解链温度可以相差2、3、4、5、6、7、8、9、10度或10度以上。
在一个实施方案中，步骤(a)包括将靶核酸序列与pto杂交；所述pto包含(i)包含与靶核酸序列基本上互补的核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含与靶核酸序列不互补的核苷酸序列的mtdr，其中所述mdtr被配置为产生在50℃至75℃之间的解链温度，诸如在50℃至70℃之间，以及(iii)至少一组相互作用标记，包括至少一个荧光团和至少一个猝灭剂；其中pto的靶向部分被配置为与靶核酸序列杂交，并且pto的mtdr不被配置为与靶核酸序列杂交。
接头分子
pto还可以包含接头分子，所述接头分子与靶核酸序列和cqo不互补，位于pto的靶向部分与mtdr之间。因此，在一个实施方案中，如本文所述的pto还包含位于pto的靶向部分与mtdr之间的接头分子。
在一些实施方案中，接头是与靶核酸序列和cqo不互补的接头，并且其中接头分子包含1至200个核苷酸，诸如1至50个核苷酸，诸如1至30个核苷酸，诸如2至20个核苷酸，诸如约4至14个核苷酸，诸如6至13个核苷酸，诸如8至12个核苷酸，诸如9至12个核苷酸，诸如11个核苷酸。接头分子可以包含以下项或由以下项组成：非核酸，诸如非天然或其他有机化合物，诸如碳链，诸如c1-c40烷烃，诸如c6碳链。在一个实施方案中，接头包含核酸和非核酸的混合物。在另一个实施方案中，接头包含任何有机化合物。接头可以是二醇接头，或者是本领域的技术人员已知的任何接头。非核酸的优点可能是此类接头阻止聚合酶沿着pto前进。
封端基团
优选地，pto和/或cqo的3'端被“封闭”以阻止其在pcr反应中延伸。封端可以根据常规方法实现。例如，可以通过对最后一个核苷酸的3'-羟基添加化学部分诸如生物素、磷酸基、烷基、非核苷酸接头、硫代磷酸酯和/或烷二醇来进行封端。或者，可以通过去除最后一个核苷酸的3'-羟基或使用没有3'-羟基的核苷酸诸如双脱氧核苷酸来进行封端。因此，在一个实施方案中，pto和/或cqo还包含在3'端的封端基团。在另一个实施方案中，所述封端基团选自由生物素、磷酸基、烷基、非核苷酸接头、硫代磷酸酯和/或烷二醇组成的组。在另一个实施方案中，通过去除pto和/或cqo的最后一个核苷酸的3'-羟基，或通过使用没有3'-羟基的核苷酸诸如双脱氧核苷酸来阻止pto和/或cqo的3'端的延伸。cqo上的猝灭剂可以充当封端基团。在一个实施方案中，cqo上的所述封端基团是猝灭剂。在另一个实施方案中，cqo上的所述封端基团是位于所述cqo的3'端的猝灭剂。
pto可以通过点击化学来合成。特定的mtdr可以用于多个测定，而pto的靶向部分取决于要测量的靶而变化。因此，这两个元件和任选的接头可以如本领域的技术人员已知通过点击化学进行接合；另参见nucleicacidssympser(2008)52(1):47-48。
cqo
在本发明的一个实施方案中，每个cqo在本发明方法中用于测定至少一个靶核酸序列，诸如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个，诸如至少十个靶核酸序列，诸如15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或多于50个靶核酸。在另一个实施方案中，使用两个cqo来鉴定多个靶序列，其中每个cqo用于鉴定至少一个靶核酸序列，诸如至少两个、三个、四个、五个，诸如至少十个或十个以上靶核酸序列。在另一个实施方案中，使用三个cqo，诸如至少四个、五个、六个、七个，诸如至少八个cqo来鉴定众多个靶序列，其中每个cqo用于鉴定至少一个，诸如至少两个、三个、四个、五个，诸如至少十个靶核酸序列。
在一个实施方案中，cqo和任选地具有核酸酶活性的酶在液体悬浮液或液体溶液中。在一个实施方案中，至少一个cqo和任选地具有核酸酶活性的酶在即用的液体悬浮液或液体溶液中。即用意味着满足进行pcr反应的所有条件，即存在所需的盐、ph等。在一个实施方案中，至少一个cqo和任选地具有核酸酶活性的酶在即用丸粒中。在一个实施方案中，本发明的至少一个pto和至少一个cqo以及任选地具有核酸酶活性的酶在液体悬浮液或液体溶液中。在一个实施方案中，本发明的至少一个pto和至少一个cqo以及任选地具有核酸酶活性的酶在即用的液体悬浮液或液体溶液中。在另一个实施方案中，至少一个pto和至少一个cqo以及任选地具有核酸酶活性的酶在即用丸粒中。在一个实施方案中，即用丸粒包含基本上无水的组合物，包括用于进行pcr反应的盐和/或核苷酸。
在另一个实施方案中，cqo包含非核酸分子。
在一个实施方案中，本发明涉及一种寡核苷酸，即包含至少一个猝灭剂和捕获部分的cqo，其中所述cqo的捕获部分被配置为与本发明的至少一个，诸如两个或两个以上pto杂交，其中单一cqo可用于检测众多个靶核酸序列。cqo与pto的mtdr区杂交。在一个实施方案中，cqo不与pto的靶向部分和/或pto的任选接头杂交。
cqo用于根据本发明的测定使用。
pto和cqo的融合
pto和cqo可以连接并配置成可逆地形成发夹结构，其中pto的mtdr与cqo的捕获部分杂交，由此产生发夹结构。图8a示出了pto和cqo可如何产生发夹结构的实例。在一个实施方案中，pto和cqo存在于相同的寡核苷酸上。在另一个实施方案中，pto和cqo连接。在另一个实施方案中，pto和cqo位于相同的寡核苷酸上，其中pto的mtdr和cqo的捕获部分被配置为可逆地形成发夹结构。
pto和/或cqo中的各者的总长度可以变化。在一个实施方案中，pto的总长度在10与500个核苷酸之间，诸如在20与100个核苷酸之间，诸如在30与70个核苷酸之间。在另一个实施方案中，cqo的总长度在10与500个核苷酸或碱基对之间，诸如在15与100个核苷酸或碱基对之间，诸如在20与50个核苷酸或碱基对之间。在pto和cqo融合或连接的情况下，融合产物的总长度可以在20与600个核苷酸之间。在另一个实施方案中，pto和/或cqo包含非天然碱基。人工核酸(或异种核酸(xenonucleicacid)，xna)的实例包括但不限于pna、lna、gna和tna。这些化合物及其用途是技术人员已知的。非天然碱基的特定实例还包括但不限于碱基对组合形式的以下碱基：iso-c/iso-g、iso-dc/iso-dg[pwg2]。在另一个实施方案中，pto和/或cqo包含非核酸分子。
荧光团和猝灭剂
本发明人已证明，位于pto上的荧光团和位于cqo上的猝灭剂之间的距离影响背景解链曲线的生成。在一个实施方案中，pto荧光团和cqo猝灭剂分子之间的距离在6与60个碱基对之间，诸如在10至35个碱基对之间，诸如15至25个碱基对。在另一个实施方案中，pto的荧光团和cqo的猝灭剂(最邻近的猝灭剂)间隔开1与40个核苷酸或碱基对之间的距离，诸如在6至35之间、10至30之间、15至25之间，诸如约18个核苷酸。
pto的至少一个荧光团和cqo的至少一个最邻近的猝灭剂之间的距离优选使得猝灭足以允许在pto与cqo不杂交并且信号不被猝灭的情况下区分激活的标签双链体与解链的标签双链体之间的信号。因此，可以存在一些背景信号，前提条件是此信号弱于真阳性信号，从而允许在背景信号和阳性信号之间进行辨别。同样，荧光团和猝灭剂的选择也应当使得可以如技术人员所知晓的那样辨别背景信号和阳性信号。
在一个实施方案中，本发明的步骤(b)包括使pto和cqo杂交；其中所述cqo包含(i)捕获部分，其包含与所述pto的mtdr反向互补的核苷酸序列，以及(ii)至少一个猝灭分子；其中所述pto的所述mtdr被配置为与所述cqo的所述捕获部分杂交以形成标签双链体，其中pto的至少一个荧光团和cqo的至少一个猝灭剂间隔开1与40个核苷酸或碱基对之间的距离，诸如在6至35之间、在10至30之间、在15至25之间，诸如约20个核苷酸。
在一个实施方案中，本发明的至少一组相互作用标记包含荧光团和猝灭剂，其中来自所述荧光团的荧光发射被所述猝灭剂猝灭。一组相互作用标记被配置为具有相容的荧光团和猝灭剂。在另一个实施方案中，所述至少一组相互作用标记包括一组、两组、三组、四组、五组、六组、七组或七组以上相互作用标记。在另一个实施方案中，使用至少两组pto和cqo来检测至少两个靶核酸序列，其中每组pto和每组cqo被配置为具有相容的荧光团和猝灭剂。在另一个实施方案中，至少一组相互作用标记之间的主要相互作用由荧光共振能量转移(fret)介导。
本发明人还已证明，包含至少一个荧光团和至少一个猝灭剂的pto的相互作用标记组之间的距离也会影响不希望的背景解链曲线生成。在一个实施方案中，pto的相互作用标记组间隔开1与40个核苷酸或碱基对之间的距离，诸如在6与35个之间、在10至30个之间、在15至25个之间，诸如约20个核苷酸。在一个实施方案中，本文所述的方法的步骤(a)包括将靶核酸序列与pto杂交；所述pto包含(i)包含与所述靶核酸序列基本上互补的核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含与所述靶核酸序列不互补的核苷酸序列的mtdr，以及(iii)至少一组相互作用标记，包括至少一个荧光团和至少一个猝灭剂，其中所述至少一个荧光团和至少一个猝灭剂间隔开在
在一个实施方案中，pto的相互作用标记组被放置为使得当pto和cqo杂交时，来自pto的至少一个荧光团的发射被pto的至少一个猝灭剂和被cqo的至少一个猝灭剂猝灭。在另一个实施方案中，pto的相互作用标记组被放置为使得来自pto的至少一个荧光团的发射被pto的至少一个猝灭剂和cqo的至少一个猝灭剂猝灭，其中当pto和cqo杂交时，pto的至少一个荧光团被pto的至少一个猝灭剂和cqo的至少一个猝灭剂猝灭的水平基本上相似。在一个优选实施方案中，pto的相互作用标记组被放置为使得来自pto的至少一个荧光团的发射被pto的至少一个猝灭剂和cqo的至少一个猝灭剂猝灭，其中当pto和cqo杂交时，pto的至少一个荧光团与pto的至少一个猝灭剂和cqo的至少一个猝灭剂之间的距离基本上相似。在另一个实施方案中，pto的相互作用标记组被放置为使得当pto和cqo杂交时，pto的至少一个荧光团被pto的至少一个猝灭剂猝灭的水平基本上类似于和/或强于其被cqo的至少一个猝灭剂猝灭的水平。在另一个实施方案中，pto的相互作用标记被放置为使得当pto和cqo杂交时，pto的至少一个荧光团与pto的至少一个猝灭剂的距离基本上类似于和/或短于pto的至少一个荧光团与cqo的至少一个猝灭剂的距离。
可与寡核苷酸缀合的荧光团可用于本发明。在一个实施方案中，本文所述的pto包含至少一个荧光团。在另一个实施方案中，pto的至少一个荧光团选自包括6-羧基荧光素(fam)、四氯荧光素(tet)或它们的组合的组。在另一个实施方案中，本发明的pto包含多于一个荧光团，诸如两个、三个、四个、五个、六个、七个和/或诸如八个荧光团。在一个实施方案中，本发明的pto包含两个或两个以上相同的荧光团，诸如三个、四个、五个、六个、七个和/或诸如八个相同的荧光团。在另一个实施方案中，本发明的pto包含两个或两个以上不同的荧光团，诸如三个、四个、五个、六个、七个和/或诸如八个不同的荧光团。
为了促进对如本文所述的pto上的至少一个荧光团的猝灭，pto包含至少一个猝灭剂分子。可与寡核苷酸缀合的猝灭剂可用于本发明。pto的至少一个猝灭剂和至少一个荧光团被配置为至少一组相互作用标记。在一个实施方案中，本文所述的pto包含至少一个猝灭剂。在另一个实施方案中，pto的至少一个猝灭剂被配置用于猝灭pto的至少一个荧光团。在另一个实施方案中，pto的至少一种荧光团选自包括以下项的组：黑洞猝灭剂(blackholequencher，bhq)1、bhq2和bhq3、cosmic猝灭剂(例如购自美国诺瓦托biosearchtechnologies)、excellentbioneer猝灭剂(ebq)(例如购自韩国大田市bioneer)，或者它们的组合。在另一个实施方案中，本发明的pto包含多于一个猝灭剂，诸如两个、三个、四个、五个、六个、七个和/或诸如八个猝灭剂。在一个实施方案中，本发明的pto包含两个或两个以上相同的猝灭剂，诸如三个、四个、五个、六个、七个和/或诸如八个相同的猝灭剂。在另一个实施方案中，本发明的pto包含两个或两个以上不同的猝灭剂，诸如三个、四个、五个、六个、七个和/或诸如八个不同的荧光团。
为了促进对如本文所述的pto上的至少一个荧光团的猝灭，cqo包含至少一个猝灭剂分子。可与寡核苷酸缀合的大多数猝灭剂可用于本发明。然而，cqo的至少一个猝灭剂和pto的至少一个荧光团可以被配置为至少一组相互作用标记。在一个实施方案中，本文所述的cqo包含至少一个猝灭剂。在另一个实施方案中，cqo的至少一个猝灭剂被配置用于猝灭如本文所述的pto的至少一个荧光团。在另一个实施方案中，cqo的至少一个猝灭剂选自包括以下项的组：黑洞猝灭剂(bhq)1、bhq2以及bhq3(购自美国诺瓦托biosearchtechnologies)。在另一个实施方案中，本发明的cqo包含多于一个猝灭剂，例如两个、三个、四个、五个、六个、七个和/或诸如八个猝灭剂。在一个实施方案中，本发明的cqo包含两个或两个以上相同的猝灭剂，诸如三个、四个、五个、六个、七个和/或诸如八个相同的猝灭剂。在另一个实施方案中，本发明的cqo包含两个或两个以上不同的猝灭剂，诸如三个、四个、五个、六个、七个和/或诸如八个不同的荧光团。
可用于本发明的荧光团可以包括本领域已知的任何荧光分子。荧光团的实例是：cy2tmcfflfi)、yo-prntm-1(509)、ydyotm-1(509)、钙黄绿素(517)、fitc(518)、fluorxtm(519)、alexatm(520)、罗丹明110(520)、oregongreentm500(522)、oregongreentm488(524)、ribogreentm(525)、rhodaminegreentm(527)、罗丹明123(529)、magnesiumgreentm(531)、calciumgreentm(533)、to-protm-i(533)、totoi(533)、joe(548)、bodipy530/550(550)、dil(565)、bodipytmr(568)、bodipy558/568(568)、bodipy564/570(570)、cy3tm(570)、alexatm546(570)、tritc(572)、magnesiumorangetm(575)、藻红蛋白r&b(575)、罗丹明标记鬼笔环肽(575)、calciumorangetm(576)、派洛宁y(580)、罗丹明b(580)、tamra(582)、rhodamineredtm(590)、cy3.5(tm)(596)、rox(608)、calciumcrimsontm(615)、alexatm594(615)、texasred(615)、尼罗红(628)、yo-protm-3(631)、yoyotm-3(631)、r-藻蓝蛋白(642)、c-藻蓝蛋白(648)、to-protm-3(660)、tot03(660)、diddilc(5)(665)、cy5tm(670)、硫杂二羰花青(671)、cy5.5(694)、hex(556)、tet(536)、biosearchblue(447)、calfluorgold540(544)、calfluororange560(559)、calfluorred590(591)、calfluorred610(610)、calfluorred635(637)、fam(520)、荧光素(520)、荧光素-c3(520)、pulsar650(566)、guasar570(667)、guasar670(705)和guasar705(610)。括号中的数字是以纳米为单位的最大发射波长。在一个优选实施方案中，荧光团选自由fam和/或tet组成的组。值得注意的是，能够猝灭宽范围波长或特定波长的荧光的非荧光暗猝灭剂分子可用于本发明。在一个优选实施方案中，相互作用标记组是fam/bhq。其他合适的荧光团/猝灭剂为业内已知。
步骤(a)将pto与靶序列杂交
本发明的步骤(a)涉及本发明的pto与靶核酸的杂交。在一个实施方案中，本文所述方法的步骤(a)涉及将靶核酸序列与pto杂交；所述pto包含(i)包含与靶核酸序列基本上互补的核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含与靶核酸序列不互补的核苷酸序列的mtdr，以及(iii)至少一组相互作用标记，包括至少一个荧光团和至少一个猝灭剂；其中pto的靶向部分被配置为与靶核酸序列杂交，并且pto的mtdr不被配置为与靶核酸序列杂交。
在一个实施方案中，步骤(a)包括将靶核酸序列与pto杂交；所述pto包含(i)包含与靶核酸序列基本上互补的核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含与靶核酸序列不互补的核苷酸序列的mtdr，以及(iii)至少一组相互作用标记，包括至少一个荧光团和至少一个猝灭剂；其中pto的靶向部分被配置为与靶核酸序列杂交，并且pto的mtdr不被配置为与靶核酸序列杂交，其中所述pto在10与500个核苷酸之间，诸如在20与100个之间，诸如在30与70个核苷酸或碱基对之间。
可以在本发明中加入靶序列之前预混合本发明的pto和cqo。因此，本发明步骤(b)的标签双链体形成可以在pto与靶序列的杂交之前形成。在一个实施方案中，如下在步骤(a)之前进行步骤(b)：
(b)将pto与cqo(捕获和猝灭寡核苷酸)杂交；其中所述pto包含(i)包含与靶核酸序列基本上互补的核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含与靶核酸序列不互补的核苷酸序列的解链温度决定区(mtdr)，以及(iii)至少一组相互作用标记，包括至少一个荧光团和至少一个猝灭剂；其中pto的靶向部分被配置为与靶核酸序列杂交，并且pto的mtdr不被配置为与靶核酸序列杂交；其中所述cqo包含(i)捕获部分，其包含与所述pto的mtdr反向互补的核苷酸序列，以及(ii)至少一个猝灭分子；其中所述pto的所述mtdr被配置为与所述cqo的所述捕获部分杂交以形成标签双链体；
以及
(a)将所述靶核酸序列与所述标签双链体杂交；
(c)使所述标签双链体与具有核酸酶活性的酶接触；其中当所述标签双链体与靶核酸序列杂交时，所述具有核酸酶活性的酶诱导所述标签双链体的切割，从而释放激活的标签双链体片段，所述激活的标签双链体片段包含pto片段，所述pto片段包含与cqo的捕获部分杂交的mtdr和至少一个荧光团；
(d)使所述激活的标签双链体片段解链和/或杂交以获得来自所述至少一个荧光团的信号，以及
(e)通过测量来自所述至少一个荧光团的所述信号来检测所述激活的标签双链体片段；其中所述信号指示在核酸混合物中所述靶核酸序列的存在。
应当理解，为了获得来自至少一个荧光团的信号，所述激活的标签双链体片段不包含包含在mtdr的至少一组相互作用标记中的至少一个猝灭剂。换句话说，所述信号是当至少一组相互作用标记的至少一个荧光团和至少一个猝灭剂不再相互作用时获得的。
本发明的pto、cqo和靶序列也可以同时混合。在一个实施方案中，本发明的步骤(a)和步骤(b)可以按任何顺序或同时进行。
上游和下游寡核苷酸
将位于pto的结合位点的上游和下游的一对pcr引物添加至靶核酸序列增加了pcr测定的特异性并且有助于避免假阳性杂交信号。因此，本发明还可以包括与靶核酸互补的上游引物和可在靶核酸上pto结合位点的下游杂交的下游引物。上游和下游寡核苷酸被配置为不与靶核酸序列的pto结合位点重叠。上游引物和下游引物可以位于靶核酸序列的2000个碱基对内。在一个实施方案中，上游寡核苷酸和下游核苷酸位于来自靶核酸序列的pto结合位点的至少一个碱基对处。在另一个实施方案中，上游和/或下游寡核苷酸位于来自靶核酸序列的pto结合位点的1至2000个碱基对之间。上游和/或下游寡核苷酸可以定位为距靶核酸序列超过2000个碱基对(2kb)，距离靶核酸序列诸如2.5kb、诸如3kb、诸如3.5kb、诸如4kb、诸如5kb、诸如10kb、诸如20kb。
净化
反应容器的净化可以在步骤(a)之前进行。因此，在一个实施方案中，在步骤(a)之前使用ung处理步骤(biotechniques38：569-575(2005年4月))和/或变性步骤。可以应用本领域的技术人员已知的rna净化处理。在一个实施方案中，在步骤(a)之前使用净化处理步骤和/或变性步骤。
步骤(b)将cqo与pto杂交以形成标签双链体
本发明方法的步骤(b)涉及pto与cqo的杂交，此杂交形成标签双链体。在一个实施方案中，本发明方法的步骤(b)包括将所述pto与所述cqo杂交；其中所述cqo包含(i)捕获部分，其包含与所述pto的mtdr反向互补的核苷酸序列，以及(ii)至少一个猝灭分子；其中所述pto的mtdr被配置为与所述cqo的捕获部分杂交以形成标签双链体。
如先前所述，本发明人已证明，位于pto上的荧光团和位于cqo上的猝灭剂之间的距离影响背景解链曲线的生成。
在一个实施方案中，本发明方法的步骤(b)包括将所述pto与所述cqo杂交；其中所述cqo包含(i)捕获部分，其包含与所述pto的mtdr反向互补的核苷酸序列，以及(ii)至少一个猝灭分子；其中所述pto的mtdr被配置为与所述cqo的捕获部分杂交以形成标签双链体，其中pto上的至少一个荧光团与cqo猝灭剂分子上的至少一个猝灭分子之间的距离在1与60个碱基对之间，诸如在10与35个碱基对之间，诸如15至25个碱基对，诸如约18个碱基对。
在一个实施方案中，本发明方法的步骤(b)包括将所述pto与所述cqo杂交；其中所述cqo包含(i)捕获部分，其包含与所述pto的mtdr反向互补的核苷酸序列，以及(ii)至少一个猝灭分子，所述至少一个猝灭分子被配置为猝灭所述pto的至少一个荧光团；其中所述pto的mtdr被配置为与所述cqo的捕获部分杂交以形成标签双链体。
步骤(c)释放激活的标签双链体片段
本发明的步骤(c)涉及标签双链体的核酸酶介导切割，此切割形成释放的标签双链体片段。在一个实施方案中，本发明的步骤(c)包括使来自步骤(b)的标签双链体与具有核酸酶活性的酶接触；其中当所述标签双链体与所述靶核酸序列杂交时，所述具有核酸酶活性的酶诱导所述标签双链体的切割，从而释放激活的标签双链体片段，所述激活的标签双链体片段包含pto片段，所述pto片段包含与所述cqo的所述捕获部分杂交的所述mtdr和所述至少一个荧光团。
为了避免假阳性信号，cqo的至少一个猝灭剂被配置为当激活的标签双链体片段杂交时可逆地猝灭pto的至少一个荧光团。在本发明方法的一个实施方案中，cqo的至少一个猝灭剂被配置为可逆地猝灭激活的标签双链体片段的至少一个荧光团。如上所述，cqo的猝灭剂和pto的荧光团应选择为使得能辨别背景信号和阳性信号。同样，cqo的猝灭剂和pto的荧光团之间的距离可能必须被优化以获得期望的信号辨别。
任何具有核酸酶活性的酶都可能诱发标签双链体的释放，如图1所示。在一个实施方案中，上述核酸酶活性是fen核酸酶(瓣状内切核酸酶)的5'核酸酶活性。在另一个实施方案中，具有核酸酶活性的酶是模板依赖性dna聚合酶，诸如热稳定的模板依赖性dna聚合酶，诸如taq聚合酶和/或sso7d融合聚合酶或它们的混合物。在一个优选实施方案中，具有核酸酶活性的酶是sso7d-融合聚合酶。在另一个优选实施方案中，具有核酸酶活性的酶是gotaq聚合酶。在另一个实施方案中，具有核酸酶活性的酶是具有5'至3'核酸外切酶活性的模板依赖性dna聚合酶。因此，在一个实施方案中，核酸酶是核酸外切酶。
技术人员了解聚合酶的浓度可以影响其活性。最佳浓度还可以取决于其他参数，诸如靶浓度、模板、或存在于反应中的核酸的序列。技术人员了解如何优化聚合酶浓度以获得良好的结果。
导致形成激活的标签双链体片段的标签双链体释放由当本文所述的上游寡核苷酸延伸时具有核酸酶活性的酶介导。在一个实施方案中，用延伸上游寡核苷酸的所述模板依赖性dna聚合酶诱导标签双链体的pto部分的切割，其中所述聚合酶具有5'核酸酶活性。在另一个实施方案中，当上游寡核苷酸延伸时，由所述模板依赖性dna聚合酶诱导标签双链体的pto部分的切割，其中所述聚合酶具有5'核酸酶活性。
当pto的含5'靶向部分的部分被切割时，标签双链体片段被释放。该切割导致pto的靶向部分与靶核酸序列之间的亲和力降低，这因此导致靶核酸序列和标签双链体的解离，从而形成激活的标签双链体片段。在一个实施方案中，如本文所述的pto上的至少一个猝灭剂由具有核酸酶活性的酶从pto释放。在另一个实施方案中，具有核酸酶活性的酶去除了激活的标签双链体片段的pto部分的至少一个猝灭剂。在另一个实施方案中，激活的标签双链体片段包含pto片段，其中不存在pto的至少一个猝灭剂。由于如本文所述并且在图1上示出的具有核酸酶活性的酶的核酸酶活性，激活的标签双链体片段上可能不存在至少一个猝灭剂。
激活的标签双链体和/或激活的pto的存在可以通过qpcr和/或实时pcr检测。优选地，仅激活的标签双链体被实时pcr检测到。
步骤(d)使激活的标签双链体片段解链
本发明步骤(d)涉及来自步骤(c)的激活的标签双链体片段的解链。在一个实施方案中，本发明的步骤(d)包括使所述激活的标签双链体片段解链和/或杂交以获得来自所述至少一个荧光团的信号。记录发生解链时的温度。
解链可以通过常规技术进行，包括但不限于加热、碱、甲酰胺、尿素和乙二醛处理，酶法(如解旋酶作用)以及结合蛋白。例如，可以通过在30℃至100℃的温度范围内加热来实现解链。
当在一定温度范围内加热激活的标签双链片段时，pto的mtdr与本发明的cqo解离。激活的标签双链体片段的一半将解离成单链的温度由标签双链体的稳定性决定，而标签双链体的稳定性由解链温度区(mtdr)决定。因此，在一个实施方案中，在一定温度范围内加热激活的标签双链体片段i。在另一个实施方案中，将激活的标签双链体片段从30℃加热至100℃，诸如从35℃至100℃，诸如从40℃至75℃，诸如从45℃至70℃。在一个优选实施方案中，激活的标签双链体片段的解链温度为45℃至70℃。在另一个实施方案中，激活的标签双链体片段在预定温度下解链。
只要激活的标签双链体片段是双链的，来自pto上的至少一个荧光团的发射就基本上被cqo上的至少一个猝灭剂猝灭。当激活的标签双链片段解离并变成单链时，pto上的至少一个荧光团的发射可以不被cqo上的至少一个猝灭剂猝灭。因此，在一个实施方案中，当在步骤(d)中标签双链体解链时，来自至少一个荧光团的发射不被猝灭。在另一个实施方案中，当在步骤(d)中标签双链解离并变成单链时，来自至少一个荧光团的发射不被猝灭。在另一个实施方案中，通过解链曲线分析和/或杂交曲线分析来确定激活的标签双链体片段的存在。在另一个实施方案中，通过解链曲线分析和/或杂交曲线分析来确定激活的标签双链体片段的存在，其中所鉴定的激活的标签双链体片段的解链温度由本文所述的pto的mtdr决定。
步骤(e)检测来自解链的标签双链体片段的信号。
本发明的步骤(e)涉及检测作为步骤(d)中标签双链体解链的结果的信号。在本发明的一个实施方案中，步骤(e)包括通过测量来自所述至少一个荧光团的信号来检测所述激活的标签双链体片段；其中所述信号指示核酸混合物中所述靶核酸序列的存在。
要测量的信号的性质取决于pto上的至少一个荧光团，并且可以通过一系列分析方法(例如实时pcr检测系统)来确定。
可以通过常规技术来获得解链曲线或杂交曲线。例如，解链曲线或杂交曲线可以包括使用杂交严格性参数的输出信号的变化的图形曲线或图形显示。可以直接根据杂交参数绘制输出信号的曲线图。通常，解链曲线或杂交曲线将具有输出信号，例如荧光，其表示双链体结构的程度(即杂交程度)，绘制在y轴上，并且杂交参数绘制在x轴上(即，温度)。
为了用荧光记录解链曲线，通常可以逐步升高或降低总体样品温度，其中在每个温度下的设定平衡时间为0至360秒。通常使用在0.5℃与2℃之间的步长，但是根据期望的精度可以将其降至0.1℃。记录每个温度下相关波长的荧光读数。基于解链曲线，可以确定dna双链体在所应用条件下的tm。
在分子生物学的所有领域中选择用于核酸(dna、rna)定量的方法是实时pcr或定量pcr(qpcr)。方法这样称谓是因为用聚合酶链反应(pcr)扩增dna是被实时监测的(qpcr循环仪不断扫描qpcr板)。
荧光报告探针(taqman探针或双标记探针)仅检测含有与探针互补的序列的dna；因此，使用报告探针显著增加了特异性，并且使得即使在其他dsdna的存在下也能够进行该技术。通过使用不同颜色的标记，荧光探针可在多重测定中用于监测同一管中的若干靶序列。该方法依赖于在一端具有荧光报告分子并且在探针的相对端具有荧光猝灭剂的基于dna的探针。报告分子与猝灭剂紧邻而阻止了对其荧光的检测；利用taq聚合酶的5'至3'核酸外切酶活性分解探针破坏了报告分子与猝灭剂的接近，从而允许荧光发射不被猝灭，该荧光发射可以在用激光激发后检测到。因此，在每次pcr循环中报告探针所靶向的产物的增加导致荧光由于探针的分解和报告分子的释放而成比例增加。正常准备pcr，并加入报告探针。当反应开始时，在pcr的退火阶段期间，将探针和引物都与dna靶退火。从引物开始新dna链的聚合，并且一旦聚合酶到达探针，其5'-3'核酸外切酶使探针降解，将荧光报告分子与猝灭剂实体分离，从而导致荧光增加。在实时pcr机器中检测和测量荧光，并且使用荧光对应于产物指数增长的几何级数增长来确定每次反应中的定量循环数(cq)。
该信号可以在反应中存在的双链体的退火温度或变性温度下测量。因此，该信号可以在55℃与65℃之间的温度下测量，诸如在56℃与64℃之间，诸如在57℃与63℃之间，诸如在58℃与62℃之间，诸如在59℃与61℃之间，诸如60℃。在其他实施方案中，该信号可以在90℃与100℃之间的温度下测量，诸如在91℃与99℃之间，诸如在92℃与98℃之间，诸如在94℃与97℃之间，诸如在95℃与96℃之间，诸如在95℃。技术人员了解如何确定哪个温度提供最佳读出信号。
如实施例5中所示，靶浓度影响将检测到的信号的强度。因此，如果需要，可以调整靶浓度以改善信号。
靶核酸序列
如本文所用的靶核酸序列是指需要在核酸序列混合物中鉴定的任何序列。本发明的简单测定法具有众多种应用。本发明的测定法的非详尽应用的清单可以是：
●人和/或兽医诊断
●食品和/或饲料质量和安全性
●环境监测
●科学研究
因此，在一个实施方案中，本发明的靶核酸序列来自病原生物，诸如细菌、病毒、真菌和/或原生动物。在另一个实施方案中，本发明的靶核酸序列来自能够感染农场动物诸如牛、鸡、猪、马、绵羊和/或山羊的病原生物。在一个优选实施方案中，本发明的靶核酸序列来自能够感染哺乳动物诸如人、牛、猪、马、绵羊和/或山羊的病原生物。在一个更优选的实施方案中，本发明的靶核酸序列来自能够感染人的病原生物。
在本发明的一个实施方案中，本发明的靶核酸序列来自能够感染人的病毒。在本发明的另一个实施方案中，本发明的靶核酸序列来自能够感染人、导致高于10％的死亡率的病毒。在一个实施方案中，病毒是埃博拉病毒。
在本发明的一个实施方案中，本发明的靶核酸序列来自能够感染人的细菌。在本发明的另一个实施方案中，本发明的靶核酸序列来自能够感染人、导致高于10％的死亡率的细菌。
在本发明的一个实施方案中，本发明的靶核酸序列来自引起性传播疾病的病原生物。该性传播疾病选自由衣原体感染、淋病和疱疹组成的组。
在本发明的一个实施方案中，本发明的靶核酸序列来自选自包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillinresistantstaphylococcusaureus，mrsa)的组的病原生物。
用于检测靶核酸序列的试剂盒
本发明的元件可以包含在由多个部分构成的试剂盒中。因此，本发明的一个方面涉及用于检测靶核酸序列的多个部分构成的试剂盒，所述试剂盒包括：
i.任选地至少一个如本文所述的pto，以及
ii.至少一个本文所述的cqo，以及
iii.任选地具有核酸酶活性的酶，以及
iv.任选地关于如何检测靶核酸序列的说明。
所述试剂盒可用于检测多于一个靶核酸序列。在一个实施方案中，本文所述的试剂盒还包括：
i.任选地来自至少两个不同pto组的至少两个pto，以及
ii.至少两个cqo。
所述试剂盒还可以含有至少一个如本文所述的下游和/或上游寡核苷酸。在一个实施方案中，所述试剂盒还包含如本文所述的下游寡核苷酸和/或上游寡核苷酸。
另外，所述试剂盒还可以包含具有核酸酶活性的酶。因此，在一个实施方案中，所述试剂盒还包含如本文所述的具有核酸酶活性的酶。
在一个实施方案中，本文所述的试剂盒是液体悬浮液或液体溶液。在一个实施方案中，上述试剂盒是即用液体悬浮液或液体溶液。在另一个实施方案中，所描述的试剂盒是即用丸粒。在一个实施方案中，即用丸粒包含基本上无水的组合物，该组合物包含所述试剂盒的i)、ii)和iii)。
在一个实施方案中，本文所述的试剂盒包含部分和/或完全杂交的pto和cqo。
试剂盒还可以包含至少一个标签双链体，所述至少一个标签双链体可以用作对照和用于例如所应用的分析设备的tm校准。寡核苷酸的tm可以根据例如盐浓度、dna浓度、ph和变性剂(如甲酰胺或dmso)的存在而变化。如果要分析的样品含有变化即不同的盐浓度，则这种对照可能是需要的。在一个实施方案中，本文所述的试剂盒还包含对照样品和/或对照标签双链体。
诊断
本发明的方法可用于诊断和/或治疗有需要的个体。
因此，本发明的一个实施方案涉及一种诊断个体患有特征在于存在靶核酸序列的疾病或病症的方法，所述方法包括如其他地方所示并且导致检测到所述靶核酸序列的测定步骤。
其非限制性实例是：一种诊断个体患有特征在于存在靶核酸序列的疾病或病症的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤(a)将靶核酸序列与pto(探测和标记寡核苷酸)杂交；所述pto包含(i)包含与所述靶核酸序列基本上互补的核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含与所述靶核酸序列不互补的核苷酸序列的解链温度决定区(mtdr)，以及(iii)至少一组相互作用标记，包括至少一个荧光团和至少一个猝灭剂；
步骤(b)将所述pto与cqo(捕获和猝灭寡核苷酸)杂交；其中所述cqo包含(i)捕获部分，其包含与所述pto的mtdr反向互补的核苷酸序列，以及(ii)至少一个猝灭分子；其中所述pto的mtdr被配置为与所述cqo的捕获部分杂交以形成标签双链体；
步骤(c)使所述标签双链体与具有核酸酶活性的酶接触；其中当所述标签双链体与靶核酸序列杂交时，所述具有核酸酶活性的酶诱导所述标签双链体的切割，从而释放激活的标签双链体片段，所述激活的标签双链体片段包含pto片段，所述pto片段包含与cqo的捕获部分杂交的mtdr和至少一个荧光团；
步骤(d)使所述激活的标签双链体片段解链和/或杂交以获得来自所述至少一个荧光团的信号，以及
步骤(e)通过测量来自所述至少一个荧光团的信号来检测所述激活的标签双链体片段；其中所述信号指示所述个体中所述靶核酸序列的存在以及因此疾病或病症的存在。
所述疾病或病症可以是感染引起的(即由病原体引起的)或是遗传性病症或疾病。
反应混合物
在另一个实施方案中，本发明包括一种反应混合物。因此，本发明的一个实施方案提供了一种用于扩增和/或检测样品中靶核酸序列的方法的反应混合物，其中在扩增前所述反应混合物包含至少一对寡核苷酸引物、至少一个pto和至少一个cqo，其中所述引物对、pto和cqo的特征在于所述寡核苷酸引物对包含与所述靶核酸互补并引发与所述靶核酸互补的第一延伸产物的合成的第一引物，和与所述第一延伸产物互补并引发第二延伸产物的合成的第二引物；并且所述pto与基本上与所述靶核酸序列互补的核苷酸序列或所述靶核酸的互补序列杂交，其中所述区在所述引物对的一个成员与所述引物对的另一个成员的互补序列之间，并且所述pto包含至少一组相互作用标记、mtdr、以及任选地在所述靶向部分和所述mtdr之间的接头；并且其中所述cqo包含至少一个猝灭剂和捕获部分，所述捕获部分被配置为与所述pto杂交。所述反应混合物可以包含若干寡核苷酸引物对、若干pto以及单一cqo。所述反应混合物可以包含被配置为与所述反应混合物中的所有pto杂交的单一cqo。
计算机实现的方法
本发明的另一方面涉及一种用于鉴定至少一个靶序列的计算机实现的方法，所述方法包括以下步骤：1)提供关于pto、cqo、靶序列的信息，以及2)获得来自至少一个解链的标签双链体片段的信号，以及3)基于所述所提供的信息和所获得的信号来鉴定至少一个靶序列。
实施例
实施例1荧光团和cqo猝灭剂之间的距离
以下实施例显示了包含特异于ipah基因的5种不同的标记探针和taqman探针设计的pcr反应的结果。所有反应均用2种常用引物(dec229f和dec230r)进行。设计标记探针，使得fam被插置为离dec486p中的pto的杂交靶向部分中的猝灭剂位置最远，并且最接近dec490p中pto的杂交靶向部分中的猝灭剂位置。与单个cqo设计(dec481rp)结合地测试这五种不同的标记探针设计。结果表明，通过增加fam与pto的杂交靶向部分中的猝灭剂位置之间的距离，背景解链曲线的生成减少。其还表明，优选的pto设计(dec486p)仅在存在特异靶时产生pcr扩增曲线，并且还仅在存在经扩增的靶时产生解链曲线信号。所包括的其他设计(dec487p至dec490p)都在ntc反应中显示出背景解链曲线，这指示假阳性结果。taqman探针dec464被包括作为pcr反应的阳性对照。
表1：引物和探针序列(5'至3')：
z＝tina，bhq1＝黑洞猝灭剂1，bhq2＝黑洞猝灭剂2，bhq3＝黑洞猝灭剂3，(dt-fam)＝附接到t的内部fam。(dt-bhq1)＝附接到t的内部bhq1。(dt-bhq2)＝附接到t的内部bhq2。
pcr反应：
制备含有1倍ssoadvanced通用探针supermix(产品号172-5280，bio-rad)、200nm正向和反向引物、400nm标记探针、800nm猝灭探针、靶的1:200稀释液、0.25u的1u/μl尿嘧啶dna糖基化酶(产品号en0361，fermentas)的10μl反应物。通过将单个大肠杆菌菌落在200μl水中混合并在95℃煮沸15分钟来制备靶。随后将25μl煮沸的靶加入到100μl无菌水中以作为靶母液，该靶母液在最终pcr反应中稀释5倍。将反应物装入abgenesuperplate96孔pcr板(编录号ab2800)中并用光学透明、粘性的microsealb膜(bio-rad,目录号msb1001)密封。
使pcr反应混合物经历以下pcr循环和解链曲线程序(bio-radcfx96实时pcr检测系统)：
pcr程序：
实施例2多重pcr反应
以下实施例显示了包含特异于ipah基因、携带渐增的mtdr区长度的3种不同pto(标记探针)设计的pcr反应的结果，其中dec500p具有最短的mtdr并且因此具有最低的tm，而dec503p具有最长的mtdr并且因此具有最高的tm。所有反应均用2种常用引物(dec229f和dec230r)进行。与单个cqo(猝灭探针)设计(dec481rp)结合地测试这3种不同的标记探针。这3种pto设计被单独测试(图9至图14)、组合探针dec500p与dec502p测试(图15至图16)，以及组合探针dec500p和dec503p(图17至图18)测试。结果表明，每个pto单独和组合时在pcr中都表现良好。具体地，结果进一步表明，组合探针dec500p与dec502p提供了2个单独可区分的解链曲线，表明两个探针都检测到了特异性信号。结果还表明，组合探针dec500p与dec503p也提供了2个单独可区分的解链曲线，具有与dec500p和dec503p的mtdr之间的较大tm差异一致的甚至更宽的间隔曲线，同时仍表明两个探针都检测到了特异性信号。结果还显示，所有探针都在ntc反应中提供非常低的背景解链曲线，表明pto探针在不存在特异性靶的情况下不提供信号。
表2：引物和探针序列(5'至3')：
z＝tina，bhq1＝黑洞猝灭剂1，bhq2＝黑洞猝灭剂2，bhq3＝黑洞猝灭剂3，(dt-fam)＝附接到t的内部fam。(dt-bhq1)＝附接到t的内部bhq1。(dt-bhq2)＝附接到t的内部bhq2。phos＝用于阻止延伸的磷酸基。
pcr反应：
制备含有1倍gotaq探针qpcr主混合物(产品号promegaa6101)、200nm正向和反向引物、400nm标记探针、800nm猝灭探针、靶的1:200稀释液、0.25u的1u/μl尿嘧啶dna糖基化酶(产品号en0361，fermentas)的10μl反应物。通过将携带有ipah基因的单个大肠杆菌菌落在200μl水中混合并在95℃煮沸15分钟来制备靶。随后将25μl煮沸的靶加入到100μl无菌水中以作为靶母液，该靶母液在最终pcr反应中稀释5倍。将反应物装入abgenesuperplate96孔pcr板(编录号ab2800)中并用光学透明、粘性的microsealb膜(bio-rad,目录号msb1001)密封。
使pcr反应混合物经历以下pcr循环和解链曲线程序(bio-radcfx96实时pcr检测系统)：
pcr程序：
实施例3环状探针的设计
以下实施例显示了包含特异于ipah基因、携带环状设计作为mtdr区的2种不同pto(标记探针)设计的pcr反应的结果，其中pto(标记探针)的最后部分包含通过环区域与mtdr区间隔开的靶向部分(猝灭探针部分)。所有反应均用2种常用引物(dec229f和dec230r)进行。这2种不同的pto(标记探针)被单独测试(rmd7p，图19至图20，和rmd8p，图21至图22)。结果表明，每个pto都在pcr中表现良好并且仅在特异性靶的存在下提供扩增曲线。此外，结果表明，两种探针都在正确靶的存在下提供解链曲线，但是在ntc中没有靶。
表3：引物和探针序列(5'至3')：
z＝tina，bhq1＝黑洞猝灭剂1，bhq2＝黑洞猝灭剂2，bhq3＝黑洞猝灭剂3，(dt-fam)＝附接到t的内部fam。(dt-bhq1)＝附接到t的内部bhq1。(dt-bhq2)＝附接到t的内部bhq2。phos＝用于阻止延伸的磷酸基。
pcr反应：
制备含有1倍ssoadvanced通用探针supermix(产品号172-5280，bio-rad)、200nm正向和反向引物、400nm标记探针、靶的1:200稀释液、0.25u的1u/μl尿嘧啶dna糖基化酶(产品号en0361，fermentas)的10μl反应物。通过将单个大肠杆菌菌落在200μl水中混合并在95℃煮沸15分钟来制备靶。随后将25μl煮沸的靶加入到100μl无菌水中以作为靶母液，该靶母液在最终pcr反应中稀释5倍。将反应物装入abgenesuperplate96孔pcr板(编录号ab2800)中并用光学透明、粘性的microsealb膜(bio-rad,目录号msb1001)密封。
使该pcr反应混合物经历以下pcr循环和解链曲线程序(bio-radcfx96实时pcr检测系统)：
表4-pcr程序
pcr程序：
实施例4：测试不同的mtdr
在本实验中，我们测试了一些具有与先前实施例不同的序列的pto探针(rmd)和匹配的猝灭剂探针(cqo)，以阐明是否不同的序列可能不太有效地结合聚合酶。引物和探针靶与ipah探针相同。如同ipah探针测量所进行的，测试正常的水解探针测定mvalidprime，其中样品中还存在rmdpto探针和猝灭剂。我们想通过这个测试来评估此测定的qpcr反应是否也会因有限的聚合酶接近而变得被抑制。
方法
qpcr
在lightcycler480仪器(roche)上进行实验。用作rmd测定的模板(表5)和用于mvalidprime测定的gblocks是从idt订购的。主混合物是tataa探针grandmaster混合物。将taqdna聚合酶加入到该主混合物中以产生为主混合物中正常聚合酶浓度的1倍、2.5倍、5倍和10倍的聚合酶浓度，其中正常浓度定义为由制造商指示为进行反应的最佳浓度的浓度。用5个用于rmd测定的探针进行qpcr测定(表6)。每个探针在10种不同的混合物中进行测试，如表7所示。仅使用rmd体系制备一组五种混合物，具有四个不同浓度的聚合酶和一个ntc。制备一组另外五种混合物，它们不含ipah引物和模板，但存在用于小鼠validprime测定的引物、探针和模板。将试剂混合至表8所示的浓度。所有样品都以一式两份的方式运行。温度程序于表9中示出。在此，在程序的步骤2(60℃)和步骤3(95℃)中均测量荧光。荧光通常仅在60℃步骤中测量。由于探针可能与猝灭(cqo)探针杂交，并且荧光可能在60℃被猝灭，所以我们在此也在所有双链dna被解链的95℃下进行测量。
表5.gbiocks的序列。
带颜色的密码子：
正向引物
反向引物
探针靶
表6.探针和引物的序列
表7.混合方案。体积以μl计。
表8.试剂浓度
表9.用于探针qpcr运行的温度程序。
结果
cq值
计算rmd样品(a至d)的cq值的一式两份平均值。在图23中将它们作为聚合酶浓度的函数绘制曲线图。扩增通常随着聚合酶浓度的增加而增加。
图24示出含有mvalidprime探针的样品的cq值。样品还含有多种rmd探针，但是由于样品中没有这些探针的引物或模板，所以只有mvalidprime靶被扩增，并且荧光主要来自mvalidprime探针。扩增通常随着聚合酶浓度的增加而增加。
扩增曲线
可以通过改变探针长度和聚合酶浓度来调节扩增曲线的幅度，如图25所示。该图示出了在95℃的变性步骤中在最后一个扩增循环中测得的荧光幅度。通常，在较高的聚合酶浓度下，所有探针都达到较高的幅度。
mvalidprime探针的幅度(图26)在所测试聚合酶浓度范围内基本上稳定。
解链温度
所测得的rmd探针的解链温度见图27。仅观察到了含有rmd模板、混合物a、b、c和d的样品的解链曲线。解链温度随着探针长度的增加而增加，并且它们随着聚合酶浓度的增加而略有降低。
实施例5：靶浓度
以下实施例显示了利用特异于ipah基因的探测和标记寡核苷酸(pto)dec486p检测的6种不同靶浓度的5倍稀释曲线的pcr反应的结果。用2种常用引物(dec229f和dec230r)进行反应。与单一捕获和猝灭探针设计(dec481rp)结合地测试所述探测和标记寡核苷酸。结果表明，所述探测和标记探针通过提供对应于靶稀释度的扩增曲线和解链曲线来起作用。如从ntc反应可以看出，dec486p探针表现出极少的背景。
表10：引物和探针序列(5'至3')：
z＝tina，bhq1＝黑洞猝灭剂1，bhq2＝黑洞猝灭剂2，bhq3＝黑洞猝灭剂3，(dt-fam)＝附接到t的内部荧光素标记。fam＝荧光素。(dt-bhq1)＝附接到t的内部bhq1。(dt-bhq2)＝附接到t的内部bhq2。phos＝用于阻止延伸的磷酸基。
pcr反应：制备含有1倍ssoadvanced通用探针supermix(产品号promegaa6101)、200nm正向和反向引物、400nm探测和标记探针、800nm捕获和猝灭探针、靶的1:200稀释液、0.25u的1u/μl尿嘧啶dna糖基化酶(产品号en0361，fermentas)的10μl反应物。通过将携带有ipah基因的单个大肠杆菌菌落在200μl水中混合并在95℃煮沸15分钟来制备靶。随后将25μl煮沸的靶加入到100μl无菌水中以作为靶母液，该靶母液在最终pcr反应中稀释5至15625倍。将反应物装入abgenesuperplate96孔pcr板(编录号ab2800)中并用光学透明、粘性的microsealb膜(bio-rad,目录号msb1001)密封。
使pcr反应混合物经历以下pcr循环和解链曲线程序(bio-radcfx96实时pcr检测系统)：
表11
pcr程序：
参考文献
kibbewa.′oligocalc：anonlineoligonucleotidepropertiescalculator′.(2007)
nucleicacidsres.35(webserverissue)：may25.
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序列表
<110>anapabiotecha/s
<120>多重pcr
<130>p3649pc00
<160>21
<170>patentin3.5版
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>杂项特征
<222>(1)..(1)
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<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<220>
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<221>杂项特征
<222>(1)..(1)
<223>tina（扭曲嵌入核酸）
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<221>杂项特征
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<220>
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<400>4
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<221>杂项特征
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<221>杂项特征
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<223>bhq1=黑洞猝灭剂1
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<221>杂项特征
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actacg66
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<220>
<221>杂项特征
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aatgttccgcctcgaaattctggagatatcgaacgcgaaaacgcgttcg49
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tcagaaggccttttcgataatgataccggcgctctgctctccctgggcagggaaatgttc120
cgcctcgaaattctggaggacattgcccgggataaagtcagaactctccattttgtggat180
gagatagaagtctacctggccttccagaccatgctcgcagagaaacttcagctctctact240
gccgtgaaggaaatgcgtttctatggcgtgtcgggagtgacagcaaatgacctccgcact300
gccgaagccatggtcagaagccgtgaagagaatgaatttacggactggttctccctctgg360
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<213>人工序列
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<221>杂项特征
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<221>杂项特征
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<220>
<221>杂项特征
<222>(57)..(57)
<223>bhq3=黑洞猝灭剂3
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gatactagagtttcatagttcgtagtcaagatgatagattggaagtgcgtcagtcag57
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<213>人工序列
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<223>探针
<220>
<221>杂项特征
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<223>磷酸基团
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<222>(1)..(1)
<223>bhq1=黑洞猝灭剂1
<220>
<221>杂项特征
<222>(12)..(12)
<223>fam
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<221>杂项特征
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<223>磷酸基团
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<221>杂项特征
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<223>bhq1=黑洞猝灭剂1
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<221>杂项特征
<222>(12)..(12)
<223>fam
<220>
<221>杂项特征
<222>(58)..(58)
<223>磷酸基团
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<213>人工序列
<220>
<223>探针
<220>
<221>杂项特征
<222>(1)..(1)
<223>bhq1=黑洞猝灭剂1
<220>
<221>杂项特征
<222>(12)..(12)
<223>fam
<220>
<221>杂项特征
<222>(74)..(74)
<223>磷酸基团
<400>20
aatgttccgcctcgaaattctggagtatacggccgattagatatagaatggatatcgcta60
tagatcttattcgg74
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<211>91
<212>dna
<213>人工序列
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<223>探针
<220>
<221>杂项特征
<222>(1)..(1)
<223>bhq1=黑洞猝灭剂1
<220>
<221>杂项特征
<222>(12)..(12)
<223>fam
<220>
<221>杂项特征
<222>(91)..(91)
<223>磷酸基团
<400>21
aatgttccgcctcgaaattctggagtatacggccgattagatatagaatggatatcgcta60
tagatcttattcggttaagatagttgtaggc91
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