专利名称：使用对照物测定核酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种使用特异性对照核酸进行靶核酸鉴定的方法，一种使用引物和特异性对照核酸扩增所述靶核酸部分序列的方法以及含有所述对照核酸的试剂盒。
背景技术：
核酸的鉴定在分析化学中已成为一种重要的工具，特别是在保健中。例如，在个体来源的样品中存在一定数量指示疾病或体质的核酸的基础上容易鉴定出感染的疾病和遗传体质。为此，利用核酸，优选寡核苷酸，与指示那种疾病或遗传体质的靶核酸序列特异性杂交建立了各种方法。灵敏的技术如分支DNA方法(美国专利Nos.5,681,702，5,597,909，5,545,730，5,594,117，5,591,584，5,571,670，5,580,731，5,571,670，5,591,584，5,624,802，5,635,352，5,594,118，5,359,100，5,124,246和5,681,697)，或检测在生物体中高拷贝数存在的rRNA靶核酸的方法(Ep0272009)，都可以直接用来检测那种生物体来源样品中的靶核酸。但是有许多靶核酸在生物体中存在的量非常低，以至于不可能从该生物体得到的样品中直接检测。这样的靶核酸需要在检测前扩增。适用的扩增方法可以是例如LCR(美国专利Nos.5,185,243，5,679,524和5,573,907；EP 0 320 308 B1；WO90/01069；WO89/12696；和WO89/09835)，循环探针技术(美国专利Nos.5,011,769，5,403,711，5,660,988，和4,876,187，和PCT公开申请WO95/05480，WO95/1416，和WO95/00667)，侵入物TM技术(技术专利Nos.5,846,717；5,614,402；5,719,028；5,541,311；和5,843,669)，Q-Beta复制酶技术(美国专利No 4,786,600)，NASBA(美国专利No.5,409,818；EP～0 329 822)，TMA(美国专利Nos.5,399,491，5,888,779，5,705,365，5,710,029)，SDA(美国专利Nos.5,455,166和5,130,238)和PCR(US-A-4,683,202)。
为将核酸检测的错误结果降至最低，几个国家的权威要求使用对照核酸。特别是使用扩增方法时，这种对照核酸是十分重要的，因为反应条件可强烈影响扩增过程，从而得到错误的结果。有时抑制物质也包含在样品中，其可能导致错误的阴性结果。
一般情况下，可以区别外部对照和内部对照。外部对照，如经典的阳性和阴性对照经常用于检测试验是正确进行还是掺入了污染物。内部对照举例来说可以用于识别样品中可能含有的抑制物质，或者能在定量测试中作为定量标准。与通常在独立的反应室内测定的外部对照相反，内部对照优选与待分析物一起在同一个反应室内孵育。所以，对照或对照的扩增产物必须能够与待分析物或待分析物的扩增产物区分开。当使用一种扩增方法时，内部对照核酸基本与靶核酸在相同反应条件下共扩增。这些条件包括试剂浓度，温度，抑制剂浓度或酶活性。经常使用的对照序列来源于管家基因(见Chelly等(1990)欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem)187；691-698；Mallet等.(1995)临床微生物杂志(J.Clin.Microbiol)，333201-3208)，但是也使用非天然的序列(Resnard等(1995)临床微生物杂志(J.Clin.Microbiol)32.1887-1893；Gilliland等(1990)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)872725～2729；Wang等(1989)美国国家科学院院干Proc.Natl，Acad.Sci.USA)9717-9721)。
内部对照来源的扩增核酸与靶核酸来源的扩增核酸能够区别开，例如通过它们不同的长度或与特殊探针的杂交能力(见Clementi等(1990)PCT方法应用(PCRMethods Applic)2191-196；Clementi等(1995)病毒手册(Arch.Virol.)1401523-1539)。在任何情况下，内部对照的核苷酸序列与靶核酸序列是部分或全部不同的。因为核酸的序列和长度决定它的GC含量，二级结构和熔解温度，所以，对其在杂交反应和扩增反应中的表现很重要。几乎在所有情况下，一个内部对照的不同序列导致该对照核酸与靶核酸具有不同的表现。与此相反，为正确监测反应，一个理想的内部对照应该精确地模仿靶核酸。
扩增反应中一个最重要的方面是引物与靶核酸的结合。所以，使用与靶核酸具有相同引物结合位点的内部对照(例如见Gilliland等(1990)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87；2725-2729；Wang等(1989)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9717-9721；US5,219,727)。这样可能引起与引物的竞争反应，并且可能降低实验的灵敏度。
Gilliland等人(1990)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87；2725-2729叙述了与靶核酸具有几乎相同核苷酸序列的内部对照，但包含一个新的限制性酶切位点，或含有靶核酸不具备的内含子区序列。由于内部对照与靶核酸非常高的同源性，这两种核酸及其扩增物可以互相杂交。根据所用检测方法，可导致错误的结果，特别是在定量实验中。而且，所述方法需要精细的技术，如对扩增产物进行限制性酶消化和琼脂糖凝胶电泳。
本发明的一个目的是提供一种改进的鉴定核酸的方法，尤其是避免已知方法中所有或部分的不足。
发明概述本发明主要目的是提供与靶核酸的属性相似的核酸，包括长度，G/C含量，二级结构和折叠动力学性质，以及更多方面，而该核酸能根据它们的序列与各自靶核酸轻易地区分开。为实现该目的，构建一个序列，其基本上包括所述待测靶核酸区域或所述靶核酸区的互补链，且其至少部分与靶核酸链平行互补或与其互补链互补。多数情况下，对照核酸序列的一个或几个平行互补部分可从短链，例如至少8个核苷酸，优选至少10个核苷酸，延伸至待测靶核酸的全长。本发明中优选的平行互补部分包括探针结合位点序列。
另一优选方面，尤其是待测靶核酸区被扩增用于鉴定时，本发明中对照核酸也可包括引物结合位点，该结合位点与靶核酸区各自的引物结合位点平行互补。
这种对照核酸可用于例如杂交和扩增方法中作为内部对照，所以在化学分析和医学诊断领域中很有用。
本发明还涉及扩增样品中靶核酸序列的方法，包括步骤扩增所述靶核酸区和已知量的对照核酸，所述对照核酸基本上包含所述待扩增靶核酸区或所述靶核酸区的互补序列，从而所述基本上包含所述待扩增靶核酸或所述靶核酸互补区的对照核酸序列包括至少一个连续的，至少8个核苷酸的，基本平行互补于所述靶核酸或所述靶核酸互补链的序列。
涉及扩增方法，这种对照核酸具有额外的优点。如果这些核酸的引物结合位点与靶核酸的引物结合位点平行互补，那么这些对照与结合到靶核酸的引物特性相近，尽管引物结合位点的序列和对照核酸的引物区别于靶核酸的引物。避免了靶核酸与对照扩增引物的竞争，提高了实验的灵敏度和线性范围。
所述的对照可以用在任何用于鉴定核酸的杂交和扩增方法中。可根据是否需要一个反应待测靶核酸特征的对照，来决定是否使用本发明的对照核酸，该对照可单独被检测出。
附图简要说明
图1显示一例核苷酸序列及其平行互补序列，以及它们形成相似二级结构的能力。(QS在定量或定性实验中所用对照核酸)图2显示使用Mfold 3.0版(copyright 1996 Dr.M.Zuker，M.Zuker，D.H.Mathews & D.H.Turner，RNA二级结构预测的算法和热动力学实验指南(Algorithmsand Thermodynamics for RNA Secondary Structure PredictionA Practical Guide)，RNA生物化学和生物技术(In RNA Biochemistry and Biotechnology)，J.Barciszewski &B.F.C.Clark编著，NATO ASI系列，Kluwer Academic Publishers，(1999))对探针ST650(HCV-特异性探针)，ST650pc(与ST650平行互补)和ST2535(不相关序列)进行的二级结构预测结果。
图3显示使用Mfold3.0版对引物ST280(HCV-特异性)，ST280pc(与ST280平行互补)，ST778(HCV特异性)和ST778pc(与ST778平行互补)进行的二级结构预测结果。
图4显示使用Mfold3.0版对HCV-扩增子，QS(pc)HCV-扩增子(与HCV-扩增子平行互补)和QSHCV-扩增子(含有一个拼凑(Scrambled)核苷酸序列，一个ST2535探针结合序列，一个ST280和ST778引物结合位点的对照扩增子，且与HCV-扩增子长度相同)进行的二级结构预测结果。
图5显示来源于不同的内部标准QSHCV-扩增物(Seq.ID No.14)和QS(pc)HCV-扩增物(Seq.ID No.13)的扩增核酸与HCV-1b扩增产物比较的退火曲线。
发明详述本发明主要基于以下发现相较于该第一核酸序列，具有与另一第二核酸序列平行互补序列的第一核酸具有非常相似的杂交属性，该属性取决于它的长度，GC含量，Tm和二级结构，尽管序列是彻底不同的。这样的核酸可作为对照核酸用于靶核酸测定，因为对照核酸和靶核酸及其扩增物具有非常相似的杂交性质，但仍可根据它们不同的序列而分别检测出来。
本发明优选的对照核酸基本上包括待测靶核酸的区，特征在于基本包括所述待测靶核酸的区或所述靶核酸互补序列的所述对照核酸的区包含至少一个连续的，至少8个核苷酸，与所述靶核酸或与所述靶核酸的互补链基本上平行互补的序列。
本文中所述基本上包含待测靶核酸的区是指该对照核酸的该区由一个或多个部分构成，从而每一部分的序列与待测靶核酸区的相应部分或其互补链基本相同或基本平行互补。所以，对照核酸的这个区或者是基本上相同的，或者是平行互补的，或者是部分基本平行互补的，而另一部分与待测靶核酸的相应区或与靶核酸的互补链基本相同。所以，这种对照核酸区具有与待测靶核酸区或靶核酸的互补链基本相同的杂交属性。如果对照核酸中结合过多的基本平行互补和基本相同部分，则可能在二级结构行为上发生轻微的改变，但这并不影响GC含量。为保证对照仍模拟靶核酸的表现，优选包含待测靶核酸序列的对照核酸序列由少于10，更优选少于6个，基本平行互补或基本相同的部分构成。
由于基本相同或相同序列不易区分，所以，为单独鉴定出靶核酸与对照核酸及其扩增物，例如用探针杂交的方法，含有待测靶核酸区的对照核酸区包含与所述靶核酸序列基本平行互补的至少一个连续的至少8个核苷酸的序列是很重要的，更优选至少一个至少10个核苷酸的序列。
当靶核酸序列的互补链的序列在反向阅读时，如果第一核酸的序列与第二核酸序列的互补链或与其部分的序列相同，则第一核酸的一部分是与第二核酸或其部分平行互补的。对于天然核酸而言，这表明阅读是从3’-末端至5’-末端。图1给出了一个实例。核酸序列5’-AGCGCATGCCAGATTACTGGC-3’(Seq.ID No.1)的平行互补序列是5’-TCGCGTACGGTCTAATGACCG-3’(Seq.ID No 2)。互补链的平行互补序列是5’-CGGTCATTAGACCGTACGCGA-3’(Seq.ID No.17)。
本发明中对照核酸各部分不必与靶核酸100％相同或100％平行互补，但优选与靶核酸100％相同或100％平行互补。如果这些部分是基本相同或基本平行互补就足够了。基本相同表示对照核酸的该部分或这些部分与靶核酸的相应部分具有高于80％的同源性，更优选高于90％。基本平行互补表示对照核酸的该部分或这些部分与靶核酸的相应部分相比同源性高于80％，更优选高于90％平行互补。
为精确测定同源性和互补性，优选使用合适的计算机程序，如FastA(Pearson和Lipman)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85；2444-2448(1988)；Wisconsin package(TM)version of FastA，默认设置wordsize 2(p-p)，6(n-n)；不显示E( )值高于10.0(p-p)，2.0(n-n)的分数)。
本发明对照核酸还可用于测定带有如等位形式的相关序列的靶核酸杂交和扩增反应，当用于此目的时，不必为靶核酸的每一个等位形式合成新的对照物。
本发明中用于杂交方法作为纯对照物监测例如一个探针杂交步骤的对照核酸基本包括待测靶核酸的区，特征在于，所述基本包含所述待测靶核酸区或所述靶核酸互补序列的对照核酸的区包含至少一个连续的，至少8个核苷酸的，与所述靶核酸或与所述靶核酸的互补链基本平行互补的序列。在这类方法中，最重要的区是靶核酸上靶特异性探针实际结合的区，该区实际是靶核酸要测定的区。所以，在多数情况下，内部对照包含这个区即可。如果这个区少于15个核苷酸，更优选少于10个核苷酸，则优选对照核酸的相应区与靶核酸的探针杂交区基本平行互补。如果靶核酸的探针杂交区长于15个核苷酸，更优选长于10个核苷酸，则对照核酸的相应区可以完全平行互补于靶核酸的探针杂交区，或者该区是部分基本平行互补，而其它部分是基本相同的。在用这种对照核酸的杂交中使用基本互补，优选互补探针，可模拟靶核酸与探针的杂交，但仍可单独检测出两种杂交混合物。
一个扩增对照物可以监测扩增过程。例如在典型的PCR方法中可包括引物杂交步骤，引物的延伸，扩增效率或/和进一步的探针杂交步骤。本发明中优选的扩增对照物可包含基本带有扩增靶核酸区的区域的侧翼区，因为对照物的扩增所用优选的引物是与根据对照物序列的靶核酸扩增引物基本平行互补或基本相同，更优选平行互补或相同的引物。所以对照核酸的扩增物不包含对照物的侧翼区，而只是基本含有扩增靶核酸区的区，并且这两种扩增物的长度基本相同。
如上所述，基本含有待扩增靶核酸区的对照核酸区，可由几个部分组成，各部份与靶核酸相应部分基本平行互补或基本相同。含有待扩增靶核酸区的对照核酸优选组合在表1中列出。
表1Id＝基本相同，Pc＝基本与靶核酸平行互补本发明中，只有碱基的序列是重要的，而其骨架不必是天然的糖-磷酸骨架。所以根据本发明，使用带有修饰的骨架或象多肽核酸(WO 92/20702)的非天然骨架核酸作为对照物也是可能的。当使用含有碱基类似物的对照核酸时，为尽量相似地模拟靶核酸的杂交表现，应注意这些碱基应该与靶核酸序列相应位置含有的互补天然碱基具有相似的属性。还应注意当使用对照核酸作为扩增对照核酸时，对照核酸的性质应该允许用所用的扩增方法扩增对照核酸。
本发明的对照核酸可在RNA或DNA编码链或其互补链的序列的基础上构建。对照物可以是例如化学合成的，然后在合适的载体如质粒，噬菌体核酸内克隆，或在细菌或病毒的基因组内克隆，或在构建它们时使用。这样的对照核酸可在体外扩增或者在含有对照物核酸序列的载体转染的细菌体内产生。这种对照核酸可直接用于测试或进行包装，例如作为盔甲RNA(armored RNA)(美国专利5,677,124)，或包装到脂质体中。
靶核酸是待测核酸。可以是任何来源的，例如类病毒，病毒，细菌或细胞来源。可来源于溶液，例如血液，血清，血浆或尿液，也可来源于悬浮物，可以固定于固体，含细胞的培养基，细胞涂片，固定细胞，组织切片或固定的生物。优选来源于溶液的待测核酸。待测核酸可进一步是例如通过重组，断裂，扩增从靶核酸得到的核酸，和/或RNA形成的cDNA。
靶核酸通常通过各种方法中的一种处理初始样品得到可使用的形式。这包括例如改变pH值(碱性的)，加热，循环变化温度(冻/熔)，改变生理生长条件，使用去污剂，离液盐或酶(如蛋白酶或脂酶)，以上方法可单独或结合使用。如果本发明中对照核酸在样品制备步骤之前或之中加入，这些对照核酸除在后续的扩增和/或杂交步骤中作为对照物外，还可用作样品制备过程中的对照物。为此目的，对照核酸可根据靶核酸的性质，作为DNA或RNA加入样品中。还可类似于象靶核酸那样进行包装，其经常包含在附着于蛋白的样品或其它细胞或病毒成份中。为更接近地模拟靶核酸，对照核酸可例如包装在一个蛋白外衣中，例如在盔甲RNA(armored RNA)中。
本发明对照核酸例如可用作对照物，优选作为内部对照，用在杂交方法中，例如分支DNA方法，或靶核糖体RNA的测定中，或也可以用于点阵杂交方法中。
它们还可例如在靶核酸扩增方法中作为对照物，优选作为内部对照，例如在TMA，SDA，NASBA，LCR和PCR中。优选方法是PCR。原则上，例如指示感染试剂或遗传体质的靶核酸被用作在合适反应条件下引物可序列特异性结合的模板。依据所用方法，使用聚合酶，引物可用核苷酸单体延长，或与周围另一个杂交引物连接。如果这种扩增产物本身可直接或间接用作模板，即可指数地扩增靶核酸。同样已知线性扩增方法。扩增产物可直接检测，如用琼脂糖凝胶电泳，或者通过与至少一个序列特异性探针进行进一步的杂交反应。
当与核酸模板杂交时，本发明的引物是可延长或可修饰的分子，优选由酶进行延长或修饰，更优选被例如原核生物来源的聚合酶延长或修饰。优选使用PCR热稳定聚合酶，例如T.aquaticus DNA聚合酶。延伸从单脱氧核苷三磷酸加入单核苷酸单元到所述引物的一个末端，优选3’-OH末端。引物的总长度和碱基序列由扩增反应所要求的特异性来指示。进行PCR优选的引物长度是含有从10到40个，最优选15-30个碱基的亚基，选自单核苷酸和/或核酸类似物单体。通常，这个长度的引物还可用于其它扩增方法。如果扩增所用引物不止一种，例如，当使用PCR或在一个反应中扩增多个靶核酸时，优选使用相互之间不能杂交的引物，因为它们不含有任何长于5个连续互补碱基的一段序列。
在PCR中，典型地选择引物的杂交位点，使得在延伸产物的杂交体中在它们的原3’末端之间有至少10个，但不多于1000个，优选100-500个核苷酸。
通常，重要的是，引物与靶核酸的结合足够强烈，以允许反应条件下的扩增，但必须注意该引物优选仅与靶核酸结合，而应该避免与样品中可能含有的其它核酸结合。所以，引物优选10-40个核苷酸长度，更优选15-30核苷酸长度。优选的引物是寡核苷酸。
探针是测定靶核酸或扩增靶核酸所用的分子。还可用于测定靶核酸或扩增靶核酸的序列。为此目的，可使用具有不同序列的探针。这样的探针还可用于例如测定靶核酸的不同等位形式，或测定靶核酸的种属特异性。探针优选寡核苷酸，但也可以使用其类似物，例如PNA。为允许序列特异性杂交，探针优选长于10个核苷酸，更优选10-40核苷酸长度。为检测出靶核酸，扩增物和相应的探针杂交复合物，所用的探针或/和引物可以与可直接或间接的被检测出，或可将靶核酸，扩增物和相应的探针杂交复合物固定到固相上的基团偶联。
本领域技术人员公知，标记物是鉴定存在分析物时可检测的或可制成能检测的基团。公知的标记物是荧光标记物，如荧光素；电化学发光标记物，如钌复合物；或可被另一分子实体识别的部分，如与被半抗原免疫产生的抗体识别的半抗原或可固定化的部分，如生物素(固定到链亲合素包被的固相上，如试管或小珠)。标记物例如可与探针或引物结合，或作为标记核苷三磷酸单位能被引入扩增核酸中。也可以使用标记物，它允许利用其它方法检测靶核酸或扩增靶核酸，如将标记物或标记的嵌入剂插入双链DNA。标记物还可用于检测引物或探针或任何整合了所述引物的产物，来检测由所述引物或探针和待测核酸形成的杂交物，或检测掺入了标记核苷酸的扩增靶核酸。
固相物是在反应混合物中基本上不溶的固体，例如小珠，网，试管的内表面，微量滴定板或设备的反应室。固相物基本上用于包含反应混合物，但当要对其结合一种可固定化的探针、引物或对照核酸时，固相物表面上可包括能够识别并结合所述探针、引物或对照核酸的部分的试剂或包被物。
使用异源检测方法，如探针杂交进行的检测，是在扩增步骤之后进行的。杂交复合物可在溶液中，或在固定到固相物上之后检测出。还已知同源检测形式，可不经过进一步的分离或清洗步骤在反应混合物中检测出扩增核酸。为此目的已知有几种探针杂交形式，如Taqman(美国专利号5210015和5487972)，荧光共振能量转移(US 4,996,143)，分子信号(Beacon)(WO-95/13399，美国专利号5,119,801和5,312,728)，Sunrise(美国专利号5,866,336)，Scorpions(PCT/GB98/03521)。这些方法可用于在整个扩增反应中检测合成扩增物的水平。当在反应中或鉴定多靶核酸时，使用内部对照，如本发明中的内部对照，可将每个靶核酸和对照物测量到的信号相互区别开。为此，可使用例如结合到不同探针或引物的不同标记物，就可同时测定反应混合物中的不同靶核酸和对照物或来源于这些核酸的扩增核酸。
本发明对照核酸为核酸，可以是化学合成，克隆，扩增或本领域公知的其它方法分离得到的。优选RNA或DNA单体制成的核酸，但也包括天然的或非天然的碱基或糖类似物。由于平行互补部分，对照核酸与靶核酸序列相比具有不同的序列，多数情况下，这样的序列必须通过已知的方法合成至少一次，如亚磷酰胺技术。为生产更长的本发明中的核酸，可合成短的，约40-120碱基长度的寡核苷酸，该核苷酸以交错方式使需要的对照核酸的两条链重叠。这些寡核苷酸经过杂交及其后的连接步骤后，该核酸例如可克隆到一个载体中，或者按照这里的描述直接使用。克隆的核酸可以进行扩增，例如在细菌中，并且使用标准方法(Sambrook等人，分子克隆实验手册(Molecular CloningALaboratory Manual)，冷泉港实验室，2001,ISBN 0879695765)分离。如果核酸是RNA，可使用载体在体外转录合成，载体包含一个合适的启动子序列，如T7噬菌体启动子序列。核酸可以裸核酸的形式使用，也可包装成颗粒，例如作为盔甲RNA(US5,677,124)，或者包装到类病毒，病毒，细菌或细胞生物体中。
这种核酸例如用于控制核酸杂交和扩增反应。可用于识别由样品中存在的抑制剂引起的假阴性结果，或者在定量实验中作为标准。对照可在不同容器中(外部对照)的平行反应中处理，或在相同的反应容器中(内部对照)和靶核酸一样共处理，后一种情况是优选的。
对照构建体中基本平行互补的部分可包括一个或多个探针结合位点或/和一个或多个引物结合位或/和一个或多个引物/探针侧翼区，多数情况是包括相应靶核酸的整个序列。
这即是说本发明的对照核酸的处理过程中，可以使用引物或/和探针，该引物或/和探针与处理靶核酸中所用的引物或/和探针是基本平行互补的，优选平行互补的。相应的引物和探针具有相同的GC含量和杂交属性，其主要反映探针和引物杂交效率和扩增效率，但与这些反应成分没有竞争，因为与对照核酸结合的引物或/和探针不能与靶核酸结合，反之亦然。如果样品中靶核酸的含量很小，这种竞争可能最终导致没有靶核酸的扩增物或只结合少量的探针。所以，使用平行互补引物和探针可提高灵敏度和实验的线性范围。尽管应注意到在靶核酸和对照核酸的扩增中使用相同的引物有一个优点一套引物就已足够，靶特异性引物的直接对照是可能的。
在定性实验中，本发明的对照核酸可用于鉴别假阴性结果，优选被用作内部对照。因为它可很接近地模拟靶核酸的能力，以同样的方式受抑制剂的作用。由于系统反应对抑制物质的产生非常敏感，特别是当反应中加入低浓度对照核酸的情况下。这种对照核酸还可用作标准物，优选作为内部标准物，例如作为标准化平行实验结果的方法。
在定量实验中，本发明的对照核酸可用作定量标准鉴定样品中含有的靶核酸的起始水平。已知量的标准核酸与靶核酸在基本相同的反应条件下共扩增，优选作为内部定量标准。扩增之后，或者在同源检测情况下，扩增反应期间，测定扩增靶核酸的数量和扩增标准核酸的量。使用这种方法，已知反应中起始标准核酸的数量，就可计算扩增前就存在于样品中的靶核酸的起始数量。本领域已知几种方法用于定量实验，包括例如使用内部标准曲线，外部标准曲线和Payan模型(例如见Haberhausen等，临床微生物杂志(Journal of ClinicalMicrobiology)，Vol 36，628-633页)。应注意不必测量合成扩增物的绝对量。为达到大多数目的，相对量就足够，可由例如扩增物与标记探针之间的杂交以及测定杂交复合物的信号强度来测定。
在一优选的实施方案中，在聚合酶链式反应(PCR)中使用本发明的对照核酸，在美国专利号4,683,195；4,683,202和4,965,188,Saiki等人，科学(Science)2301350-1354；mullis等，1986，冷泉港定量生物学研讨会(ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.)51263-273；和Mullis和Faloona，1987，酶学方法(Methods Enzymol.)155335-350中都已描述。
可在反应的某些阶段加入对照核酸。通常样品，如血液，血清，痰或组织样品中的核酸至少是经本领域公知样品制备方法部分提纯的。所用的特殊方法不是本发明中的关键部分。对照核酸可在样品制备之前加入，使对照核酸与样品中含有的靶核酸共处理，这样除可监测后续的扩增或/和探针杂交步骤之外，还可监测样品制备步骤。
二者择一地，对照核酸也可在样品制备后加入扩增反应混合物，以监测靶核酸和对照核酸的共扩增，但是也可在扩增后加入，在探针杂交步骤中加入，来监测杂交步骤。
优选地，用于扩增对照核酸的引物是与靶核酸扩增所用引物基本相同或基本平行互补的。由于这种特异性的对照引物具有与各靶特异性引物基本相同的熔解温度，与其它多扩增反应相比，更易于找到一个合适的温度循环条件来适合靶核酸和对照核酸的扩增。如果用探针鉴定对照核酸或扩增对照核酸，探针与靶核酸或扩增靶核酸鉴定所用探针相比基本平行互补，同样也易于找到合适的温度循环条件。
当使用PCR扩增靶核酸和对照核酸时，反应混合物除靶核酸外，一般还含有对照核酸，特异性引物和任选的同源检测探针，以及进一步的反应成分，如合适的缓冲液(如Tricine)，二价阳离子如Mg2+或Mn2+，一种聚合酶，优选热稳定聚合酶，以及四种脱氧核苷(dATP，dCTP，dGTP和dTTP)。扩增反应可应用本领域公知的热循环仪进行，如PE 9600(或ABI Prism 7700)(Perkin Elmer Corp.)使用温度循环方案，进行双链核酸的变性，引物与靶核酸和对照之间的序列特异性杂交，以及聚合酶催化的引物延长。为合成足够量的扩增核酸进行测定，这个温度循环可以根据需要不断反复。通常进行30-40个循环。
如果扩增核酸是在扩增后由探针杂交鉴定，扩增的核酸被碱或加热变性，中和(如果必要的话)，加入探针，在合适的条件下(温度和化学环境)，探针与扩增核酸杂交。这种条件可由实验人员进行一些比较实验而容易确定。特异性杂交复合物可使用标记物和其它所述检测方法检测出来。
同源鉴定形式中，在扩增反应混合物中检测扩增核酸，优选在扩增反应期间检测。如果扩增的核酸是通过特异性探针鉴定的，则探针应在开始扩增反应之前加入到扩增反应中。此外，这种测定形式还有一个优点在扩增后，通常不需要打开试管，减小了污染风险。在扩增反应中，探针与扩增核酸的杂交可使用不同方法监测。最常见的是，用荧光标记物标记探针，如果将合适的检测仪装配到热循环仪上(即ABI Prism 7700，Perkin Elmer)，则可在反应进行期间检测出来。为仅仅检测出已杂交的或者与特异性扩增核酸杂交的探针，已建立了本文提及的几种形式。使用TaqMan形式，杂交的探针用聚合酶部分消化，从探针的5’末端切去第一个淬火的标记物，就可以测量出探针上第二个标记物，优选荧光标记物，所发出的信号。这个荧光信号用作反应中合成的特异性扩增核酸量的量度。由于对照核酸的特异性探针优选具有另一荧光标记物，比对靶核酸特异性的探针发出的光多具备另一波长，这两种探针的信号可在相同的反应试管中分别测量出。两种信号可用于计算，如计算样品中存在的靶核酸的起始量。
本发明的一个优选目的是用于定量测量靶核酸的方法，包括如下步骤a)扩增所述靶核酸的区和已知量的对照核酸，所述对照核酸基本包括所述待扩增靶核酸区或所述靶核酸区的互补序列，从而所述基本包括所述待扩增靶核酸区或所述靶核酸互补序列的对照核酸区，包含至少一个连续的，至少8个核苷酸的，基本平行互补于所述靶核酸或所述靶核酸互补链的序列。
b)检测指示从所述对照核酸获得的扩增产物量的信号，检测指示从所述靶核酸获得的扩增产物量的信号c)利用所述已知量的对照核酸，步骤b中指示从所述测定的对照核酸获得的扩增产物量的信号，和步骤b中指示从所述测定的靶核酸获得的扩增产物量的信号，来计算所述靶核酸的量。
本发明的进一步目的是在反应中用于扩增靶核酸区的一种对照核酸，所述对照核酸基本包含所述待扩增靶核酸的区或所述靶核酸区的互补序列，从而所述基本包括所述待扩增靶核酸区或所述靶核酸互补序列的对照核酸区，包含至少一个连续的，至少8个核苷酸的，基本平行互补于所述靶核酸或所述靶核酸互补链的序列。
本发明的进一步目的是一种包含靶核酸和对照核酸的组合物，该组合物存在于杂交或扩增反应混合物中，目的是检测靶核酸区，从而所述对照核酸基本包括所述待测靶核酸区或所述靶核酸区的互补序列，其特征在于所述基本包括所述待测靶核酸区或所述靶核酸互补序列的对照核酸区包含至少一个连续的，至少8个核苷酸的，基本平行互补于所述靶核酸或所述靶核酸互补链的序列。
本发明的进一步目的是一种用于扩增靶核酸的试剂盒，包括指导手册，至少一个至少含有对照核酸的容器，其中所述对照核酸基本包括待扩增靶核酸区或所述靶核酸区的互补序列，其特征在于所述基本包括所述待扩增靶核酸区或所述靶核酸互补序列的对照核酸的区包含至少一个连续的，至少8个核苷酸的，基本平行互补于所述靶核酸或所述靶核酸互补链的序列。进一步优选的试剂盒除包括指导手册和对照核酸外，还包括其它反应成分如靶特异性或对照特异性探针，靶特异性或对照特异性引物，反应缓冲液，核苷三磷酸或酶，如聚合酶。这些成分可包装在这样一种试剂盒的第一容器内，但是也可包装在一个或多个另外的容器内。还优选用于用杂交方法检测靶核酸的试剂盒，包括指导手册，至少一种本发明的对照核酸。
本发明的另一目的是使用对照核酸，在扩增靶核酸区的反应中作为对照物，或在鉴定靶核酸区的杂交反应中作为对照物，从而所述对照核酸基本包括待扩增或待杂交靶核酸的区或所述靶核酸区的互补序列，其特征在于所述基本包括所述待扩增或待杂交靶核酸区或所述靶核酸互补序列的对照核酸区包含至少一个连续的，至少8个核苷酸的，基本平行互补于所述靶核酸或所述靶核酸互补链的序列。
本发明由以下实施例具体说明实施例实施例1设计一个探针序列，与HCV靶探针序列平行互补为在Taqman实验中检测HCV核酸，可使用下述与HCV-扩增子(Seq.ID No，10)结合的探针ST650(Seq.ID No 3)5’(Cy5-)CGG TGT ACT CAC CG(FAMs)TTC CGCAGA CCA CTA TGG C-PO4-3’Cy5使用烷基磷脂-接头(Pharmacia Biotech Cy5-N-乙基-亚磷酰胺)Fams，带有五次甲基-二-靛炭花青苷寡核苷酸衍生物；使用2-(氨基-环己基-)丙-1，3-二醇-接头(Biogenex CX-FAM-亚磷酰胺)，带有6-羧基-荧光素的寡核苷酸衍生物。
本申请中包括的所有HCV特异性序列都衍生自I型HCV基因组(NCBI，GenbankAccession No.AF054249或AJ000009)。
最好的情况是内部对照检测的探针精确模拟靶探针，但又能跟靶探针区别开。靶探针的平行互补序列，称为ST650pc(Seq.ID No.5)，可用作这样一种内部对照探针。ST650pc与靶探针具有相同的GC含量，GC/AT序列，长度，二级结构，所以，也具有相同的熔点。进一步地，由于G和A可分别被C和T代替，并且反之亦然，就可与靶探针区别开，ST2535(Seq.ID No.4)包含与HCV不相关的序列，例如与HCV序列不基本相同或基本平行互补。包含ST2535结合序列的内部对照可与探针ST2535共同使用，作为靶核酸鉴定反应的对照。含有与靶核酸序列不相关序列的探针和对照物经常在本领域使用。相反，所述ST650pc(Seq.ID No.5)具有极好的模拟靶探针的潜力。ST650pc(Seq.ID No.5)探针可与所有的内部对照或包含ST650pc结合序列的定量标准构建物共同使用。
ST2535(Seq.ID No.4)；5’(Cy5～)TGG ACT CAG TCC T(HEXs)T GGT CAT CTC ACC TTC T-PO4 3’HEXs使用2-(氨基-环己基)-丙-1，3-二醇-接头(Biogenex CX-HEX-亚磷酰胺)，带有六氯-6-羧基-荧光素的寡核苷酸衍生物ST650pc(Seq.ID No.5)5’(CY5-)GCCACATGAGTGGC(HEXs)AAGGCGTCTGGTGATACCG-PO43’使用Mfold 3.0版软件(copyright 15 1996 Dr.M.Zuker，M.Zuker，D.H.Mathews & D.H.Turner，RNA二级结构预测的算法和热动力学(AlgoridimsandThermodynamics for RNA Secondary Structure PredictionA Practical Guide)，RNA生物化学和生物技术(In RNA Biochemistry and Biotechnology)，J.Barciszewsri &B.F.C.Clark，编著，NATO ASI系列，Kluwer Academic Publishers，(1999))预测二级结构。如图2所示，预测出的靶探针与平行互补探针之间二级结构相同。
实施例2设计引物序列，与HCV靶引物序列平行互补，比较靶引物和平行互补引物形成的可能形成的二级结构为扩增HCV核酸，使用下列引物ST280(Seq ID No 6).
5’GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA3’ST778(Seq ID No 7)5’GCA AGC ACC CTA TCA GGC AGT ACC ACA A3’这些扩增引物的平行互补序列是ST280 pc(Seq ID No 8)5’CGT CTT TCG CAG ATC GGT ACC TCAAT3’ST778pc(Seq ID No 9)5’CGT TCG TGG GAT AGT CCG TCA TGG TGT T3’这些设计的内部引物用于扩增内部对照。由于靶序列和内部对照使用不同扩增引物，内部对照的扩增是非竞争性的。但是，设计的平行互补引物与靶引物结构十分接近，涉及GC含量，GC/AT序列，长度，二级结构和因之的熔点。ST280 pc和ST778 pc可用作所有内部对照的扩增引物和非竞争性的，定量的，带有合适引物结合位点的标准构建物。
使用Mfold 3.0版软件预测靶引物和平行互补引物之间的二级结构是相同的(见图3)。
实施例3非竞争性定性和定量HCV核酸检验中，与HCV序列平行互补的内部对照的构建克隆双链DNA片段，使用60-120b长度的重叠寡核苷酸，其中寡核苷酸与包含高度保守5’-UTR区的I型HCV基因组的5’一片段平行互补。合成的克隆片段具有943bp长度，克隆到一个RNA表达载体(AMBION，Austin，USA)中的BglIIHindIII位点。表达产生包含包括MS-2外被蛋白的基因，MS-2包装信号和5’HCV片段的平行互补序列的RNA的盔甲RNA颗粒。这种RNA可与靶核酸区别开，但由于平行互补性，GC含量和G或C和A或T核苷酸的序列与相应的HCV片段相同，这些性质主要影响其二级结构。该构建物被共扩增，并且与HCV靶核酸(Seq.ID No 10)一起在相同的反应中，分别使用实施例2和1中提及的引物和探针，以非竞争性方式，检测出来。
QS(pc)HCV(Seq.ID No 10)的克隆BglII/HindIII片段的序列SEQ New943 bp；组成203A；287C；282G；171T；0其它百分比22％A；30％C；30％G；18％T； 0％其它分子量(kDa)单链DNA；291.24双链DNA581.5起始BglII1AGATCTCCGC TGTGAGGTGG TATCTAGTGA GGGGACACTCCTTGATGACA GAAGTGCGTC61 TTTCGCAGAT CGGTACCGCAATCATACTCA CAGCACGTCGGAGGTCCTGG GGGGGAGGGC121 CCTCTCGGTA TCACCAGACG CCTTGGCCAC TCATGTGGCCTTAACGGTCC TGCTGGCCCA181 GGAAAGAACC TAGTTGGGCG AGTTACGGACCTCTAAACCC GCACGGGGGC GCTCTGACGA241 TCGGCTCATC ACAACCCAGC GCTTTCCGGA ACACCATGACGGACTATCCC ACGAACGCTC301 ACGGGGCCCT CCAGAGCATC TGGCACGTGG TACTCGTGCTTAGGATTTGG AGTTTCTTTT361 TGGTTTGCAT TGTGGTTGGC GGCAGGTGTC CTGCAGTTCAAGGGCCCGCC ACCAGTCTAG421 CAACCACCTC AAATGGACAA CGGCGCGTCC CCGGGGTCCAACCCACACGC GCGCGAGTCC481 TTCTGAAGGC TCGCCAGCGT TGGAGCACCT TCCGCTGTTGGATAGGGGTT CCGAGCGGGCT541 GGGCTCCCGT CCCGGACCCG AGTCGGGCCC ATGGGAACCGGGGAGATACC GTTACTCCCG601 TACCCCACCC GTCCTACCGA GGACAGTGGG GCACCAAGAGCCGGATCAAC CCCGGGGAGT661 CTGGGGGCCG CATCCAGCGC ATTAAACCCA TTCCAGTAGCTATGGGAATG TACGCCGAAG721 CGGCTGGAGT ACCCCATGTA AGGCGAGCAG CCGCGGGGAGATCCCCCGCG GCGGTCCCGG781 GACCGCGTAC CGCAGGCCCA AGACCTCCTG CCGCACTTGATACGTTGTCC CTTAAACGGG641 CCAACGAGAA AGAGATAGAA GGAGAACCCA AACGACAGAACAAACTGGTA GGGTCGAAGG901 CGAATACTTC ACGCGTAAAC ATGAGGATTA CCCATGTAAG CTTHindIII粗体印刷当使用引物ST280pc和ST778pc扩增时的扩增子(Seq.ID No12)。
实施例4比较单链HCV靶核酸扩增子与单链内部对照复制子和拼凑的内部对照扩增子QSHCV(Seq ID No 13)形成的可能形成的二级结构。
拼凑的对照核酸(Seq ID No 13)具有一个ST280和ST778引物结合位点，一个ST2535探针结合位点，并与HCV靶核酸扩增子具有相同的长度和相同的GC含量。用Mfold3.0版进行空间折叠，见图4。
HCV和平行互补QS(pc)HCV扩增子具有形成相似二级结构的潜力。区别于本领域的拼凑内部对照(QSHCV)扩增子(Seq ID No 13)形成的结构。由于QS(pc)HCV扩增子(Seq ID No 12)是HCV靶扩增子的非常接近的模拟物，QS(pc)HCV(Seq.ID No 11)是比对照靶扩增子更好的选择。
实施例5克隆内部对照，用于带有天然引物结合位点的HCV(ICSJ62OHCV)的竞争性，定量和定性核酸检测根据实施例3，克隆合成的375bpDNA片段，该片段除具有引物结合位点外，还与I型HCV5’UTR平行互补。引物结合位点与靶序列相同，以引起靶序列和对照序列之间的竞争性PCR。两种引物之间的序列是平行互补的，以达到模拟靶序列的目的。由于引物之间GC含量，长度和G/C及A/T的序列与靶序列相同，该构建体与靶扩增子非常接近。该构建物被共扩增，并且与HCV靶物一起在相同的反应中，使用实施例1中提及的靶扩增引物和平行互补探针，以竞争方式，检测出来。
ICSJ620HCV(Seq.ID No 14)SEQ New375bp；组成76A；104C；117G；78T；0其它百分比20％A；28％C；31％G；21％T；0％其它分子量(kDa)单链DNA116.05双链DNA 231.2起始BglII1AGATCTCGGT CGGGGGACTA CCCCCGCTGT GAGGTGGTACTTAGTGAGGG GACACTCCTT61 GATGACAGAA GTGGCAGAAA GCGTCTAGCC ATGGCGTTACATACTCACAG CACGTCGGAG121 GTCCTGGGGG GGAGGGCCCT CTCGGTATCACCAGACGCCT TGGCCACTCA TGTGGCCTTA181 ACGGTCCTGC TGGCCCAGGA AAGAACCTAGTTTGGGCGAG TTACGGACCT CTAAACCCGC241 ACGGGGGCGC TCTGACGATC GGCTCATCACAACCCAGCGC TTTCCGGTTG TGGTACTGCC301 TGATAGGGTG CTTGCCTCGA GGGGCCCTCC AGAGCATCTGGCACGTGGAA ACATGAGGAT361 TACCCATGTAAGCTTHindIII粗体印刷使用引物ST280和ST778扩增时的扩增子(Seq.ID No 15)实施例6比较HCV1b野生型，QSHCV和QS(pc)HCV的退火曲线扩增HCV1b野生型，QSHCV和QS(pc)HCV相关片段，然后扩增产物用于退火实验，使用SybrGreen作为嵌入剂，得到扩增子的折叠动力学性质。
1000 IUHCV-1b RNA，QSHCV或QS(pc)HCV在可比较的浓度(IU；国际单位，WHO-标准)5％DMSO5.64％ 甘油50mM Tricine(pH＝8.3)100mM KOAc(pH＝7.5)300μM dNTP(A，C，G)50μM dTTP500μM dUTPpmol NTQ21-46-A(Aptamer，Sequence；CGA TCA TCT GAGAAC ATT CTT AGC GTT TTG TTC TTG TGT ATGATC G-PO4)40UZO5聚合酶10UUNG.(尿嘧啶-N-糖基化酶)3mMMn(Ac)212μl Sybr-Green(1∶300稀释度from Molecular Probes，LeidenNetherlands；在DMSO中10000x浓缩)ad 100μl 水DEPC-处理的引物HCV-1b和QSHCV的扩增引物15pmol ST28040pmol ST778QS(pc)HCV扩增引物15pmol ST280pc40pmol ST778pc聚合酶ZO5如美国专利号5,455,170和美国专利号5,674,738所述。扩增循环(50℃ 240s59℃ 1800s)1x(95℃ 15s
58℃25s)5x(91℃ 15s58℃25s)55x退火曲线0.5℃ 步骤从90℃起始，冷却到70℃每个步骤20s用ABI Prism 7700(Perkin Elmer Corp.)完成扩增和退火曲线(通过Sybr-Green插入检测)比较退火曲线(见图5)实验参考是HCV-1b扩增子的退火曲线。本领域使用的内部对照构建物QSHCV显示高于熔点温度的退火曲线，而平行互补对照序列QS(pc)HCV的退火曲线与HCV-1b扩增子的退火曲线吻合得很好。
序列表<110>F.Hoffmann-La Roche AG<120>使用对照物测定核酸的方法<130>18981<140><141><160>17<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明例证原则的人工序列<400>1agcgcatgcc agattactgg c 21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明例证原则的人工序列<400>2tcgcgtacgg tctaatgacc g 21<210>3<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明ST650 HCV特异性探针序列<220><221>N区<222>(15)<223>n代表无碱基接头((2-氨基-环己基-)丙-1，3-二醇)<400>3cggtgtactc accgnttccg cagaccacta tggc 34<210>4<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明ST2535探针序列<220><221>N区<222>(15)<223>n代表无碱基接头((2-氨基-环己基-)丙-1，3-二醇)<400>4tggactcagt cctntggtca tctcaccttc t 31<210>5<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明ST650pc探针序列(平行互补于ST650)<220><221>N区<222>(15)<223>n代表无碱基接头((2-氨基-环己基-)丙-1，3-二醇)<400>5gccacatgag tggcnaaggc gtctggtgat accg 34<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明ST280 HCV特异性引物序列<400>6gcagaaagcg tctagccatg gcgtta26<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明ST778 HCV特异性引物序列<400>7gcaagcaccc tatcaggcag taccacaa 28<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明ST280pc引物平行互补于ST280<400>8cgtctttcgc agatcggtac ctcaat26<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明ST778pc引物平行互补于ST778<400>9cgttcgtggg atagtccgtc atggtgtt 28<210>10<211>241<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明使用引物ST280和ST778扩增I型HCV得到的DNA序列<400>10gcagaaagcg tctagccatg gcgttagtat gagtgtcgtg cagcctccag gaccccccct 60cccgggagag ccatagtggt ctgcggaacc ggtgagtaca ccggaattgc caggacgacc 120gggtcctttc ttggatcaac ccgctcaatg cctggagatt tgggcgtgcc cccgcgagac 180tgctagccga gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg 240c 241<210>11<211>943<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明平行互补于I型HCV基因组的QS(pc)HCV<400>11agatctccgc tgtgaggtgg tatctagtga ggggacactc cttgatgaca gaagtgcgtc 60tttcgcagat cggtaccgca atcatactca cagcacgtcg gaggtcctgg gggggagggc 120cctctcggta tcaccagacg ccttggccac tcatgtggcc ttaacggtcc tgctggccca 180ggaaagaacc tagttgggcg agttacggac ctctaaaccc gcacgggggc gctctgacga 240tcggctcatc acaacccagc gctttccgga acaccatgac ggactatccc acgaacgctc 300acggggccct ccagagcatc tggcacgtgg tactcgtgct taggatttgg agtttctttt 360tggtttgcat tgtggttggc ggcaggtgtc ctgcagttca agggcccgcc accagtctag 420caaccacctc aaatggacaa cggcgcgtcc ccggggtcca acccacacgc gcgcgagtcc 480ttctgaaggc tcgccagcgt tggagcacct tccgctgttg gataggggtt ccgagcggct 540gggctcccgt cccggacccg agtcgggccc atgggaaccg gggagatacc gttactcccg 600taccccaccc gtcctaccga ggacagtggg gcaccaagag ccggatcaac cccggggagt 660ctgggggccg catccagcgc attaaaccca ttccagtagc tatgggaatg tacgccgaag 720cggctggagt accccatgta aggcgagcag ccgcggggag atcccccgcg gcggtcccgg 780gaccgcgtac cgcaggccca agacctcctg ccgcacttga tacgttgtcc cttaaacggg 840ccaacgagaa agagatagaa ggagaaccca aacgacagaa caaactggta gggtcgaagg 900cgaatacttc acgcgtaaac atgaggatta cccatgtaag ctt943<210>12<211>241<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明使用引物ST280pc和ST778pc从QS(pc)HCV衍生的扩增子<400>12cgtctttcgc agatcggtac cgcaatcata ctcacagcac gtcggaggtc ctggggggga 60gggccctctc ggtatcacca gacgccttgg ccactcatgt ggccttaacg gtcctgctgg 120cccaggaaag aacctagttg ggcgagttac ggacctctaa acccgcacgg gggcgctctg 180acgatcggct catcacaacc cagcgctttc cggaacacca tgacggacta tcccacgaac 240g 241<210>13<211>241<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明使用引物ST280和ST778从QSHCV(具有ST280，ST778和ST2535结合位点的HCV扩增对照)衍生的扩增子序列<400>13gcagaaagcg tctagccatg gcgttagtat agtggcgtga gagcagccct tgcctcgccc 60accgcgcgtc tagaaggtga gatgaccaga ggactgagtc caatgcatgc tggctccgag 120atgctccgca aacttgccgt caacgtgact gcgtacggcg ggcgtgcccg cctggctgtg 180tatgagctgg tgaccgtgat ctggctggag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg 240c 241<210>14<211>375<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明ICSJ620HCV(具有ST280和ST778结合位点和平行互补于HCV的内部区的HCV特异性扩增对照)<400>14agatctcggt cgggggacta cccccgctgt gaggtggtac ttagtgaggg gacactcctt 60gatgacagaa gtggcagaaa gcgtctagcc atggcgttac atactcacag cacgtcggag 120gtcctggggg ggagggccct ctcggtatca ccagacgcct tggccactca tgtggcctta 180acggtcctgc tggcccagga aagaacctag tttgggcgag ttacggacct ctaaacccgc 240acgggggcgc tctgacgatc ggctcatcac aacccagcgc tttccggttg tggtactgcc 300tgatagggtg cttgcctcga ggggccctcc agagcatctg gcacgtggaa acatgaggat 360tacccatgta agctt 375<210>15<211>242<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明使用ST280和ST778作为引物从ICSJ620HCV(HCV特异性扩增对照)衍生的扩增子<400>15gcagaaagcg tctagccatg gcgttacata ctcacagcac gtcggaggtc ctggggggga 60gggccctctc ggtatcacca gacgccttgg ccactcatgt ggccttaacg gtcctgctgg 120cccaggaaag aacctagttt gggcgagtta cggacctcta aacccgcacg ggggcgctct 180gacgatcggc tcatcacaac ccagcgcttt ccggttgtgg tactgcctga tagggtgctt 240gc 242<210>16<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明NTQ21-46-A<400>16cgatcatctc agaacattct tagcgttttg ttcttgtgta tgatcg 46<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明例证原则的人工序列<400>17cggtcattag accgtacgcg a2权利要求
1.一种扩增样品中靶核酸区的方法，包括以下步骤扩增已知量的对照核酸和所述靶核酸，基本包括所述待扩增靶核酸的区或所述靶核酸区的互补序列的所述对照核酸特征在于基本包含所述待扩增靶核酸区或所述靶核酸互补序列的对照核酸区含有至少一个连续的，至少8个核苷酸的，基本平行互补于所述靶核酸区或所述靶核酸序列区的互补链的序列。
2.一种定量测定靶核酸区的方法，包括以下步骤a)扩增所述靶核酸区和已知量的对照核酸，所述对照核酸基本包括所述待扩增靶核酸区，或所述靶核酸区的互补序列，b)检测指示从所述对照核酸获得的扩增产物量的信号，检测指示从所述靶核酸获得的扩增产物量的信号，c)利用已知量的所述对照核酸，步骤b中检测得到的指示从所述对照核酸获得的扩增产物量的信号，和步骤b中检测得到的指示从所述靶核酸获得的扩增产物量的信号，来计算所述靶核酸的量，特征在于所述基本包括所述待扩增靶核酸区或所述靶核酸互补序列的对照核酸序列区包含至少一个连续的，至少8个核苷酸的，基本平行互补于所述靶核酸或所述靶核酸互补链的序列。
3.权利要求1或2的方法，其中利用PCR扩增所述靶核酸和所述对照核酸。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中扩增产物是同源检测的。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述靶核酸和所述对照核酸在同一反应容器内扩增。
6.扩增靶核酸区反应中的对照核酸，其中所述对照核酸基本包含所述待扩增靶核酸区或所述靶核酸区的互补序列，特征在于所述基本包括所述待扩增靶核酸区或所述靶核酸互补序列的对照核酸区，包含至少一个连续的，至少8个核苷酸的，基本平行互补于所述靶核酸或所述靶核酸互补链的序列。
7.权利要求6的对照核酸，其中所述对照核酸的至少一个引物结合位点序列平行互补于所述靶核酸的引物结合位点，或平行互补于所述靶核酸的互补链。
8.权利要求6的对照核酸，其中所述对照核酸的至少一个探针结合位点序列平行互补于所述靶核酸的探针结合位点，或平行互补于所述靶核酸探针结合位点的互补链。
9.含有权利要求6-8任一项的靶核酸和对照核酸的组合物。
10.权利要求9的组合物，进一步含有用于扩增所述靶核酸的引物和用于扩增所述对照核酸的引物。
11.扩增靶核酸的试剂盒，包含指导手册和至少一个容器，该容器内含有至少一种权利要求6-8中任一项的对照核酸。
12.在扩增靶核酸反应中，一种核酸作为对照物的用途，其中所述对照核酸基本包含所述待扩增靶核酸区或所述靶核酸区的互补序列，特征在于所述基本包括所述待扩增靶核酸区或所述靶核酸互补序列的对照核酸区，包含至少一个连续的，至少8个核苷酸的，基本平行互补于所述靶核酸或所述靶核酸互补链的序列。
13.在测定所述靶核酸的杂交反应中，一种核酸作为对照物的用途，其中所述对照核酸基本包含所述待测靶核酸的区或所述靶核酸区的互补序列特征在于所述基本包括所述待靶核酸区或所述靶核酸互补序列的核酸序列区包含至少一个连续的，至少8个核苷酸的，基本平行互补于所述靶核酸或所述靶核酸互补链的序列。
全文摘要
本发明涉及一种利用特异性对照核酸测定靶核酸的方法,一种利用引物和特异性对照物扩增所述靶核酸的部分序列的方法,一种含有所述对照物的试剂盒。这些对照核酸的序列至少部分平行互补于靶核酸的序列。这些对照物在杂交和扩增方法中具有与靶核酸类似的性质,但根据它们不同的序列可很清楚地与靶核酸区分开。
文档编号C12Q1/68GK1386865SQ0211921
公开日2002年12月25日 申请日期2002年3月2日 优先权日2001年3月2日
发明者S·耶格 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司