检测基因组核酸中遗传异常的测定法的制作方法

专利名称：检测基因组核酸中遗传异常的测定法的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因组核酸的检测。
背景技术：
提供下面的描述来协助读者理解。提供的信息或引用的参考文献都不被承认为本 发明的现有技术。遗传异常例如重复、缺失、染色体易位、点突变常常导致病理状态。一些疾病，诸如癌症，归因于生命过程中少数细胞中后天获得的遗传异常；而在其 它的疾病中，遗传异常存在于机体的所有细胞中，并且从受孕时就存在。为了检测遗传异常，有必要检测含有异常的基因组核酸。检测遗传异常诸如非整 倍性、易位、重复和缺失的方法是本领域熟知的。一种这样的方法包括细胞遗传学分析，其 中染色体的中期伸展被染色和显影。中期染色体显示出在染色体带型中显现的特殊的明暗 染色模式。分子细胞遗传学方法的发展提供了具有更大灵敏度的测定法。这些技术将DNA杂 交与放射标记的或荧光标记的探针相结合。例如，在荧光原位杂交(FISH)分析中，荧光探 针与中期或分裂间期染色体杂交。然后用荧光显微镜检测杂交的探针。然而，这些方法需 要完整的细胞或完整的或部分完整的细胞核。检测染色体异常的非原位杂交方法在本领域也是已知的。美国专利公开 2006/0292576描述了通过在固相支持体上杂交、捕获和检测基因组DNA来检测染色体异常 的方法。这种方法利用了对基因组核酸有特异性的两个探针。一个探针锚定在固相支持体 上，另一个探针是可检测到地标记的。第一个探针与基因组核酸的杂交将基因组核酸捕获 在固相支持体上，而来自第二个探针的可检测标记的信号用于检测基因组核酸。这种方法 需要通过核酸杂交将基因组核酸捕获到固相支持体上。一种检测单核苷酸多态性的方法是通过动力等位特异性杂交(DASH)。这种方法利 用错配碱基对的不稳定性导致的DNA解链温度(Tm)的差异。基因组片段例如通过PCR被扩 增，并粘附在固相支持体上。在结合于双链DNA时发荧光的分子存在的情况下，加入等位基 因特异的寡核苷酸。随着温度升高测量强度，直到Tm被确定。突变会导致较预期低的Tm， 从而可以与野生型序列区分开来。另一种检测单核苷酸多态性的方法是通过微阵列技术。基因组核酸最初被扩增， 然后通过与锚定在固相表面的探针杂交而被捕获到固相表面上。通过使用带有可检测标记 的第二探针的杂交来检测基因组核酸。发明概述本发明提供了检测测试样品中感兴趣的基因组核酸的方法，该方法没有扩增，也 不需要完整的细胞或细胞核。大体上，使基因组核酸与标记的探针杂交并通过与核酸杂交 不同的方式锚定在固相支持体上。通过检测固相支持体上的杂交复合体中的标记来检测基 因组核酸。该方法可用于检测遗传异常，例如点突变、基因重复或缺失以及染色体易位。该 方法还可用于疾病的诊断或预后。
一方面，本发明提供一种检测基因组核酸中的靶序列的方法，其如下实施a.将含有靶序列的基因组核酸样品与对所述靶序列有特异性的探针相接触，且在 固相支持体上形成包含所述基因组核酸和杂交到所述靶序列的探针的复合体，其中所述探 针含有可检测标记，所述基因组核酸通过除核酸杂交外的方式被锚定在固相支持体上，且 所述基因组核酸的靶序列还未被扩增；和b.通过检测标记与固相支持体的关联(或缔合，association)来检测基因组核酸 中靶序列的存在。另一方面，本发明提供一种检测基因组核酸中遗传异常存在或不存在的方法，其 如下实施a.将基因组核酸样品与对遗传异常有特异性的探针相接触，如果在基因组核酸中 存在遗传异常，则在固相支持体上形成包含基因组核酸和探针的复合体，基因组核酸通过 除核酸杂交外的方式被锚定在固相支持体上，且基因组核酸的靶序列还未被扩增；b.通过检测标记与固相支持体的关联来检测遗传异常的存在。另一方面，本发明提供一种检测基因组核酸中遗传异常的方法，其如下实施a.将含有遗传异常的基因组核酸样品与对遗传异常有特异性的第一探针相接触， 且在固相支持体上形成包含基因组核酸和第一探针的第一复合体，其中探针含有可检测标 记，基因组核酸通过除核酸杂交外的方式被锚定在固相支持体上且基因组核酸的靶序列还 未被扩增；b.将基因组核酸样品与对参考核酸有特异性的第二探针相接触，且在固相支持体 上形成包含参考核酸和第二探针的第二复合体，其中第二探针含有可检测标记；和c.通过检测与第一复合体相关的第一探针的可检测标记来测量形成的第一复合 体的量，以及通过检测与第二复合体相关的第二探针的可检测标记来测量形成的第二复合 体的量；和d.将第一复合体的量与第二复合体的量比较，其中两个复合体的量的差异指示遗 传异常。在一个任何上述方面的实施方式中，基因组核酸和参考核酸来自同一样品。在另 一个任何上述方面的实施方式中，基因组核酸和参考核酸来自不同样品，其可来自相同或 不同的个体。在另一个实施方式中，用相同的固相支持体测定第一复合体的量和第二复合 体的量，且第一探针和第二探针的可检测标记是不同的。另一方面，本发明提供一种检测基因组核酸中遗传异常的方法，其如下实施a.将含有遗传异常的基因组核酸样品与对该遗传异常有特异性的第一探针相接 触，且在固相支持体上形成包含基因组核酸和第一探针的第一复合体，其中探针含有可检 测标记，基因组核酸通过除核酸杂交外的方式被锚定在固相支持体上，且基因组核酸的靶 序列还未被扩增；b.将基因组核酸样品与对参考核酸有特异性的第二探针相接触，且在固相支持体 上形成包含参考核酸和第二探针的第二复合体，其中第二探针含有可检测标记；和c.通过检测与第一复合体相关的第一探针的可检测标记来测量形成的第一复合 体的量，和通过检测与第二复合体相关的第二探针的可检测标记来测量形成的第二复合体 的量；和
d.获得第一与第二复合体的量之比；和e.将获得的比与使用来自参考样品的基因组核酸而同样获得的比进行比较，其中 比值的差异指示遗传异常。在优选的实施方式中，基因组核酸和参考核酸通过生物素和抗生物素蛋白的相互 作用被锚定在固相支持体上。在另一个优选的实施方式中，固相支持体是珠子。在另一个 优选的实施方式中，用流式细胞术来检测第一和第二复合体。在本发明的所有方面的优选实施方式中，遗传异常是点突变、染色体易位、重复或 缺失。在一个实施方式中，本发明提供一种检测HER-2基因重复的方法。另一方面，本发明提供一种在个体中诊断的方法，其如下实施a.将来自个体的基因组核酸样品和与对疾病有特异性的核酸序列互补的探针相 接触，如果基因组核酸含有对疾病有特异性的核酸序列，则在固相支持体上形成包含基因 组核酸和探针的复合体，其中探针含有可检测标记，基因组核酸通过除核酸杂交外的方式 被锚定在固相支持体上，且基因组核酸的靶序列还未被扩增；和b.通过检测与支持体相关的可检测标记的量来测量在固相支持体上形成的复合 体的量；和c.将形成的复合体的量和使用来自在相似条件下检测的参考样品的基因组核酸 形成的复合体的量进行比较，其中从所述个体形成的复合体的量与参考样品相比的差异对 疾病有诊断价值。在一个实施方式中，参考样品可从假定为没有疾病的个体获得。在另一个实施方 式中，参考样品可从已知患有疾病的个体获得。在另一个实施方式中，参考样品从获得第一 个样品后的同一个体获得。在一个实施方式中，该方法可用于测量怀疑患有癌症的个体的 肿瘤负荷。在另一个实施方式中，该方法可用于疾病的预后。基因组核酸可被共价或非共价地锚定在固相支持体上。在本发明的所有方面的一 些实施方式中，基因组核酸可通过“结合对”被非共价地锚定在固相支持体上，在本文“结合 对”是指通过特异性相互作用形成复合体的两个分子。因此，基因组核酸能通过连接到基因 组核酸的结合对的一个成员与偶联到固相支持体的结合对的另一个成员之间的相互作用 被捕获在固相支持体上。在优选的实施方式中，结合对是生物素和抗生物素蛋白，或抗生物素蛋白的变体 例如链霉抗生物素和NeutrAvidin 。在其它实施方式中，结合对可以是配体_受体、激素_受体、抗原_抗体。在本发明的所有方面的一些实施方式中，基因组核酸可通过共价连接被锚定在固 相支持体上。在一个实施方式中，基因组核酸与固相支持体的共价连接是通过光活化基团 例如叠氮基、叠氮苯甲酰甲基、4-硝基苯基3-重氮丙酮酸盐、补骨脂素(psolarens)、补骨 脂素衍生物来完成的。在另一个实施方式中，基因组核酸能通过UV交联而交联到各种固相 表面。在另一个实施方式中，基因组核酸可通过使用化学连接体的化学偶联被锚定在固相 支持体上。在另一个优选的实施方式中，基因组核酸是基因组DNA。在另一个实施方式中，参 考核酸是持家基因或染色体中的单拷贝序列。在本发明的所有方面的一个实施方式中，分别含有基因组核酸和参考核酸的测试
8样品或参考样品可从细胞、组织、体液、血浆、血清、尿液、中枢神经系统液体、粪便、胆管、石 蜡包埋的组织、细胞裂解物、组织裂解物等等获得或在其中得到。测试和参考核酸可从任何 数目的来源通过任何方法获得。在本发明的所有方面的一个优选的实施方式中，探针可以是寡核苷酸、人工染色 体、片段化人工染色体、基因组DNA、RNA、重组核酸、肽核酸(PNA)、发夹寡核苷酸或杂环寡 聚体。在一个实施方式中，探针优选是大片段DNA ( > 20kb，包括粘粒、YAC或BAC克隆)。在本发明的所有方面的优选的实施方式中，与探针相关的可检测标记可以是荧光 团、纳米颗粒、同位素、化学发光化合物、酶或半抗原。在本发明的所有方面的优选的实施方式中，可检测标记可通过标记的试剂被检测 到。在一个优选的实施方式中，标记的试剂可以是能检测到与探针相关的标记的标记抗体。 在另一个实施方式中，标记的试剂是能检测到与探针相关的标记的一抗/ 二抗对，且一抗 或二抗或两者与可检测标记相关。在本发明的所有方面的一些实施方式中，锚定到固相支持体的基因组核酸、具有 可检测标记并杂交到基因组核酸的探针的复合体用流式细胞术来检测。在本发明的所有方面的一些实施方式中，基因组核酸首先与带有可检测标记的探 针在溶液中杂交，然后杂交的复合体可被锚定在固相支持体上。在本发明的所有方面的一些实施方式中，探针可以是至少50个核苷酸长度。在 其它的实施方式中，一个或更多个探针的长度大于约1，000,1, 500,2, 000,2, 500,3, 000、 4，000,5, 000,7, 500、10，000,20, 000,50, 000、100，000 或更多个核苷酸。除非另外说明，本文使用的单数形式“一 (a) ”、“一 (an) ”和“所述(the) ”包括复 数的指示物。因此，例如，提及“一个寡核苷酸”包括多个寡核苷酸分子，提及固相支持体是 指一个或更多个固相支持体，提及标记是指一个或更多个标记，提及探针是指一个或更多 个探针，提及“一个核酸“是指一个或更多个多核苷酸。本文使用的术语“基因组核酸”指细胞中的核酸，它存在于生物体的细胞染色体 (一个或更多个)中，含有编码该生物体的细胞的各种蛋白质的基因。基因组核酸还指提 供病毒信息的病毒核酸。基因组核酸通常是DNA，也可以是RNA，诸如在mRNA或RNA中，诸 如在一些病毒中。基因组核酸的优选的类型是存在于真核细胞的细胞核中的核酸。基因组 核酸可以是双链或单链、或部分双链、或部分单链或发夹分子。基因组核酸可以是完整的或 片段化的(例如用限制性内切酶消化、或用超声或应用剪切力用本领域已知的方法)。在 某些情况下，基因组核酸可包括来自单个基因的全部或一部分的序列或来自多个基因的序 列、来自一个或更多个染色体的序列或来自细胞所有染色体的序列。众所周知，基因组核酸 包括基因编码区、内含子、5'和3'非翻译区、5'和3'侧翼DNA和结构区段诸如端粒和着 丝粒DNA、复制起点和基因间DNA。代表基因组的全部核酸的基因组核酸被称为“总基因组 核酸”。基因组核酸可通过从细胞提取/纯化的方法获得，这是本领域熟知的。获得基因 组核酸的细胞可以是正常的细胞或可以是在基因组核酸中含有一个或更多突变例如重复、 缺失、易位和颠换的细胞。基因组核酸可直接从细胞提取或可以是从细胞提取的核酸的拷 贝。从基因组核酸含义中排除的是已经受扩增步骤的基因组核酸，相对于基因组核酸中的 其它核酸序列，所述扩增步骤增加想要检测的感兴趣靶序列的数量。
基因组核酸可以是约10个碱基、约20个碱基、约50个碱基、约100个碱基、约500 个碱基、约1，000个碱基、约2，000个碱基、2，500个碱基、约3，000个碱基、约3，500个碱 基、约4，000个碱基、约5，000个碱基、约7，500个碱基、约10，000个碱基、约20，000个碱 基、约30，000个碱基、约40，000个碱基、约50，000个碱基、约75，000个碱基、约100，000 个碱基、约1，000, 000个碱基、约2，000, 000个碱基、5，000, 000个碱基或更多。本文使用的术语“参考核酸”指为了与研究的基因组核酸比较而要被鉴定的核酸。 参考核酸可以是DNA或RNA，天然的或合成的。在一些情况下，参考核酸可含有相对不变的 序列即持家基因或基因座或其它基因，或不预期在变化的条件下(例如正常状态或疾病状 态)改变的染色体中的其它序列。参考核酸还可表示正常或野生型状态中的核酸，即缺少 点突变、易位、缺失或重复。在另一个情况下，参考核酸可表示带有点突变、易位、缺失或重 复的核酸序列。在一些情况下，研究的基因组核酸和参考核酸可从同一样品获得。在其它 的情况下，基因组核酸和参考核酸可从不同样品获得。在一些情况下，参考核酸可从与基因 组核酸不同的来源获得。在一些情况下，参考核酸可从与基因组核酸不同的生物体获得。术语“靶核酸”和“靶序列”在本文中可互换地使用，指代意图被鉴定的核酸序列。 靶序列可以是DNA或RNA。“靶序列”可以是基因组核酸。靶序列可包括野生型序列，含有点 突变、缺失或重复的核酸序列，来自单个基因的全部或一部分的序列或来自多个基因的序 列，来自一个或更多个染色体的序列或任何其它的感兴趣序列。靶序列可代表特定基因的 可选序列或等位基因。靶序列可以是双链或单链、或部分双链、或部分单链或发夹分子。靶 序列可以是约1-5个碱基、约10个碱基、约20个碱基、约50个碱基、约100个碱基、约500 个碱基、约1，000个碱基、约2，000个碱基、2，500个碱基、约3，000个碱基、约3，500个碱 基、约4，000个碱基、约5，000个碱基、约7，500个碱基、约10，000个碱基、约20，000个碱 基、约30，000个碱基、约40，000个碱基、约50，000个碱基、约75，000个碱基、约100，000 个碱基、约1，000, 000个碱基或更多。除非另外说明，本文使用的“约”表示加或减10%。术语“同一性”和“相同的”指序列之间的同一性程度。可以有部分同一性或完全 同一性。部分相同的序列是与另一个序列少于100%相同的序列。优选地，部分相同的序 列具有至少70%或至少75%、更优选地至少80%或至少85%、最优选地至少90%或至少 95%的总体同一性。在检测来自可检测标记的信号来表明基因组核酸在样品中的存在的上下文中，本 文使用的术语“检测”不需要该方法提供100%的灵敏度和/或100%的特异性。众所周知， “灵敏度”是如果那个人具有基因组核酸序列，则测试是阳性的概率；而“特异性”是如果那 个人不具有基因组核酸序列，则测试是阴性的概率。至少50%的灵敏度是优选的，尽管至 少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %和至少99 %的灵敏度是显然更优选的。至少50 % 的特异是优选的，尽管至少60%、至少70%、至少80%、至少90%和至少99%的特异性是 显然更优选的。检测还包括带有假阳性和假阴性的测定。假阴性率可以是1%、5%、10%、 15%、20%或甚至更高。假阳性率可以是1%、5%、10%、15%、20%或甚至更高。在基因片段或染色体片段的上下文中，“片段”指至少约10个核苷酸、至少约20个 核苷酸、至少约25个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、 至少约100个核苷酸、至少约250个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约1，000个核苷酸、
10至少约2，000个核苷酸、至少约5，000个核苷酸、至少约10，000个核苷酸、至少约20，000 个核苷酸、至少约50，000个核苷酸、至少约100，000个核苷酸、至少约500，000个核苷酸、 至少约1，000, 000个核苷酸或更多个核苷酸的核苷酸残基序列。在某些实施方式中，分离的或纯化的分子可为优选的。本文使用的术语“分离的”、 “纯化的”或“基本上纯化的”指核酸或氨基酸序列分子，它们从其自然环境被去除，是分离 的或单独的，并且至少60%、优选75%、最优选90%不含与它们天然地相关的其它成分。分 离的分子因此是基本上纯化的分子。本文使用的术语“测试样品”指含有基因组核酸的样品或用做用于本发明方法的 基因组核酸来源的样品。本文使用的术语“参考样品”指含有参考核酸的样品或用做用于本发明方法的参 考核酸来源的样品。术语“固相支持体”和“固相表面”在本文可互换地使用，指珠子、微粒、微球、平的 或包含孔或浅的凹陷或凹槽的板、微孔表面、载玻片、玻璃表面、涂层玻璃表面、反应器的表 面、层析柱、膜、过滤器、微芯片、石英、硅石、纸、塑料、硝化纤维素、尼龙、聚丙烯、聚苯乙烯 或其它聚合物等等，它们锚定基因组核酸。本文使用的术语“探针”指能杂交到基因组核酸或参考核酸的至少一部分的物体。 探针可以是寡核苷酸、人工染色体、片段化人工染色体、基因组核酸、片段化基因组核酸、 RNA、重组核酸、片段化重组核酸、肽核酸(PNA)、锁定核酸、环状杂环寡聚体或核酸偶联物。探针可以是约10个碱基、约20个碱基、约30个碱基、约40个碱基、约50个碱 基、约75个碱基、约100个碱基、约200个碱基、约300个碱基、约400个碱基、约500个碱 基、约750个碱基、约1，000个碱基、约1，500个碱基、约2，000个碱基、约2，500个碱基、 约3，000个碱基、约3，500个碱基、约4，000个碱基、约5，000个碱基、约7，500个碱基、约 10，000个碱基、约15，000个碱基、约20，000个碱基、约25，000个碱基、约30，000个碱基、约 40，000个碱基、约50，000个碱基、约75，000个碱基、约100，000个碱基、约500，000个碱基、 1，000, 000个碱基、约2，000, 000个碱基、约5，000, 000个碱基或更多。长度约1，OOO(Ikb) 至约5，000，000 (5Mb)或更多核苷酸的较长探针可来自含有感兴趣的核酸区段的染色体或 人工染色体。在本发明的一个实施方式中，探针优选是大的DNA片段(> 20kb，包括粘粒、 YAC或BAC克隆)。本文使用的术语“可检测标记”指与探针相关的分子或化合物或一组分子或一组 化合物，它们用于鉴定杂交到基因组核酸或参考核酸的探针。在一些情况下，可检测标记可被直接地检测。在其它情况下，可检测标记可以是结 合对的一部分，它可然后被接着检测。来自可检测标记的信号可通过各种方式被检测，并将 依赖于可检测标记的性质。检测可检测标记的方式的例子包括但并不限于分光镜的、光化 学的、生物化学的、免疫化学的、电磁的、放射化学的或化学的方式，诸如荧光、化学荧光或 化学发光或任何其它的合适方式。本文使用的术语“杂交”指通过互补碱基对之间的氢键形成，基本上互补的核苷酸 序列(核酸链)配对形成双链体或异源双链体。它是两个互补多核苷酸之间的特异的、即 非随机的相互作用。杂交和杂交的强度(即核酸之间的连接强度)受诸如核酸之间的互补 程度、所涉及条件的严格性和所形成杂交体的Tm的因素的影响。
本文关于多核苷酸(即，核苷酸诸如寡核苷酸或基因组核酸的序列)使用的术语 “互补物”、“互补的”或“互补性”与碱基配对原则有关。本文使用的核酸序列的互补物指 寡核苷酸，当与核酸序列对齐以便一个序列的5'端与另一个序列的3'端配对时，该寡核 苷酸处在“反向平行关联”中。例如，序列“5' -A-G-T-3”是与序列“3' -T-C-A-5’”互补 的。在天然的核酸中通常不被发现的某些碱基可包括在本发明的核酸中，包括例如肌苷和 7-脱氮鸟嘌呤。互补性不需要是完全的，稳定的双链体可含有错配的碱基对或不匹配的碱 基。核酸技术领域的技术人员能经验性地考虑许多变量来确定双链体稳定性，所述变量包 括例如，寡核苷酸的长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度和错配碱基对的发生率。互补性可以是“部分的”，其中只有核酸碱基中的一些根据碱基配对原则是匹配 的。或者，核酸之间可以有“完全的”、“全体的”或“全部的”互补性。本文使用的术语“严格性”指温度、离子强度和其它化合物存在的条件，在这个条 件下进行核酸杂交。在高度严格性条件下，核酸碱基配对将只发生在具有高频率互补碱基 序列的核酸之间。本文使用的术语“遗传异常”指核酸序列与野生型或正常的遗传序列的偏差。遗 传异常可反映生物体或其任何部分的完全遗传互补与该生物体中的所有染色体的正常的 完全遗传互补相比之间的差别。例如，遗传异常可包括染色体拷贝数(例如非整倍性)或 其部分(例如缺失、重复、扩增)的改变；或染色体结构的改变(例如易位、点突变)。遗传 异常可以是遗传的，即世代相传；或非遗传的。遗传异常可存在于生物体的一些细胞中或该 生物体的所有细胞中。本文使用的术语“非整倍体细胞”或“非整倍性”指在分裂间期具有异常数目的至 少一条染色体的细胞。“试验值”是通过在含有杂交到可检测探针的来自测试样品的基因组核酸的固相 支持体上形成的复合体的量的测定而获得的。在一个实施方式中，来自测试样品的基因组 核酸被怀疑具有遗传异常。在一个实施方式中，试验值还可通过检测参考样品中的同一染 色体或基因序列来获得。“对照值”是通过在含有杂交到可检测探针的来自参考样品的基因组核酸的固相 支持体上形成的复合体的量的测定而获得的。在一个实施方式中，杂交的靶被怀疑不具有 遗传异常。在另一个实施方式中，杂交的靶已知具有遗传异常。在一个实施方式中，测试样 品和参考样品是相同的。“参考值”指已被关联于一些其它特性的值。一组参考值可被用作标准曲线。试验值或对照值可被表达为复合体的“量”或拷贝数。复合体的量可以是与掺入 的标记的检测水平(例如荧光强度)相应的单个值或一定范围的值。例如，一定范围的值 可用于产生形成的复合体量与一些其它量(例如肿瘤负荷)之间的标准曲线关联。试验值或对照值可被表达为一种复合体的量对另一种复合体的量的“相对量”或 “比率”。在本发明方法的某些实施方式中，使用同一靶基因可获得两种复合体，其中第二 复合体的量代表历史值或在平行测定中获得的值。在其它的实施方式中，使用两种不同的 基因获得两种复合体，第一个是感兴趣的基因，第二个是不期望改变的基因(例如持家基 因)。相对的量可以是单个值或一定范围的值。例如，一定范围的值可用于产生形成的复合 体的相对量与一些其它量(例如肿瘤负荷)之间的标准曲线关联。
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术语“等位基因”和“等位基因变体”在本文可互换地使用。等位基因是同一基因 的许多可选形式或序列中的任何一个，该基因占据染色体上给定的基因座或位置。每个基 因座的单个等位基因从每个亲本独立地遗传，导致每个基因有两个等位基因。具有特定基 因的同一等位基因的两个拷贝的个体在那个基因座是纯合的，而具有特定基因的两个不同 等位基因的个体是杂合的。本文使用的术语“诊断(diagnose) ”或“诊断(diagnosis) ”指通过评价疾病或病 症的体征和症状来鉴定或确定生物体或植物中的疾病或状况或疾病或状况的原因的行为 或过程。通常，疾病或病症的诊断基于一个或更多个指示疾病的因子和/或症状的评价。 即，诊断可以基于指示疾病或状况的存在或不存在的因子的存在、缺乏或量而作出。被认为 指示特定疾病的诊断的每个因子或症状不需要与特定的疾病唯一相关；即，可能存在可从 诊断因子或症状推论出的鉴别诊断。同样，可能有这样的情况，其中指示特定疾病的因子或 症状存在于不具有该特定疾病的个体中。本文使用的术语“预后”指临床状况或疾病的可能的过程和结果的预测。患者的 预后通常是通过评价疾病的因子或症状而作出的，该因子或症状指示疾病的有利或不利的 过程或结果。本文使用的术语“确定预后”指技术人员能预测患者状况的过程或结果的过程。术 语“预后”不是指100%准确度地预测状况的过程或结果的能力。而是技术人员会理解，术 语“预后”指某些过程或结果会发生的概率增加；即，与没有表现给定状况的那些个体相比， 过程或结果更有可能在表现给定状况的患者中发生。预后可表示为患者可预期存活的时间 量。可选地，预后可指疾病减轻的可能性或指疾病可预期保持减轻的时间量。预后可以多 种方式表示；例如预后可被表示为患者一年后、五年后、十年后或类似时间后会生存的机会 百分比。可选地，预后可被表示为作为状况或疾病的结果患者可预期生存的平均年数。患 者的预后可被认为是相对论的表示，许多因素影响最终的结果。例如，对于具有某些状况的 患者，预后可被适当地表示为状况可能是可治疗的或可治愈的可能性或疾病会减轻的可能 性，而对于具有更严重状况的患者，预后可被更适当地表示为特定时间段的生存可能性。预后经常通过检查一个或更多个预后因子或指示物来确定。它们是标记物，诸如 特定染色体易位的存在，其在患者(或从患者获得的样品)中的存在或量发出给定过程或 结果会发生的概率的信号。技术人员会理解，将预后指示物与不利结果的倾向相关联可涉 及统计学分析。本文使用的术语“肿瘤负荷”指个体中肿瘤的体积或质量的量。这个量可以在一 个位点，诸如原发性肿瘤，或可以是来自多个位点诸如原发灶和/或转移灶的总计量。发明详述本发明提供检测固相支持体上的未扩增的基因组核酸的方法，其不需要完整的细 胞或细胞核。该方法可用于检测测试样品中的遗传异常，诸如点突变、易位、缺失和重复。该 方法还可用于疾病的诊断或预后。遗传异常类型、相关的疾病遗传异常可反映生物体的完全遗传互补或其任何部分与该生物体中的所有染色 体的正常的完全遗传互补相比之间的差别。例如，遗传异常可包括染色体拷贝数(例如非 整倍性)或其部分(例如缺失、重复、扩增)的改变；或染色体结构的改变(例如易位、点突变)。遗传异常可导致病理状态。尽管一些疾病诸如癌症归因于生命过程中少数细胞中后 天获得的遗传异常，但术语“遗传性疾病”最通常地指在身体的所有细胞中存在并且从受孕 起就存在的疾病。遗传异常可以是遗传的或非遗传的。遗传重复是基因组序列的区域的任何重复。它可作为错误发生在同源重组、逆转 录转座事件或整个染色体复制中。基因重复与多种疾病相关联，诸如一些畸形性骨炎骨肉 瘤的病例与MYC基因的重复相关联(Sarcoma, vol. 1，no. 3-4，pp. 131-134，1997)，一些乳腺 癌的病例与 HER-2/neu 基因的重复相关联(Ann Oncol.，12 (suppl 1) :S3_S8，2001)，一些 膀胱肿瘤的病例与c-erb-2基因的重复相关联(Cancer Res.，55，2422-2430，1995)。缺失(也被称作基因缺失、缺陷或缺失突变)是遗传畸变，其中部分染色体或DNA 序列丢失。缺失是遗传物质的丧失。任何数目的核苷酸都可被缺失，从单个碱基到染色体 的整个片段。缺失可由减数分裂过程中染色体交换中的错误引起。缺失与一组遗传病相关 联，包括一些男性不育症的病例和三分之二的迪谢内肌营养不良的病例，5号染色体部分短 臂的缺失导致被称作猫叫样哭泣(Cri du chat)的综合征，也被称为“猫样哭泣”综合征。染色体“易位”是异源染色体之间的部分互换。它通常是通过受累细胞的细胞遗传 学或核型分析来检测的。有两种主要的类型相互易位，其中全部的染色体物质都被保留； 罗伯逊易位，其中一些染色体物质丢失。此外，易位可以是平衡的(在没有额外的或丢失的 遗传信息的物质均等互换中)或不平衡的(其中染色体物质的互换是不均等的，导致额外 的或丢失的基因)。9号染色体和22号染色体之间的相互易位导致被称作费城染色体的细胞遗传学 不同的近端着丝粒染色体。这种易位融合了 22号染色体的BCR基因座和9号染色体的原癌 基因 ABL基因座，形成bcr/abl 致癌蛋白(Tefferi et a 1. Mayo Clin Proc80 (3) :390_402， 2005)。尽管费城染色体最初与CML相关，但是现在它被已知为其它血液病诸如急性淋巴母 细胞白血病(ALL)中预后的指示物。易位已与其它疾病相关。例如，通过11号和16号染色体之间的易位的、16号染 色体的CBP基因与11号染色体的MLL基因的融合已与白血病相关联(Zhang et al. Genes Chromosomes Cancer 41 (3) :257_65，2004)。相似地，导致 AMLl 和 ETO 基因的融合的 8号和21号染色体之间的易位涉及几乎15%的急性髓性白血病(AML)病例(Zhang et al. Science 305 1286-9, 2004) 0此外，许多染色体易位已在多种形式的淋巴瘤中被鉴定。 例如，涉及c-myc基因的8号和14号染色体之间的易位被报道存在于大约80-85%的伯基 特淋巴瘤 / 白血病病例中(Vega ct al. Arch Pathol Lab Medl27 :1148_1160，2003)。突变可以是点突变插入或缺失。点突变或置换是引起单个碱基核苷酸被另一核苷 酸替换的突变类型。插入和缺失包括单个碱基对的插入或缺失。基因或染色体中的突变常 常与疾病诸如镰状细胞性贫血、囊性纤维化、血友病、苯丙酮尿、脊柱裂等相关联。遗传变异的诊断包括含有与野生型序列的序列变异的基因组核酸序列的鉴定。在 优选的实施方式中，含有基因组核酸的测试样品被收集，且基因组核酸的存在被鉴定，其中 基因组核酸的存在或不存在是有诊断价值的。生物样品收集和制备测试样品和参考样品测试样品和参考样品分别含有基因组核酸和参考核酸。测 试样品和参考样品可以是人类或非人类来源。测试样品和参考样品可以从真核或原核生物
14体、或植物、或环境获得。测试样品和参考样品可以是固体、液体、半固体、气体，带有或没有 任何细胞或组织。测试样品和参考样品可包括但并不限于羊水、活组织检查物、血液、血细 胞、骨髓、脑脊液、粪便样品、排泄物、细针活组织检查样品、腹膜液、血浆、胸水、支气管肺泡 灌洗液、支气管冲洗液、唾液、精液、血清、痰、眼泪、颊拭子、组织、组织勻浆、冷冻的组织、组 织的石蜡切片、组织培养基、细胞、细胞裂解物、来自培养物的细胞、细胞培养上清、胎儿、胚 胎、尿、微生物、病毒、支原体。在一个实施方式中，测试样品可以从怀疑患有疾病或具有遗传异常的个体获得。 在另一个实施方式中，测试样品可以从假定未患疾病或没有遗传异常的健康个体获得。样品收集获得测试样品和参考样品的方法是本领域技术人员熟知的，包括佰并 不限于吸出、组织切片、抽血或抽取其它液体、手术或针刺活组织检查、石蜡包埋组织的收 集、体液的收集、粪便的收集等等。发明的方法可使用任何类型的含有胚胎或胎儿细胞或核酸体液用于进行产前诊 断。胎儿细胞可通过怀孕女性或从胚胎样品获得。因此，胎儿细胞存在于通过羊膜腔穿刺 术获得的羊水、通过注射器吸出的绒毛膜绒毛、经皮脐带血、胎儿皮肤活组织检查、来自四 细胞或八细胞阶段胚胎的卵裂球(植入前)、或来自胚泡的滋养外胚层样品(植入前或通过 子宫灌洗)中。基因组核酸在一个实施方式中，基因组核酸可以是完整的。在另一个实施方式 中，基因组核酸可以是片段化的(例如用限制性内切酶消化的，或用超声处理或应用剪切 力用本领域已知的方法片段化)。样品制备核酸(DNA或RNA)可根据本领域技术人员熟知的任何方法从样品中分 离。需要时，样品可通过离心等被收集或浓缩。样品可进行裂解，诸如用酶、加热、表面活性 剂、超声破碎或其组合来处理。为了获得足够量的核酸，进行裂解处理。样品可进行液相色 谱来部分地纯化基因组核酸。适合的DNA分离方法包括酚氯仿提取。参见Maniatis et al. , Molecular Cloning, ALaboratory Manual,2d, Cold Spring Harbor Laboratory Press, page 16. 54(1989)。很多商品化试剂盒也生产合适的DNA，包括但并不限于QIAamp 小型血 液试齐[J 盒、Agencourt Genfind 、Roche Cobas Roche MagNA Pure 或使用 Eppendorf PhaseLock Gels 的酚氯仿提取。总DNA(例如基因组的、线粒体的、微生物的、病毒的)可使用商业上可买到的试剂 盒例如来自Qiagen的QIAamp DNA和QIAamp DNA Blood小型试剂盒从任何生物样品诸如全 血、血浆、血清、血沉棕黄层、骨髓、其它的体液、淋巴细胞、培养的细胞、组织和法医样本中 纯化。病毒RNA可使用商业上可买到的试剂盒例如QIAamp病毒RNA小型试剂盒从全血、血 浆、血清、血沉棕黄层、骨髓、其它的体液、淋巴细胞、培养的细胞、组织和法医样本中纯化。基因组DNA可使用标准的方法从细胞或组织中分离，参见Sambrook，et al., 1989, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY。在另一个实施方式中，基因组核酸可以是mRNA或从mRNA产生的cDNA，或可以使 用总RNA。使用标准技术从细胞或组织样品中分离RNA，参见例如Sambrook，et al.，1989. Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Second Edition,Cold SpringHarbor Press,Plainview, NY0此外，分离mRNA和合成cDNA的试剂盒是商业上可买到的，例如来自Qiagen 的 RNeasy Protect Mini i式剂盒、RNeasy Protect Cell Mini i式剂盒。在一个实施方式中，基因组核酸是从石蜡包埋的组织中分离的DNA。从石蜡包埋的 组织中提取DNA的方法是本领域熟知的，例如，收集含有组织的石蜡块、用二甲苯处理来脱 蜡、用蛋白酶处理以去除蛋白污染物、然后用酚和氯仿最后提取、接下来乙醇沉淀。可选地， 来自石蜡包埋的组织的DNA可用商业上可买到的试剂盒分离，例如，可使用来自Qiagen的 EZl DNA试剂盒、QIAamp DNA Mini试剂盒从石蜡包埋的组织分离DNA。核酸不需要提取，但是可通过合适的细胞或组织处理诸如美国专利申请 11/566169中描述的那样被制成可利用的。固相支持体固相支持体可用于通过共价的或非共价的方式锚定基因组核酸。在优选的实施 方式中，固相支持体是珠子。在一些实施方式中，珠子或微粒是基本上相同尺寸的。在其 它的实施方式中，珠子或微粒是一种或更多种尺寸的。在一个实施方式中，珠子或微粒可 以是磁性的。这些珠子或微粒可由例如聚苯乙烯或乳胶组成。珠子或微粒可以是直径大约 0. 1 μ m-10 μ m或可以是直径大如50 μ m-100 μ m,但是，较小的和较大的珠子尺寸也是可能 的。在优选的实施方式中，固相表面是链霉抗生物素包被的珠子。链霉抗生物素包被 的珠子是商业上可买到的，例如来自Bang实验室(目录号214、217)、EMDBiosciences (目 录号 70716-3,70716-4)、来自 Invitrogen Corporation 的 Dynal 珠子(目录号 658-0ID、 602-10)。在一些实施方式中，固相表面可具有能直接或间接地通过化学连接体共价地连接 基因组核酸的官能团。官能团的例子包括但并不限于聚L赖氨酸、氨基硅烷、环氧硅烷、醛 类、氨基、环氧基、氰基、乙烯基、羟基、硫羟基。核酸在固相支持体上的锚定基因组核酸或参考核酸对固相支持体的锚定可在基因组核酸或参考核酸与带有 可检测标记的探针杂交之前、之后或同时进行。核酸可被共价地或非共价地锚定到载体上。非共价地锚定核酸到固相表面的优选方法是通过“结合对”，它在本文是指通过特 异性相互作用形成复合体的两个分子。因此，核酸可通过与核酸连接的结合对的一个成员 和与固相支持体偶联的结合对的另一个成员之间的相互作用被捕获在固相支持体上。在优选的实施方式中。结合对是生物素和抗生物素蛋白、或抗生物素蛋白的变体 诸如链霉抗生物素，NeutrAvidin 。固相表面包含链霉抗生物素或其变体，且基因组核酸 被修饰以包含生物素。对核酸进行生物素化的方法是本领域已知的(例如，通过用来自 Pierce Chemical Co.的EZ-连接补骨脂素-PEO生物素的光交叉连接，通过使用来自Minis Bio Corp.的 Label IT pArray Biotin Labeling Kit、来自 Pierce Chemical Co.的 PFP Biotin的化学偶联，通过使用来自Invitrogen公司的BioNick DNA标记系统的切口 平移，或通过使用商业上可买到的试剂盒例如来自Pierce的Biotin 3-末端标记试剂盒的 3'-末端标记)。在其它的实施方式中，结合对包含配体-受体、激素-受体、抗原_抗体。这样的 结合对的例子包括但并不限于地高辛配基和抗地高辛配基抗体；6-(2，4-二硝基苯基)氨基己酸和抗二硝基苯基抗体；5-溴-dUTP (BrdUTP)和抗BrdUTP抗体；N-乙酰基2-氨基芴 (AAF)和抗AAF抗体。这些情况中的固相表面包含抗体，且基因组核酸被修饰以含有抗原。 将地高辛配基、2，4- 二硝基苯基、5-溴-dUTP基掺入到DNA中的方法可通过切口平移或通 过末端转移酶反应来实现，其例子在本领域被详细地记录或可通过使用商业上可买到的试 剂盒例如来自Roche Applied Sciences的试剂盒DIG DNA标记试剂盒而实现。地高辛配 基可用地高辛配基-NHS-酯化学偶联到核酸上。N-乙酰基2-氨基芴(AAF)可被共价地偶 联到基因组核酸上。在另一个实施方式中，基因组核酸可通过使用化学连接体的化学偶联被共价地锚 定到固相支持体上。如果基因组核酸与表面之间的共价结合是期望的，固相表面将通常是 官能化的或可以被官能化。用于连接的官能团的例子包括但并不限于羧酸、醛、氨基、氰
基、乙烯基、羟基、硫羟基。在一些实施方式中，固相支持体可包被有环氧基、氨基、巯基、聚赖氨酸。包被的 固相支持体是商业上可买到的，例如包被有官能团的珠子可从InvitrogenCorpotation、 BD Biosciences买到；包被有官能团的载玻片可从Pierce、Asper Biotech、Full Moon Biosystems、ThermoFisher 买至丨J。基因组核酸可被修饰以含有官能团。基因组核酸的5'磷酸基可用碳二亚胺交联 剂EDC (Pierce产品no. 22980)和咪唑偶联于含伯胺分子。核酸的5'磷酸基可被修饰以 含有胺基，其应用过量的乙二胺并应用碳二亚胺交联剂EDC(Pierce产品no. 22980)和咪 唑，如在Pierce Technote no. 30中描述的。依赖使用的含有胺的分子，交联策略能适于以 许多方式直接或间接地修饰、标记或结合基因组核酸。例如，为了产生光活化(随机-反应 的)的核酸，对-叠氮苯甲酰基酰胼(ABH，PierCe目录号21510)可用于代替默认反应中的 乙二胺。为了产生巯基_反应性核酸，[N-e-马来酰亚胺己酸]酰胼、三氟乙酸盐(EMCH， Pierce目录号22106)、n-[k_马来酰亚胺4^一烷酸]酰胼(KMUH，Pierce目录号22111)、 或4-(4-N-马来酰亚胺苯基)丁酸酰胼盐酸盐(MPBH，Pierce目录号22305)可用于代替 默认反应中的乙二胺。为了获得可逆的巯基交联，3-(2_吡啶基二硫代)丙酰酰胼(PDPH， Pierce目录号22301)可用于代替乙二胺。这个策略对将基因组核酸连接到含有巯基的固 相支持体上是有用的。为了在基因组核酸上产生巯基，胱胺(nh2-ch2-ch2-s-s-ch2-ch2-nh2) 可被用于代替默认反应中的乙二胺，然后用DTT或相似的试剂还原二硫键。这个策略对共 价地偶联到马来酰亚胺活化的固相支持体上是有用的。为了将核酸固定到饰以珠子的亲和 载体上，UltraLinkHydrazide (Pierce目录号53149)可用于代替默认反应中的乙二胺。基因组核酸可被酶促修饰以含有官能团诸如氨基，例如通过切口平移或通过末端 转移酶反应掺入氨基烯丙基dUTP。将多样的官能团彼此连接的方式是熟知的并且在文献中被详细举例说明。在一个 实施方式中，化学连接体可用于共价地连接两个官能团，一个在固相支持体上，另一个在基 因组核酸上。化学连接体可以是单官能的、双官能的、多官能的、异_双官能的、或异_多官 能的。在优选的实施方式中，化学连接体可具有间隔臂以避免位阻。将氨基偶联到氨基的 化学连接体的例子包括但并不限于乙二醇双[琥珀酰亚胺基琥珀酸盐]、双琥珀酰亚胺基 辛二酸盐、1，5- 二氟-2，4- 二硝基苯。将硫羟基偶联到硫羟基的化学连接体的例子包括但 并不限于1，4_双-[3' -(2' _吡啶基二硫代)_丙酰胺基]丁烷、二巯代-双马来酰亚胺基乙烷。多样的合适的交联剂和交联的方法可购自Pierce。在另一个实施方式中，基因组核酸通过光活化部分被锚定到固相支持体上。在一 个实施方式中，固相表面可锚定能通过光活化作用偶联基因组核酸的光活化部分。在另一 个实施方式中，基因组核酸的5'磷酸基可被结合到能光交联到固相表面上的官能团的光 活化基团。在另一个实施方式中，基因组核酸可通过连接体被锚定于固相表面，该连接体具 有两个或更多个光活化部分，每端有一个或更多个，其中用合适波长的辐射在连接体存在 的情况下暴露固相表面和基因组核酸后，连接体偶联到固相表面和基因组核酸。光活化部 分的例子包括但并不限于叠氮化物、芳基叠氮化物、叠氮苯甲酰甲基、4-硝基苯基3-重氮 丙酮酸盐、补骨脂素(psolarens)、补骨脂素衍生物。在另一个实施方式中，基因组核酸可通过暴露固相表面和基因组核酸于紫外辐射 而被交联到尼龙、硝基纤维素、或尼龙加强的硝基纤维素膜、包被的玻璃表面。核酸交联结 合到各种表面的方式是熟知的，并且在文献中被详细地举例说明(例如使用Stratagene紫 外交联剂)。Mt探针能杂交到基因组核酸的至少一部分。在优选的实施方式中，核酸探针来自 BAC Resource Consortium编译的细菌人工染色体(BACs)的概要提供的一个、几个或所有 的人类基因组核酸区段。这些探针通常在本领域通过它们的RPI或CTB克隆名被提及，参 见Cheung等，Nature 409 =953-958, 2001 该概要含有人基因组草图序列中的7，600个 细胞遗传学定义的界标(参见McPherson等，Nature 409 =934-41, 2001) 这些界标是大 的插入克隆，通过荧光原位杂交绘制到染色体带上，每个含有定位到基因组序列上的序列 标签。这些克隆代表所有24条人类染色体，分辨率约1Mb。BAC基因组收集的来源包括 BACPAC Resources Center(CH0RI-Children‘ s HospitalOakland Research Institute)、 ResGen (Research Genetics，Invitrogen)禾口 The Sanger Center(UK)0探针包括一个可检测标记或多个可检测标记。在一个优选的实施方式中，与探针 相关的可检测标记可直接产生可检测的信号。在另一个实施方式中，与探针相关的可检测 标记可使用试剂被间接地检测，其中该试剂包括可检测标记，并结合到与探针相关的标记 上。在一个实施方式中，包括可检测标记的试剂是标记的抗体。在另一个实施方式中，包 括可检测标记的试剂是一抗/ 二抗对，其中可检测标记可以在一抗中或在二抗中或在两者 中。^^核酸链之间的互补性的程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著的影响。这 在依赖核酸之间的结合的检测方法中具有特别的重要性。在一个实施方式中，探针和基因 组核酸之间的互补性可以是“部分的”，其中核酸碱基中只有一些根据碱基配对原则是配对 的。在另一个实施方式中，探针和基因组核酸之间的互补性可以是“完全的”、“全体的”或 “全部的”。为了进行DNA杂交，本发明的方法可结合所有已知的方法和手段及其变化，参见， 例如 Sambrook等，1989，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Second Edition, Cold Spring Harbor Press，Plainview, NY。基因组核酸和参考核酸和为核酸选择的探针在杂交条件下相接触。在本发明的方
18法中的核酸杂交条件是本领域熟知的。例如，杂交条件可以是高严格性、中严格性或低严格 性条件。理想地，核酸将只与样品中的互补核酸杂交而不会与其它非互补核酸杂交。杂交 条件可以被改变以改变杂交的严格性并降低背景信号，这是本领域已知的。例如，如果杂交 条件是高严格性条件，核酸将以非常高度的互补性可检测地结合到核酸靶序列上。低严格 性杂交条件会允许带有一些程度的序列趋异的序列杂交。杂交条件将会依赖生物样品以及 核酸的类型和序列而变化。本领域的技术人员会知道如何优化杂交条件来实施本发明的方 法。示例性的杂交条件如下。高严格性通常指只允许那些在65°C、0.018M NaCl中形 成稳定杂交体的核酸序列杂交的条件。高严格性条件可被提供，例如，通过在42°C在50% 甲酰胺、5XDenhardt' s液、5XSSC(柠檬酸钠盐水)0. 2% SDS(十二烷基硫酸钠)中杂 交，接下来在65°C在0. IX SSC和0. 1% SDS中冲洗。中严格性指与在42°C在50%甲酰胺、 5XDenhardt' s 液、5XSSC、0. 2% SDS 中杂交，接下来在 65°C在 0. 2XSSC、0. 2% SDS 中冲 洗相等的条件。低严格性指与在10%甲酰胺、5XDenhardt' s液、6XSSC、0. 2% SDS中杂 交，接下来在50°C在1 XSSC、0. 2% SDS中冲洗相等的条件。可检测标记本文使用的术语“可检测标记”指与探针相关的分子或化合物或一组分子或一组 化合物，它用于鉴定杂交到基因组核酸或参考核酸上的探针。可检测标记包括但并不限于荧光团、同位素(例如，吁、呷、353、3!1、14(、1251、1311)、电 子致密试剂(例如，金、银)、纳米颗粒、在ELISA中通常使用的酶(例如，辣根过氧化物酶、 β -半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光化合物、比色标记(例如，胶体金)、磁性 标记(例如，Dynabeads )、生物素、地高辛配基、半抗原、可得到其抗血清或单克隆抗体的 蛋白质、配体、激素、能与相应的互补寡核苷酸形成复合体的寡核苷酸。在优选的实施方式中，可检测标记是荧光团。本文使用的术语“荧光团”指在特定 的波长(激发频率)吸收光，随后响应发出不同波长、一般为较长波长(激发频率)的光的 分子。在一个实施方式中，可检测标记是紧密接近猝灭剂部分的供体荧光团。合适的荧光部分包括但并不限于单独或联合起作用的下列荧光团4_乙酰胺 基-4'-异硫氰酸根合均二苯乙烯_2，2' 二磺酸；吖啶及其衍生物吖啶、吖啶异硫氰酸 盐；Alexa Fluors =Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647(分子探针)；5-(2 ‘-氨 乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS) :4_氨基-N-[3-乙烯磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺_3， 5 二磺酸盐(Lucifer Yellow VS) ；N-(4_苯胺基萘基)马来酰亚胺；氨茴内酐酰胺 (anthranilamide) ；Black Hole Quencher (BHQ )染料(biosearch Technologies)； BODIPY染料BODIPY R-6G、BOPIPY 530/550、BODIPY FL ；Brilliant Yellow ；香豆素 及衍生物香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，Coumarin 120)、7_氨基-4-三氟醚甲基 香豆素(Coumarin 151) ；Cy2 、Cy3 、Cy3.5 、Cy5 、Cy5.5 ;焰红染料(cyanosine)； 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) ；5'，5〃 - 二溴连苯三酚-磺酞(Bromopyrogallol Red) ；7-二乙氨基-3-(4'-异硫氰酸根合苯基)-4_甲基香豆素；二乙烯三胺五乙酸酯； 4,4' - 二异硫氰酸根合二氢-均二苯乙烯_2，2' -二磺酸；4，4' - 二异硫氰酸根合均二 苯乙烯_2，2' -二磺酸；5-[二甲氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-(4' - 二甲氨
19基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL) ；4-二甲氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)； Ecl ipse (Epoch Biosciences Inc.)；伊红及衍生物伊红、伊红异硫氰酸酯；赤藓红 及衍生物赤藓红B、赤藓红异硫氰酸酯；二氨乙苯啡啶(ethidium)；荧光素及衍生物 5-羧基荧光素尔六1)、5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(01六朽、2'，V - 二甲氧 基-4' 5' -二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、六氯-6-羧 基荧光素(HEX)、QFITC(XRITC)、四氯荧光素(TET)；荧光胺；IR144 ;IR1446 ；镧发光体 (lanthamide phosphors)；孔雀绿(Malachite Green)异硫氰酸酯；4~甲基伞形酮；邻甲 酚酞；硝基酪氨酸；副品红；酚红(Phenol Red) ；B-藻红蛋白、R-藻红蛋白；别藻蓝蛋白； 邻_苯二甲醛；Oregon Green ；碘化丙啶；芘和衍生物芘、芘丁酸盐、琥珀酰亚胺基1_芘 丁酸盐；QSY 7 ;QSY 9 ;QSY 21 ;QSY 35(分子探针)Reactive Red 4(Cibacron Brilliant Red3B-A)；罗丹明及衍生物6_羧基-X-罗丹明(ROX)、6_羧基罗丹明(R6G)、丽 丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明绿、罗丹明X异硫氰酸 酯、核黄素、玫红酸、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101、磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(Texas Red)；铽螯合衍生物；N，N，N' ,N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；四甲基罗丹明；四甲 基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)。其它的荧光核苷酸类似物可以被使用，参见，例如，Jameson, Meth. Enzymo 1. 278 363-390，1997 ；Zhu, Nucl. Acids Res. 22 :3418_3422，1994。美国专利第 5，652，099 和 6，268，132号也描述了通过酶或化学合成而结合到核酸，例如DNA和/或RNA或寡核苷酸中 的核苷酸类似物，以产生荧光寡核苷酸。美国专利5，135，717描述了作为荧光标记使用的 酞菁和四苯并三氮杂卟啉试剂。可检测标记可被掺入到、缔合或结合到核酸上。标记可通过具有各种长度的间隔 臂被连接，以减少潜在的位阻或赋予其它有用的或期望的性质。参见，例如，Mansfield, MoI. Cell. Probes 9:145-156,1995。可检测标记可通过共价的或非共价方式，例如通过转录诸如通过使用Klenow聚 合酶的随机引物标记、或切口平移或扩增或本领域已知的等同方法被掺入到核酸探针中。 例如，核苷酸碱基被结合到可检测的部分，诸如荧光染料，例如Cy3 或Cy5 ，然后在核酸合 成或扩增过程中被掺入到核酸探针中。当用与未标记的dCTP混合的Cy3 _或Cy5 -dCTP 结合物合成时，核酸探针可因此被标记。核酸探针可通过使用PCR或切口平移在存在标记的前体核苷酸时被标记。例如， 通过将烯丙胺-dUTP偶联到荧光染料或半抗原(诸如生物素或地高辛配基)的琥珀酰亚胺 酯衍生物而合成的修饰的核苷酸可被使用；这种方法允许最常见的荧光核苷酸的定制，参 见，例如，Henegariu，Nat. Biotechnol. 18 345-348, 2000 核酸探针可通过本领域已知的非共价方式被标记。例如，Kreatech Biotechnology 的 Universal Linkage System (ULS )提供了非酶促标记技术，其中钼基 通过结合到鸟苷的N7位置与DNA、RNA或核苷酸形成配位键。这种技术还可通过结合到含 有氮和硫的氨基酸侧链上而用于标记蛋白质。参加，例如，美国专利5，580，990、5，714，327 和5，985，566号及欧洲专利0539466号。用可检测标记加标记还可包括与另一个生物分子诸如核酸，例如寡核苷酸或以 茎环结构形式作为“分子信标(molecular beacon) ”或“适体信标(aptamer beacon)”的核酸连接的核酸。作为可检测的部分的分子信标是本领域熟知的；例如，SokoKProc. Natl. Acad. ScL USA 95:11538-11543,1998)合成了“分子信标”报告分子寡脱氧核苷酸， 其在5'和3'端带有匹配的荧光供体和受体生色团。在缺少互补核酸链的情况下，分子 信标保持在茎环构象中，其中荧光共振能量转移阻止信号释放。与互补的序列杂交时，茎 环结构打开，增加供体和受体部分之间的物理距离，因此减少荧光共振能量转移并在信标 被适当波长的光激活时允许可检测信号被发出。也参见，例如Antony (Biochemistry 40 9387-9395，2001)，其描述了包含形成寡脱氧核苷酸的富含G的18-mer三链体的分子信标。 也参见美国专利第6，277，581和6，235，504号。适体信标与分子信标相似；参见，例如，Hamaguchi, Anal. Biochem. 294 :126_131， 2001 ；Poddar, Mol.Cell. Probes 15 161-167,2001 ；Kaboev, Nucl. Acids Res. 28 :E94， 2000。适体信标可采用两个或更多个构象，其中之一允许配体结合。荧光猝灭对用于报告配 体结合引起的构象改变。也参见，例如Yamamoto，Genes Cells 5 389-396, 2000 ；Smimov, Biochemistry 39 :1462_1468，2000。核酸探针可通过肽被间接地可检测地标记。肽可通过插入被次级报告分子(例 如，亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、转录激活因子多肽、金属结合结构域、表位标签) 识别的预定的多肽表位被制成可检测的。标记还可通过与第一个肽相互作用(例如，S-S缔 合)的第二个肽被连接。如本领域的技术人员容易地知晓，含有杂交到标记探针的基因组核酸的复合体的 检测可通过抗探针标记的标记抗体的使用来实现。在优选的实施方式中，探针用地高辛配 基标记并用荧光标记的抗地高辛配基抗体来检测。在另一个实施方式中，探针用FITC标记 并用荧光标记的抗FITC抗体来检测。这些抗体是商业上容易买到的。在另一个实施方式 中，探针用FITC标记并用抗FITC抗体的一抗和标记的抗-抗FITC 二抗来检测。基因组核酸和探针复合体的检测掺入到杂交的基因组核酸、探针和固相支持体复合体中的可检测标记探针的检测 方法是本领域已知的，并随着标记的性质而改变。荧光染料通过将标记暴露于由外源诸如白炽灯或激光提供的一个波长能量的光 子，引起荧光团转化为激发态而被检测。荧光团然后在比激发波长长的波长下释放吸收的 能量，该能量可作为荧光被含有荧光检测器的标准仪器测量。示例性的荧光仪器包括荧光 分光光度计和小平板读数器、荧光显微镜、荧光扫描仪和流式细胞仪。用于多荧光团的检测的装置和方法是本领域熟知的，参见，例如美国专利第 5, 539, 517,6, 049, 380,6, 054, 279,6, 055, 325 和 6, 294, 331 号。任何已知的装置和方 法或其变化都可用于或适于实施本发明的方法，包括阵列读数或“扫描”装置，诸如扫 描和分析多色荧光图像；参见，例如，美国专利第6，294，331,6, 261,776,6, 252,664、 6，191，425,6，143，495,6，140，044,6，066，459,5，943，129,5，922，617,5，880，473, 5，846，708,5, 790，727号和本文的阵列论述中引用的专利。还参见公开的美国专利申请 第 2001/0018514、2001/0007747 号和公开的国际专利申请第 W0/0146467A、W0/9960163A、 W0/0009650A, W0/0026412A, W0/0042222A, W0/0047600A 和 W0/0101144A 号。电荷耦合器件或CCDs在微阵列扫描系统中使用，包括实施本发明的方法。颜色辨 别也可基于3色CCD视频影像，这些可通过测量色调值来进行。色调值被引入以便用数字详细说明颜色。计算是基于相机的分离通道记录的红、绿和蓝光(RGB)的强度。然而，用于 将RGB值转换为色调的公式简化了数据，而且没有对光的真实的物理性质进行参考。可选 地，光谱成像可被使用；它将光分析为每一波长的强度，这是唯一的量，通过它来正确地描 述光的颜色。此外，光谱成像可提供空间数据，因为它含有图像中每个像素的光谱信息。可 选地，光谱图像可使用亮视野显微镜制作。参见，例如，美国专利6，294，331号。在优选的实施方式中，使用流式细胞仪检测杂交的复合体。流式细胞术是本领域 熟知的技术。流式细胞仪水动力地将颗粒(例如，细胞或合成的微粒或珠子)的液体悬液 聚焦成基本上单行的颗粒流，这样每个颗粒可被单独分析。流式细胞术能测量与颗粒大小 相关的前向和侧向光散射。因此，不同大小的颗粒可同时用在本发明的方法中来检测不 同的核酸片段。此外，一个或更多波长下的荧光可同时被测量。结果，颗粒可按大小被分 类，且可为每个颗粒分析一个或更多个荧光标记探针的荧光。示例性的流式细胞仪包括 Becton-Dickenson Immunocytometry Systems FACSCAN。等效的流式细胞仪也可在本发明 的方法中使用。在另一个实施方式中，含有锚定到固相支持体并与探针杂交的基因组核酸的复合 体可用表面等离子共振检测。在本发明所有方面的一些实施方式中，方法适合大的异常，诸如涉及至少50个碱 基，更优选至少100个碱基，更优选至少200个碱基，更优选至少500个碱基，更优选至少 lkb，更优选至少2kb，更优选至少4kb，更优选至少8kb，以及甚至更优选至少IOkb或更多。 但是，较小的异常——包括至少1个碱基、至少5个碱基、至少10个碱基、至少25个碱基、 至少25-50个碱基可通过探针和杂交条件的适当调整被检测到，这是本领域熟知的。检测染色体区段或基因的重复或缺失的方法显示在实施例1-4中。在这些具体实 施例中的感兴趣的序列是人HER-2基因。HER-2基因的扩增已被证明与乳腺癌相关。对于 测试实例，基因组DNA从被证明患有乳腺癌的个体的血清中分离出来。对于对照实例，基因 组DNA从证明没患有乳腺癌的个体中分离出来。基因组DNA被生物素化，并与两个探针杂 交。一个探针与HER-2基因的区域互补，并用FITC标记。另一个探针与17号染色体特异 的单拷贝序列(17-SSC)区域互补，并用Cy5标记。与两个探针杂交的生物素化基因组DNA 然后被锚定到商业上可买到的链霉抗生物素包被的珠子上。来自HER-2探针的信号通过将 复合体结合到兔抗FITC/山羊抗兔Alcxa-488抗体而进一步加强。流式细胞术被用来检测 被捕获到珠子上的杂交复合体。测量从HER-2探针/抗体对和从17-SSC获得的信号的比 率。将来自测试实例的信号的比率与对照实例相比。较大的比率被认为是HER-2基因的扩
+飽
+曰ο现在将参考下面的非限制实施例更详细地描述本发明。实施例1基因组核酸的分离和生物素化基因组核酸的分离在本实施例中，基因组核酸是含有来自被证明为乳腺癌的个体或来自没有乳腺 癌的对照个体的人HER-2基因序列的基因组DNA。DNA从个体的血清中提取，或使用来自 Qiagen的EZl DNA试剂盒从石蜡包埋的组织中分离基因组DNA。基因组DNA是从21个随机选择的具有乳腺癌的个体和52个没有乳腺癌的对照个
22体的血清中获得的。基因组DNA也从石蜡包埋的组织中被分离出来，基因组DNA是从92个 随机选择的具有乳腺癌的石蜡包埋的组织样品和26个没有乳腺癌的对照样品中获得的。QIAamp MinElute Virus Spin Kit (Qiagen，Valencia，CA)被用来从石赌包埋的组 织(FFPE)中提取DNA。简要地，用二甲苯/乙醇脱蜡后，FFPE组织切片用蛋白酶K处理、加 热失活(96°C，10min)，在二氧化硅膜填充的旋转柱上纯化DNA。来自血浆或血清(200 μ 1) 的无细胞循环DNA根据制造厂商的方案在相同的试剂盒上纯化。用DpnII在37°C消化基因 组DNA 1小时。通过在65°C热失活10分钟来终止消化。分离DNA的牛物素化遵循试剂盒的说明书，使用Biotin-Nick TranslationMix (Roche Applied Science，Basel，瑞士)用生物素-16-dUTP 使 DNA 生物素 化。混合物中生物素-16-dUTP对dTTP的摩尔比率被调整为确保新合成的DNA中的每20-25 个核苷酸都被生物素标记，这为检测带来了最高的灵敏度。在典型的切口平移反应中获得 的标记的片段显示了 200至500个碱基对的大小分布。使用标准的切口平移(NT)方案使来自上述步骤的分离的和片段化的DNA生物素 化。含有 ο μ 1 DNA的反应混合物与NT酶、缓冲液和在65°C温育的生物素-16-dUTP混 合1.5小时。加入0. 5M EDTA来终止反应，混合物在65°C温育10分钟。通过在73°C温育 7分钟、然后在冰上温育5分钟，在变性液(70%的去离子甲酰胺，0.2XSSC)中对基因组 DNA(Iyg)进行变性。可选地，用商业上可买到的试剂盒(例如LabelIT pArray Biotin Labeling Kit)，用生物素直接地标记分离的DNA。实施例2标记的探针和生物素化的靶DNA的杂交与人HER-2基因的区域互补的FITC标记的探针和Cy5标记的17号染色体特异 的单拷贝序列(17-SSC)被用来与从血清或石蜡包埋的组织样品分离的生物素化的基因组 DNA杂交。17-SSC的序列提供如下5' Cy5-TGTATTTATC CTCTCTCTAG CCATCCATAGC TGTAGCTGGCTCACTCACT 3' (SEQ ID NO 1)探针在Hybrisol VII 杂交液(MP Biomedicals, Solon, OH)中再悬浮，在 37°C温 育30分钟，并在73°C变性10分钟。探针混合物然后在冰上被冷却5分钟。然后将变性液 (70%的去离子甲酰胺，0. 2XSSC)加入探针混合物。变性的探针混合物和变性的基因组DNA然后被结合并在37°C温育过夜。实施例3固相支持体上杂交复合体的捕获和用流式细胞术检测含有生物素标记的基因组DNA的杂交复合体被捕获到链霉抗生物素包被的珠子 上。链霉抗生物素包被的微球(Bangs Laboratories, Fishers, IN)在结合前连续地用 BlockAid(Invitrogen, Carlsbad, CA)和剪切的鲑精DNA(100 μ g/mL)处理以减少非特异性 结合。用 100 μ 1 结合缓冲液(IOOmM Tris-HCL ；ρΗ 8. 0,0. 1% Tween 20 禾Π IM LiCl)清洗 5μ 1链霉抗生物素珠子(Bangs Lab, Fishers, IN) 一次，将其在20 μ 1的结合缓冲液中再 悬浮。5 μ 1探针-DNA复合体被加入到珠子中，且混合物在室温震荡下室温温育1小时以形
23成珠子-DNA复合体。偶联的珠子用10%甲酰胺/0. 2 X SSC清洗一次，用0. 2 X SSC清洗2 次。珠子复合体在含有兔抗-FITC抗体(BD Bioscience)的溶液中再悬浮。珠子复合体用 在磷酸盐缓冲液(PBS)中的2%BSA清洗三次，在4%的封闭奶中再悬浮，并用在PBS中的 2% BSA清洗一次。珠子复合体以1 500稀释在含有Alexa-488标记的山羊抗兔抗体(BD Bioscience)的溶液中再悬浮，并在暗处室温旋转30分钟。珠子复合体然后用CW_2Cell清 洗器在PBS中的2% BSA清洗一次，以清洗并沉淀珠子。通过使用FITC/Alexa-488染料组合，来自FITC的荧光信号被进一步地放大。来 自珠子上FITC/Alexa-488和Cy5的荧光信号被检测为每个珠子的荧光改变，如遵循制造厂 商的说明书在流式细胞仪(Canto，BD San Jose, CA)上测量的。使用仪器(Diva)的软件 (BD, San Jose, CA)，对每个样品计算至少5000个事件的平均荧光强度(MFI)。实施例4检测基因组核酸中的遗传异常的测定结果测量了来自FITC/Alexa-488和Cy-5的信号比率。这个比率代表HER-2 :17_SSC的 比率。基于从对照个体或对照样品获得的结果，2. 14(平均值士3SD)的比率被认为是HER-2 基因的扩增。将使用实施例4的方法获得的结果与FISH、免疫组织化学(IHC)和ELISA方法获 得的结果进行比较。使用血清样品，本方法与FISH和IHC的结果之间具有90. 5 %和90 %的一致 性。使用本方法从血清样品获得的HER-2水平进一步与用ELISA方法并用12. 3ng/ml血 清作为截断获得的HER-2水平相比较。两种方法的结果之间具有52%的一致性。这种 一致性水平类似于报道的ELISA和IHC/基于细胞的检测方法l)Kong SY, et al Serum HER-2concentration in patients with primary breast cancer J Clin Pathol 59373-736,2006 ；2)Former MN et al Serum HER_2extracellular domain in metastatic breast cancer patients treated with weekly trastuzumab and paclitaxel association with HER_2status by immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization and with response rate. Ann Oncol 16:234-239,2005。来自乳腺癌患者的石蜡包埋的组织样品通过实施例4的方法、IHC和常规的FISH 方法检测。只有IHC 3+或在常规的FISH中样品与对照的信号比率大于2. 2的样品才被认 为是HER-2扩增阳性的，而具有IHC 0/1+染色或在常规的FISH中样品与对照的信号比率 小于1.8的情况被解释为HER-2扩增阴性。具有IHC 2+的样品被分类为不确定的(或意 义不明确的)。在检测的122个病例中，在103例中获得了来自常规的FISH和实施例4的方法的 匹配的结果。在常规的FISH中比率大于2. 2的四例被发现用实施例4的方法为阴性，而根 据常规的FISH认为是阴性(比率1.8或更小)的15例用实施例4的方法检测为阳性。总 体上，常规的FISH与实施例4的方法之间的一致性是84. 4% (P < 0. 001)。在检测的80例中，在63例中获得了来自IHC和实施例4的方法的匹配的结果。 IHC方法认为HER-2过表达阳性的8例被发现用实施例4的方法为阴性，而IHC方法认为是 阴性的9例被发现用实施例4的方法为阳性。总体上，IHC与实施例4的方法之间的一致 性是 78. 8% (P < 0. 001)。
除非另有定义，本文使用的所有的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通 技术人员通常理解的意义相同的意义。本文提供的所有核苷酸序列都表示为5'至3'方 向。本文例证性地描述的发明可在缺少本文没有具体公开的任何一个要素或更多个 要素、一个限制或更多个限制的情况下合适地实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含 有”等应被可扩展地阅读并且没有限制。此外，本文使用的术语和表述已被作为描述而非限 制性术语使用，使用这样的术语和表述并不是要排除显示和描述的这些特征或其部分的任 何等价物，而是认为，各种修改在本发明要求保护的范围内是可能的。因此，应理解为尽管本发明已通过优选的实施方式和可选的特征被具体公开，但 是本文公开的其中体现的本发明的修改、改进和变化可以被本领域的技术人员寻求，而且 这样的修改、改进和变化被认为是在本发明的范围之内。这里提供的材料、方法和实例代表 优选的实施方式，是示例性的，并不是要作为本发明范围的限制。本发明已在本文中被概括地和一般性地描述。落入本一般性公开的每一较窄的种 类和亚类也形成本发明的一部分。这包括本发明的一般性描述，其带有从所述种类中去除 任何主题的附加条件或负限定，不管所去除的物质是否在本文中具体陈述。此外，在本发明的特征或方面针对马库什组描述的情况下，本领域的技术人员会 认识到，本发明从而还针对马库什组的任何个体成员或亚族成员进行描述。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都以其全部做为参考明 确地并入，并入的程度与每一个被单独地做为参考并入相同。在矛盾的情况下，以本说明书 为准，包括定义在内。其它的实施方式在所附权利要求书中提出。
权利要求
检测基因组核酸中靶序列的方法，包括a.将包含所述靶序列的基因组核酸样品与对所述靶序列有特异性的探针相接触，并在固相支持体上形成含有所述基因组核酸和杂交于所述靶序列的所述探针的复合体，其中所述探针包含可检测标记，所述基因组核酸通过除核酸杂交外的方式被锚定在所述固相支持体上，并且所述基因组核酸的所述靶序列还未被扩增；和b.通过检测所述标记与所述固相支持体的关联来检测所述基因组核酸中所述靶序列的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述固相支持体包含结合对的第一成员，并且所 述基因组核酸包含所述结合对的第二成员，其中所述结合对成员的结合将所述基因组核酸 锚定到所述固相支持体上。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因组核酸被共价地锚定到所述固相支持体上。
4.根据权利要求1-3的任一项所述的方法，其中所述固相支持体是珠子、微孔板或玻璃表面。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述结合对是配体_受体、激素_受体或抗原_抗体。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述结合对是生物素和链霉抗生物素或链霉抗生 物素的变体。
7.根据权利要求1-6的任一项所述的方法，其中所述探针是寡核苷酸、人工染色体、片 段化人工染色体、基因组DNA、RNA或肽核酸。
8.根据权利要求1-7的任一项所述的方法，其中所述的探针的长度是至少50个核苷酸。
9.根据权利要求1-8的任一项所述的方法，其中所述可检测标记是荧光团、纳米颗粒、 同位素、化学发光化合物、酶或半抗原。
10.根据权利要求1-9的任一项所述的方法，其中所述复合体通过流式细胞术在所述 固相支持体上被检测。
11.根据权利要求1-10的任一项所述的方法，其中所述复合体通过检测结合到所述探 针的所述可检测标记的标记试剂被检测。
12.根据权利要求12所述的方法，其中所述标记试剂是对所述可检测标记有特异性的 标记抗体。
13.根据权利要求1-12的任一项所述的方法，其中所述基因组核酸存在于测试样品 中，并且其中所述测试样品是细胞、组织、体液、粪便、石蜡包埋的组织、细胞裂解物或组织 裂解物。
14.检测基因组核酸中遗传变异的存在或不存在的方法，包括a.将基因组核酸样品与对所述遗传异常有特异性的探针相接触，以及如果所述遗传异 常存在于所述基因组核酸中，则在固相支持体上形成含有所述基因组核酸和所述探针的复 合体，其中所述基因组核酸通过除核酸杂交外的方式被锚定在所述固相支持体上，并且所 述基因组核酸的所述靶序列还未被扩增；b.通过检测所述标记与所述固相支持体的关联来检测所述遗传异常的存在。2
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述遗传异常是染色体易位，并且所述探针的 第一部分杂交到所述易位的第一条染色体的区域，以及所述探针的第二部分杂交到所述易 位的第二条染色体的区域。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述遗传异常是与特定的染色体区段或基因相 关的重复或缺失。
17.根据权利要求14-16的任一项所述的方法，其中所述固相支持体包含结合对的第 一成员，并且所述基因组核酸包含所述结合对的第二成员，其中所述结合对成员的结合将 所述基因组核酸锚定到所述固相支持体上。
18.根据权利要求14-16的任一项所述的方法，其中所述基因组核酸被共价地锚定在 所述固相支持体上。
19.根据权利要求14-18的任一项所述的方法，其中所述基因组核酸是基因组DNA。
20.根据权利要求14-19的任一项所述的方法，其中所述固相支持体是珠子、微孔板或玻璃表面。
21.根据权利要求17所述的方法，其中所述结合对是配体_受体、激素_受体或抗 原-抗体。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述结合对是生物素和链霉抗生物素或链霉抗 生物素的变体。
23.根据权利要求14-22的任一项所述的方法，其中所述探针是寡核苷酸、人工染色 体、片段化人工染色体、基因组DNA、RNA或肽核酸。
24.根据权利要求14-23的任一项所述的方法，其中所述探针的长度是至少50个核苷酸。
25.根据权利要求14-24的任一项所述的方法，其中所述探针用荧光团、纳米颗粒、同 位素、化学发光化合物、酶或半抗原标记。
26.根据权利要求14-25的任一项所述的方法，其中所述复合体通过流式细胞术在所 述固相支持体上被检测。
27.根据权利要求14-26的任一项所述的方法，其中所述复合体通过检测结合到所述 探针的所述可检测标记的标记试剂被检测。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述标记试剂是对所述可检测标记有特异性的 标记抗体。
29.根据权利要求14-28的任一项所述的方法，其中所述基因组核酸存在于测试样品 中，并且其中所述测试样品是细胞、组织、体液、粪便、石蜡包埋的组织、细胞裂解物或组织 裂解物。
30.检测基因组核酸中遗传变异的存在或不存在的方法，包括a.将含有所述遗传异常的基因组核酸样品与对所述遗传异常有特异性的第一探针相 接触，并且在固相支持体上形成包含所述基因组核酸和所述第一探针的第一复合体，其中 所述探针包含可检测标记，所述基因组核酸通过除核酸杂交外的方式被锚定在所述固相支 持体上，并且所述基因组核酸的所述靶序列还未被扩增；b.将参考核酸与对所述参考核酸有特异性的第二探针相接触，并且在固相支持体上形 成包含所述参考核酸和所述第二探针的第二复合体，其中所述第二探针包含可检测标记；和c.通过检测与所述第一复合体相关的所述第一探针的所述可检测标记来测量形成的 所述第一复合体的量，通过检测与所述第二复合体相关的所述第二探针的所述可检测标记 来测量形成的第二复合体的量；和d.将所述第一复合体的量与所述第二复合体的量进行比较，其中两个复合体的量的差 异指示遗传异常。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述参考核酸是持家基因或染色体中的单拷贝 序列。
32.根据权利要求30-31的任一项所述的方法，其中所述基因组核酸和所述参考核酸从同一样品获得。
33.根据权利要求30-32的任一项所述的方法，其中所述基因组核酸和所述参考核酸 从不同的样品获得。
34.根据权利要求30-33的任一项所述的方法，其中所述第一探针和所述第二探针的 可检测标记是不同的。
35.根据权利要求30-31和33-34的任一项所述的方法，其中所述第一探针和所述第二 探针是相同的，并且其中所述基因组核酸和所述参考核酸从不同的样品获得。
36.检测基因组核酸中遗传异常的存在或不存在的方法，包括a.将含有所述遗传异常的基因组核酸样品与对所述遗传异常有特异性的第一探针相 接触，并且在固相支持体上形成包含所述基因组核酸和第一探针的第一复合体，其中所述 探针含有可检测标记，所述基因组核酸通过除核酸杂交外的方式被锚定在所述固相支持体 上，并且所述基因组核酸的所述靶序列还没被扩增；b.将基因组核酸样品与对参考核酸有特异性的第二探针相接触，并且在固相支持体上 形成包含所述参考核酸和第二探针的第二复合体，其中所述第二探针含有可检测标记；和c.通过检测与所述第一复合体相关的所述第一探针的可检测标记来测量形成的所述 第一复合体的量，并通过检测与所述第二复合体相关的所述第二探针的可检测标记来测量 形成的第二复合体的量；和d.获得所述第一复合体与所述第二复合体的量之比；和e.将获得的所述比与使用来自参考样品的基因组核酸而同样获得的比进行比较，其中 所述比的差异指示遗传异常。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述遗传异常是与特定的染色体区段或基因相 关的重复或缺失。
38.根据权利要求36-37的任一项所述的方法，其中所述第一复合体和第二复合体通 过流式细胞术在所述固相支持体上被检测。
39.根据权利要求36-38的任一项所述的方法，其中所述第一探针或所述第二探针的 长度是至少50个核苷酸。
40.根据权利要求36-39的任一项所述的方法，其中所述固相支持体包括结合对的第 一成员，并且所述基因组核酸包含所述结合对的第二成员，其中所述结合对成员的结合将 所述基因组核酸锚定到所述固相支持体上。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述结合对是生物素和链霉抗生物素或链霉抗生物素的变体。
42.根据权利要求36-41的任一项所述的方法，其中所述基因组核酸是基因组DNA。
43.根据权利要求36-42的任一项所述的方法，其中所述参考核酸是持家基因或染色 体中的单拷贝序列。
44.个体中疾病的诊断方法，包括a.将来自所述个体的基因组核酸样品和与对所述疾病有特异性的核酸序列互补的探 针相接触，以及如果所述基因组核酸含有对所述疾病有特异性的核酸序列，则在固相支持 体上形成包含所述基因组核酸和所述探针的复合体，其中所述探针含有可检测标记，所述 基因组核酸通过除核酸杂交外的方式被锚定在所述固相支持体上，并且所述基因组核酸的 所述靶序列还未被扩增；和b.通过检测与所述支持体相关的可检测标记的量来测量在所述固相支持体上形成的 所述复合体的量；和c.将形成的复合体的量与使用来自在相似条件下分析的参考样品的基因组核酸形成 的复合体的量进行比较，其中从所述个体形成的复合体的量与所述参考样品相比的差异对 所述疾病有诊断价值。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述参考样品取自正常的个体。
46.根据权利要求44-45的任一项所述的方法，其中所述方法用于测量怀疑患有癌症 的个体中的肿瘤负荷。
47.根据权利要求44-46的任一项所述的方法，其中所述参考样品从获得测试样品之 后的同一个体获得。
全文摘要
本发明提供了检测锚定在固相支持体上的未扩增的基因组核酸的方法。该方法对检测与各种疾病相关的遗传异常、诊断和预后是有用的。
文档编号C12Q1/68GK101925677SQ200880125631
公开日2010年12月22日 申请日期2008年11月14日 优先权日2007年11月29日
发明者M·阿尔比塔 申请人:奎斯特诊断投资公司