线粒体收集和浓缩以及其用途的制作方法

相关申请的交叉引用本申请要求2014年12月8日提交的美国临时专利申请号62/089,118的优先权，其全部内容通过引用并入本文。发明背景发明领域本发明涉及从哺乳动物细胞中收集线粒体，线粒体的浓缩以及浓缩的线粒体制剂的用途。相关技术的描述线粒体是在大多数真核细胞中发现的膜结合的细胞器。线粒体的直径范围为0.5至1.0μm。线粒体为大多数细胞内事件提供三磷酸腺苷(atp)形式的能量。线粒体还在离子稳态、程序性细胞死亡和适应性发热中具有重要功能。线粒体功能障碍已经牵涉许多病理生理过程，如衰老，神经变性疾病，糖尿病，肥胖症和不育症。衰老与线粒体功能降低有关，特别是在非复制细胞如成熟卵母细胞中，线粒体功能降低被认为是大龄妇女生育率下降的一个原因。尽管细胞的大部分dna包含在细胞核中，但线粒体具有其自己的独立基因组。此外，与核染色体dna不同，每个线粒体中存在多个线粒体基因组拷贝，体细胞中平均每个细胞器有5个mtdna基因组。线粒体dna(mtdna)是母本遗传的双链环状基因组，其编码37个基因，其中13个编码涉及呼吸和氧化磷酸化的多肽。人中期卵母细胞估计有100,000-200,000个线粒体。tzeng等人(2004),fertil.steril.82(s2),s53。与真核生物核dna不同，mtdna缺少非编码内含子和组蛋白，并且更容易受到线粒体基质中高浓度的活性氧(ros)和自由基的损伤。由于持续暴露于ros，卵母细胞线粒体累积mtdna突变和缺失。随着衰老，线粒体基因组对ros的暴露增加，这降低了线粒体功能，并导致卵母细胞中能量可用性的降低。为了改善衰老卵母细胞的生殖结果，已经尝试将线粒体浓缩物注入卵母细胞以增加线粒体功能，从而增加受精率和/或增强胚胎发育。例如，来自年轻小鼠卵母细胞的线粒体已被转移到成熟的老年卵母细胞中。perez等人(2000),nature,403:500-1。然而，来自非自体细胞的线粒体转移导致线粒体异质性(即，相同细胞中不同的线粒体基因组)和异常小鼠表型。人类尝试执行卵质从年轻供体卵子到来自较老患者的低质量卵母细胞中的转移(即，包含线粒体的卵母细胞质的转移)由于这种方法在后代中引起线粒体异质性而没有持续下去。brenner等人(2001),fertil.steril.74:573-8；barrit等人(2001),hum.reprod.16:513-16。线粒体从自体细胞转移到卵母细胞中将避免供体和受体mtdna的异质性问题。线粒体收集的现有技术方法已经产生具有较低浓度线粒体和/或较不纯化的线粒体和/或较大比例的受损线粒体(例如破坏线粒体外膜的完整性，和/或部分丧失线粒体的呼吸和/或能量产生功能)的线粒体制剂。因此，本领域仍然需要用于制备具有高比例功能性线粒体的浓缩线粒体制剂的更好方法。发明概述本发明部分地依赖于在不使用染料、发色团、荧光团或其它物理、化学或代谢标记物的情况下收集和浓缩线粒体的方法的发现。特别地，该方法利用反相离心法，其中含线粒体的重相保持在旋转轴的近侧，轻相位保持在旋转轴的远侧，并允许在相边界处收集浓缩的线粒体制剂。线粒体制剂的特征在于优于现有技术的浓缩程度和线粒体功能。浓缩的线粒体制剂可用于各种应用，包括用于线粒体转移到卵母细胞中(“autologousgermlinemitochondrialenergytransfer”smoraugmentsm,ovascience,inc.,waltham,ma)用于体外受精。augmentsm方法包括将包含来自哺乳动物雌性生殖系干细胞或卵原干细胞(oogonialstemcell，osc)的线粒体或从osc的后代获得的线粒体的组合物转移到自体卵母细胞中，由此制备用于ivf或人工授精的卵母细胞。augmentsm方法描述于2012年4月13日提交的题为“compositesandmethodsforautologousgermlinemitochondrialenergytransfer”的wo2012/142500中，其全部内容并入本文。一方面，本公开内容涉及用于产生浓缩的线粒体制剂的方法，其包括(a)离心底部封闭的管，所述管包含(i)在管的靠近旋转轴的部分中的包含线粒体悬浮液的重相；(ii)在管的远离旋转轴的部分中的轻相；和(iii)重相和轻相之间的相界面。在这些方法中，底部封闭的管以足以使线粒体悬浮液中的线粒体在轻相和重相之间的界面处的重相中形成浓缩的线粒体层而不引起轻相和重相的反转的速度和时间离心。方法还包括(b)收集包含至少一部分浓缩的线粒体层的流体体积以产生浓缩的线粒体制剂。另一方面，本公开内容涉及用于产生浓缩的线粒体制剂的方法，其包括(a)将包含线粒体悬浮液的第一流体体积引入到底部开口的管中。所述方法还包括(b)将第二流体体积引入到管中，其中所述第二流体的密度小于第一流体，从而形成在管的一部分中的包含第一流体和线粒体悬浮液的重相、在管的另一部分中的包含第二流体的轻相以及在重相和轻相之间的相界面。所述方法还包括(c)将靠近轻相的管端部封闭以形成底部封闭的管；和(d)将底部封闭的管放置在离心机中，其中封闭端远离旋转轴。所述方法还包括(e)以足以使线粒体悬浮液中的线粒体在轻相和重相之间的界面处的重相中形成浓缩的线粒体层而不引起轻相和重相的反转的速度和时间离心底部封闭的管。所述方法还包括(f)收集包含至少一部分浓缩的线粒体层的流体体积以产生浓缩的线粒体制剂。在一些实施方案中，在所公开的方法中，在将第二流体引入管之前，将第一流体引入至管中。在一些实施方案中，在所公开的方法中，重相是水相。在一些实施方案中，在所公开的方法中，重相通过化学、机械或声波裂解及随后的离心获得。在一些实施方案中，在所公开的方法中，轻相是有机相。在一些实施方案中，在所公开的方法中，轻相包含生物相容性油。在一些实施方案中，在所公开的方法中，生物相容性油轻相选自矿物油，石蜡油，轻油，细胞培养油和icsi油。在一些实施方案中，在所公开的方法中，浓缩的线粒体制剂的浓度为每皮升至少一个线粒体。在一些实施方案中，在所公开的方法中，浓缩的线粒体制剂的线粒体浓度为每皮升1至10000个线粒体；每皮升50至10000个线粒体；每皮升100至10000个线粒体；每皮升150至10000个线粒体；每皮升200至10000个线粒体；每皮升250至10000个线粒体；每皮升300至100000个线粒体；每皮升400至10000个线粒体；每皮升450至10000线粒体；每皮升500至10000个线粒体。在一些实施方案中，在所公开的方法中，管在重相和轻相之间的界面处的内径小于1μm。在一些实施方案中，在所公开的方法中，将管以小于10,000g的速率离心。在一些实施方案中，在所公开的方法中，将管以7,500和12,500×g的速率离心。在一些实施方案中，在所公开的方法中，在将第二流体体积引入底部开口的管之后，将所述管的靠近轻相的部分热封穿过包含轻相的部分，以形成底部封闭的管。在一些实施方案中，在所公开的方法中，管包括选自以下的材料：聚乙烯(pe)，高密度聚乙烯(hdpe)，低密度聚乙烯(ldpe)，聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)，聚丙烯(pp)，聚氯乙烯(pvc)，聚偏二氯乙烯(pvdc)，聚苯乙烯(ps)，高抗冲聚苯乙烯(hips)，丙烯腈丁二烯苯乙烯，聚酰胺，聚碳酸酯，聚氨酯和尼龙。在一些实施方案中，在所公开的方法中，浓缩的线粒体制剂中至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或99.5％的线粒体是具有功能的。另一方面，本公开内容涉及包含含有每皮升至少一个线粒体的溶液的浓缩的线粒体制剂。在一些实施方案中，在所公开的制剂中，溶液包含每皮升1至10,000个线粒体。在一些实施方案中，在所公开的制剂中，该溶液包含每皮升1至10000个线粒体；每皮升50至10000个线粒体；每皮升100至10000个线粒体；每皮升150至10000个线粒体；每皮升200至10000个线粒体；每皮升250至10000个线粒体；每皮升300至100000线粒体；每皮升400至10000个线粒体；每皮升450至10000线粒体；每皮升500至10000个线粒体。在一些实施方案中，在所公开的制剂中，制剂还包含一定体积的生物相容性油。在一些实施方案中，在所公开的制剂中，至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或99.5％的线粒体是具有功能的。下面示出和描述了本公开内容的这些和其它方面和实施方案。通过检查以下附图和详细描述，本领域技术人员将了解其它系统、方法和特征。旨在将所有这些附加的系统，方法和特征包括在本说明书内，在本发明的范围内，并由所附权利要求保护。附图说明以下附图是本发明的实施方案的举例说明，其并不意味着限制权利要求所涵盖的本发明的范围。图1是显示用于产生浓缩的线粒体制剂的方法的一些实施方案的示意图。图2是显示用于产生浓缩的线粒体制剂的方法的其它实施方案的示意图。详细描述本公开内容涉及线粒体从哺乳动物细胞的收集，线粒体的浓缩以及浓缩的线粒体制剂的用途。定义本文使用的所有科学和技术术语，除非另有定义，旨在具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。本文中使用的技术的引用意图是指本领域通常理解的技术，包括对本领域技术人员明显的等效或后续开发的技术的那些技术或替代的变化。此外，为了更清楚和简明地描述本发明的主题，提供了在说明书和所附权利要求中使用的某些术语的以下定义。如本文所用，关于离心的术语“反相”意味着密度较低或较轻的流体相在离心管的远离旋转轴的部分(“底部”)中并且密度较高或较重的流体在离心管的靠近旋转轴的部分(“顶部”)中。因为在离心后，较密或较重的相通常位于管的远端部分，所以当轻相位于远端而重相位于近端时，这些相被称为是“反转的”。如本文所使用的，术语“重相”是指离心管中的流体层，其在单位体积中比同一管中的另一相更密或更重。术语“重”和“更密”在本文中可互换使用。在具有两个流体相的离心中，重相通常是水性的，但这不是必需的。如本文所使用的，术语“轻相”是指离心管中的流体层，其在单个体积中比同一管中的另一相更不密或更轻。术语“更不密”和“更轻”在本文中可互换使用。在具有两个流体相的离心中，轻相通常是有机的(例如油)，但这不是必需的。如本文所用，术语“水相”是指其中水是主要溶剂的流体相，但可能存在可与水混溶的其它极性组分。水相也可以包括各种溶质和悬浮颗粒。值得注意的是，在本发明中，水相可以包括线粒体。如本文所用，术语“有机相”是指其中基本上非极性有机分子是主要溶剂的流体相，尽管可能存在可与主要有机溶剂混溶的其它非极性组分。有机相也可以包括各种溶质和悬浮颗粒。如本文所用，术语“底部封闭的管”是指可以接收流体并在离心过程中保留流体的任何容器。底部封闭的管可以具有各种形状，并且可以用各种术语来表示，包括离心管，试管，样品管，封闭管，小瓶，比色皿，封闭移液管等。底部封闭的管可以通过封闭底部开口的管的一端，例如通过堵塞、压接(crimping)或热封管的一端来产生。如本文所用，术语“体外受精”和缩写“ivf”是指其中卵母细胞在雌性体外受精的任何辅助生殖技术。ivf包括其中卵母细胞与容器诸如培养皿或具有孔的板中的精子混合以允许受精(有或者没有去除透明带)的程序，以及涉及卵母细胞的胞质内精子注射(icsi)的过程。如本文所用，术语“生物相容性”和“药学上可接受的”是指物质在其存在的浓度下对活细胞或细胞器无毒性，并且当给予哺乳动物时是生理上可耐受的并且不产生严重的过敏、发热或类似的不期望的反应。如本文所用，术语“载体(carrier)”是指与化合物一起施用的稀释剂，佐剂，赋形剂或媒介物。生物相容性或药学上可接受的载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如矿物油，植物油等。水或其它水性溶液，盐水溶液，葡萄糖水溶液和甘油溶液可用作载体，特别是用于可注射溶液。合适的载体描述于remington'spharmaceuticalsciences,18thed.,ewmartin(ed.),mackpublishingco.,easton,pa.。如本文所用，术语“约”或“近似”表示所引用数值的百分之十(10％)以内。如本文所用，术语“增加”或“减少”意指相对于参考状态分别至少10％更多或更少。如本文所使用的，除非上下文另有明确指出，术语“一个”是指一个或多个。如本文所使用的，除非上下文另有明确指示，否则术语“或”是指包含性的“和/或”而不是指排除性的“任一个/或”。一般考虑本发明部分地依赖于用于收集和浓缩线粒体的方法的开发。在一些实施方案中，该方法提供了相比一些现有技术方法(其损害或丧失了较大百分比的线粒体)产生具有更完整、可用的线粒体的浓缩线粒体制剂。此外，在一些实施方案中，所述方法提供线粒体制剂的产生，其中线粒体的浓度大于现有技术中实现的浓度。此外，该方法提供产生浓缩的线粒体制剂，而不用例如发色团、荧光团、抗体或其它可检测和可选择的标记物标记线粒体。此外，该方法提供产生基本上不含分子标签如发色团、荧光团、抗体或其它可检测和可选择标记的浓缩线粒体制剂。反相离心本发明使用反相离心来产生浓缩的线粒体制剂。本发明的方法包括对底部封闭的管进行离心，其中存在在管的顶部(即，靠近旋转轴的管的部分)的包含线粒体悬浮液的重相，在管的底部(即，远离旋转轴的管的部分)的轻相，以及在重相和轻相之间的相界面。将管以足以使线粒体悬浮液中的线粒体在轻相和重相之间的界面处的重相中形成浓缩的线粒体层的速度和时间离心。然而，必须控制离心速度和时间，以防止轻相和重相反转至其正常构型(即在底部的重相和在顶部的轻相)。如对于本领域技术人员将明显的，相反转的可能性随离心速度(即，增加g力)，增加离心时间，增加离心管直径以及增加重相和轻相的密度差异而增加。确定速度、时间、直径和密度的适当组合只需要常规实验。在从全细胞产生浓缩的线粒体制剂的整个过程中，可以采用相对离心力(rcf)或离心机“速度”的各种不同的值。例如，在沉积全细胞中，rcf值可以在500-1500g的范围内。裂解后，可以使用在500-1500g范围内的rcf的第一次沉降来沉淀较大的细胞器或膜片段而没有沉淀线粒体。除去上清液后，可以将上清液再次离心，此时在5000-12500g(例如7000-10000g)的范围内的rcf产生包含沉淀中的线粒体的粗级分。可以将沉淀物在5000-12500g范围内的rcf重悬和沉淀多次，以提高线粒体沉淀的纯度。最后，对于反相离心，可以将线粒体沉淀重悬于重相中，并再次以7500-12500g(例如10000g)范围内的rcf离心，以在相边界处产生浓缩的线粒体沉淀。离心后，收集包含至少一部分浓缩的线粒体层的流体体积以产生浓缩的线粒体制剂。可以通过例如在重相和轻相之间的界面处吸移线粒体层来收集该层。虽然优选仅收集线粒体层，但是对于某些应用，收集少量的轻相是可接受的。例如，如下所述，在涉及与ivf处理结合的线粒体转移到卵母细胞的应用中，可以将浓缩的线粒体制剂置于板或盘上并被有机流体层(例如icsi油)覆盖以防止蒸发。因此，在这种应用中，少量的轻相流体可能与重相流体分离并且合并在覆盖的有机流体中。在一些实施方案中，在制备用于离心的反转相期间形成底部封闭的管。因此，在一些实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：将包含线粒体悬浮液的第一流体体积引入到底部开口的管中，然后将第二流体体积引入到所述管中。第一和第二流体分别形成在管的一部分中的包含第一流体和线粒体悬浮液的重相和在管的另一部分中的包含第二流体的轻相，并且限定在所述重相和轻相之间的相界面。然后将靠近轻相的管端部封闭以形成底部封闭的管。在一些实施方案中，管被封闭穿过轻相(即，在轻相内产生封闭，使得部分轻相从管中排除)。然后如此形成的底部封闭的管可以放置在离心机中，其中封闭端远离旋转轴，并且可以如上所述离心，以产生浓缩的线粒体层。然后如上所述通过收集浓缩的线粒体层获得浓缩的线粒体制剂。线粒体悬浮液和重相流体线粒体悬浮液可以通过本领域已知的任何标准方法制备。例如，可以化学或机械裂解全细胞(例如新鲜获得或解冻的冷冻细胞)以释放细胞质，并且粗裂解物可以被认为是线粒体悬浮液。然而，优选地，在使用本发明的反相离心之前，将粗裂解物进一步加工以进行纯化和制备。线粒体分离的现有技术方法可以在例如tzeng等人(2004),fertil.steril.82(s2),s53；yamaguchi等人(2007),celldeathdiffer.14:616-624；和shufaro等人(2012),fertil.steril.98(1):166-72中找到。可以使用这些方法来产生第一线粒体悬浮液，然后可以应用本发明的反相离心方法。或者，线粒体悬浮液可以基本上如下文实施例中所述制备。在一些实施方案中，线粒体悬浮液是水性悬浮液。在一些实施方案中，水性悬浮液包括通过例如已通过小鼠胚胎测试(mea)(例如，charlesriverlaboratories，wilmington，ma)的注射用水(wfi)或等同物(例如，用于辅助生殖技术(art)的水，irvinescientificusa，santaana，ca)或其它生物相容性或药学上可接受的载体(例如葡萄糖，蔗糖，甘油，柠檬酸盐)产生的非致热的高纯度等级的水。在一些实施方案中，线粒体悬浮液由分离的卵原干细胞(osc)产生。osc可以如例如wo2005/121321，美国专利号7,955,846和美国专利号8,652,840中所述获得。离心管本发明的离心管可以是具有足够小的内径以防止在离心过程中相的反转的任何底部封闭的管。在一些实施方案中，底部封闭的管是移液管或微量吸管或收集管，其已经在一端被封闭(载入重相和轻相之前或之后)。管能够容纳至少1μl，5μl，10μl，20μl，30μl，40μl或50μl的液体体积，并且可以容纳高达100μl，150μl，200μl，250μl，300μl，500μl以上的更大体积。在一些实施方案中，管具有从1μm，10μm，20μm，40μm，50μm，60μm，70μm，80μm，90μm或100μm到150μm以上的内径(在相边界处测量)。在一些实施方案中，内径(在相边界处测量)为25-250μm，50-150μm或75-100μm。注意，内径不需要是恒定的，并且锥形管被考虑用于本发明(例如，以下实施例中描述的80μm微量移液管(cookmedical，bloomington，in))。管可以由玻璃，塑料和/或任何半柔性管制成。如本文所用，术语“塑料”是指能够被模塑、挤出或浇铸成形状和膜的通过聚合制备的各种合成或半合成有机固体中的任何一种。塑料材料包括但不限于聚乙烯(pe)，高密度聚乙烯(hdpe)，低密度聚乙烯(ldpe)，聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)，聚丙烯(pp)，聚氯乙烯(pvc)，聚偏二氯乙烯(pvdc)，聚苯乙烯(ps)，高抗冲聚苯乙烯(hips)，丙烯腈丁二烯苯乙烯，聚酰胺，聚碳酸酯，聚氨酯和尼龙。在一些实施方案中，例如，通过封闭聚碳酸酯移液管(例如，微量移液管，cookmedical，bloomington，in)或玻璃移液管(例如drummondscientificcompany，broomall，pa)的底部形成底部封闭的管。在一些实施方案中，底部封闭的管可以放置在一个或多个其它管、套管、吸管、保持器或适配器(例如离心管)内，以在离心机的转子组件内保持和/或缓冲底部封闭的管。轻相流体本发明的轻相流体可以包含一种或多种不同的有机化合物，要求是轻相能够与重相形成相边界，其防止线粒体在所使用的离心速度下进入轻相。在一些实施方案中，轻相流体包含一种或多种生物相容性油，包括但不限于矿物油(例如，cas8042-47-5，sigmaaldrich，st.louis，mo；sagemediaoilfortissueculture，catalog#art-4008，origioa/s，denmark)，轻油，石蜡油和已获得销售批准(例如美国fda的510(k)接受)的任何其它体外受精(ivf)培养油(例如icsi油)。可以单独使用或组合使用的具有比等渗溶液更高的渗透压的其它有机流体包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮(pvp)溶液，蔗糖和蔗糖聚合物(例如sigma-aldrich，st.louis，mo)溶液，胶体二氧化硅颗粒(例如，sigma-aldrich，st.louis，mo)溶液等。在一些实施方案中，轻相流体具有超过250osm的重量摩尔渗透压浓度。浓缩的线粒体制剂另一方面，本发明提供了根据本发明的方法制备的浓缩的线粒体制剂。在一些实施方案中，所述浓缩的线粒体制剂中的线粒体具有每皮升至少一个线粒体的浓度。在一些实施方案中，在所公开的制剂中，溶液包含每皮升1至10000个线粒体；每皮升50至10000个线粒体；每皮升100至10000个线粒体；每皮升150至10000个线粒体；每皮升200至10000个线粒体；每皮升250至10000个线粒体；每皮升300至100000线粒体；每皮升400至10000个线粒体；每皮升450至10000个线粒体；每皮升500至10000个线粒体。在一些实施方案中，浓缩的线粒体制剂中至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或99.5％的线粒体是具有功能的。“功能性线粒体”是指具有生物活性的线粒体。通过使用本领域已知的方法，包括通过氧化磷酸化(oxphos)atp测定、测量细胞色素c释放、测量呼吸速率和/或目视检查，可以测定浓缩的线粒体制剂中的功能性线粒体的百分比。在一些实施方案中，对浓缩的线粒体层进行线粒体分析以确定功能性线粒体的百分比。目视检查可以包括使用远场荧光显微术；可以使用各种显微技术和特异性荧光探针来染色线粒体，包括使用绿色荧光蛋白(gfp)，纳米显微术或超分辨率荧光，高分辨率电子显微镜和电子层析成像。marin-garcia(2013),“methodstostudymitochondrialstructureandfunction,”inmitochondriaandtheirroleincardiovasculardisease,springerus,newyork。评估线粒体功能的各种体外方法包括分光光度酶测定，atp产生的生物发光测量和氧消耗的极谱测量。电泳技术可用于评估线粒体功能。例如，可以使用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后用western免疫印迹法来分析线粒体蛋白的含量。高度特异性和敏感的免疫检测方法增强了电泳技术的应用。线粒体蛋白的各种特异性抗体可用于免疫细胞化学和western免疫印迹分析。这些抗体包括atp合成酶亚单位，细胞色素c和细胞色素c氧化酶，pgc-1和mttfa。以下实施例举例说明了实施本发明的一些优选模式，但并不旨在限制所要求保护的发明的范围。可以使用替代材料和方法来获得类似的结果。实施例1产生线粒体悬浮液组织解离使用来自冷冻卵巢活组织检查的组织作为线粒体的来源。进行本领域已知的组织解离程序。使用本领域熟知的合适的无菌技术，在生物安全柜中进行除了细胞分选的所有步骤。获得三(3)个四孔板。在每个四孔板上，三个孔被标记为“1”，“2”和“3”。每个源材料指定一个板。使用1000μl微量移液管，将冷冻保存培养基和保存培养基按照下表中的体积加入到每个平板的每个孔中，并且通过上下吹吸三到五次轻轻混合。培养基孔1孔2孔3冷冻保存600μl300μl0μl保存300μl600μl900μl制备以下材料：一瓶3.636ku/mldna酶i；一瓶400u/ml胶原酶(来自liberasemtfc/t试剂盒的2000mtf；rochediagnostics，indianapolis，in)；和一瓶1mg/ml的嗜热菌蛋白酶(来自liberasemtfc/t试剂盒；rochediagnostics，indianapolis，in)。使用下表中的规格制备了标记为“bss/dnase/liberase溶液”的c-管。将管置于37±1℃水浴中直至进一步使用。将10ml不含mgcl2/cacl2的hbss的溶液等分到50ml锥形管中，并置于37±1℃水浴中直至进一步使用。将合适数量的小瓶浸没在液氮中。所有组织小瓶在环境温度下通过空气解冻同时解冻60秒。在60秒的空气解冻后，将小瓶在37.0℃±1.0℃的水浴中同时孵育120秒。将小瓶消毒。使用无菌镊子，将每片组织源材料从小瓶转移到每个预先制备的4孔培养板的孔#1中。将一片组织放置在每个板中并完全浸没在培养基中，并将源材料保持在每个标记的孔#1中10分钟。将源材料从每个标记的孔#1转移到每个标记的孔#2，完全浸没在培养基中，并保持在每个标记的孔#2中10分钟。将源材料从每个标记的孔#2转移到每个标记的孔#3，完全浸没在培养基中，并保持在每个标记的孔#3中5分钟。将所有源材料转移到含有hbss/dnase/liberase溶液的c-管中。将c-管转移到组织解离器(gentlemacstm，miltenyibiotec，bergischgladbach，de)中，并根据制造商的说明解离组织。细胞分选程序为了从卵巢组织样品获得具有高百分比的功能性线粒体的细胞，使用针对vasa蛋白的抗体从存在于卵巢活检组织中的其它细胞分类卵原干细胞(oscs)。使用玻璃5ml血清移液管，将解离的细胞混合物转移到70μm的细胞过滤器中，将其置于50ml锥形管上。用4ml不含cacl2和mgcl2的温热hbss冲洗c-管。使该冲洗体积通过过滤器。接下来，将来自50ml锥形管的6.75ml细胞悬浮液转移到标有“2的过滤细胞1”的15ml锥形管中，并将等体积放在标有“2的过滤细胞2”的15ml锥形管中。管在1200相对离心力(rcf)下在环境温度(范围：18.0-22.0℃)下离心10分钟，其中制动器关闭(0)。将大部分上清液除去并转移到标有“第一上清液”的50ml锥形管中。用来自每个管的微量移液管除去任何残留体积(约500μl)。使用250μl的2％嵌段溶液重新悬浮2的过滤细胞1中的沉淀。将细胞悬浮液转移到2的过滤细胞2管中的沉淀物。使用250μl的2％嵌段溶液冲洗2的过滤细胞1管。将冲洗体积转移到2的过滤细胞1管中，并重新悬浮沉淀。观察细胞悬浮液的可见团块。如果在移液后看到团块，则根据需要重新过滤细胞。测量并记录2的过滤细胞2管中的体积。将240μl体积的1％洗涤溶液加入到标有“细胞计数”的1.5ml微量离心管中。再次悬浮细胞悬浮液，将10μl细胞转移到1.5ml细胞计数管中。使用荧光活化细胞分选(facs)进行细胞分选。使用500μl体积的1％洗涤溶液来清洗管线。将细胞计数管置于样品装载器中，并获取样品约2分钟。使用本领域已知的方法计算细胞数目。如果总细胞数大于7x106个细胞，则进行步骤以将样品分成两半，使得样品的一半冷冻保存，并将剩余的样品染色并用于细胞分选(见下文)。如果总细胞数小于或等于7x106个细胞，则将细胞在室温下用2％嵌段溶液孵育20分钟。将初级抗体等分试样解冻并在环境温度(20℃±2.0℃)下以200×g(rcf)离心1分钟，其中制动器设置在高(9)，以确保体积被局限在小瓶的底部。从重悬浮的细胞沉淀(“第一沉淀”)中取出2μl的体积，并转移到标记为“阴性对照”的新的15ml锥形管中。将体积为5ml的1％洗涤溶液加入阴性对照管。将计算体积的抗体加入到第一沉淀管中并充分混合。将管在黑暗中室温孵育15分钟。将体积为5ml的1％洗涤溶液加入到标记为“抗体标记的”细胞的15ml管中。将抗体标记的细胞和阴性对照在室温(20.0℃±2.0℃)下以1200×g(rcf)离心5分钟，其中制动器设置在高(9)。制备含有“抗体标记的细胞第一上清液”和“阴性对照上清液”的管。使用微量移液管，从含有抗体标记的细胞的15ml锥形管中取出上清液，并转移到适当标记的15ml锥形管中。使用375μl的1％洗涤溶液重新悬浮抗体标记的细胞。将细胞悬浮液转移到标记为“抗体染色的细胞”的1.5ml微量离心管中。重悬抗体染色的细胞。观察细胞悬浮液，并且如果团块可见，则根据需要使用过滤器重新过滤细胞。使用微量移液管，将上清液从阴性对照锥形管中取出并转移到适当标记的15ml锥形管中。使用500μl的1％洗涤液将阴性对照试管中的细胞沉淀重新悬浮，并转移到标记为“阴性对照”的1.5ml微量离心管中。将500μl1％洗涤缓冲液的体积等分到标记为“vasa+细胞”的新的15ml锥形管中。将500μl1％洗涤缓冲液的体积等分到另一个标有“漂洗2”的15ml锥形管中。使用“阴性对照”，“抗体染色的细胞”，“漂洗2”和“vasa+细胞”管进行细胞分选。使用sonyfacs机器进行细胞分选，其中记录规则字段设置为使事件限制为10000。将两个空的15ml锥形管放置在分选收集保持器中，左和右分选门设置为“细胞”。停止极限设置为500次事件。将阴性对照细胞重新悬浮并加载到样品加载区域中。通过更改样品压力调节事件发生率以实现每秒200-2000次事件。在alexafluor647检测器设置中进行了微小的调整，以确保事件在102和103之间。将细胞门(cellsgate)调整为包含背散射(bsc)相对前向散射(fsc)曲线图中大约90％的事件。根据需要调整vasa+门(反映阳性染色的细胞)以不包含任何未染色的群体。将阴性对照样品从样品管保持器中取出并放在一边。根据需要，进行芯片对准和分选校准并再次执行，随后进行探针和样品线灭菌。取出15ml锥形管，并将vasa+管与1％洗涤溶液插入到分选室的左侧分选位置。记录规则字段被设置为事件计数为2000，样品停止条件为“记录”。每个门都设置为“所有事件”。压力变化以维持每个读数1500-2000个计数。将冲洗2管装载到样品管保持器上，用洗涤溶液清洗管线。将抗体染色的细胞管重新悬浮并装载到样品管保持器上。获得抗体染色的细胞，并记录事件。通过观察点图(af647相对bsc)，确认事件发生在alexafluor647检测器内。数据采集得到确认。将抗体染色的细胞从装载区域中取出并储存在防光区域。评估染色的细胞群体。代表特异性和非特异性染色的细胞群体的群体在点图(af647相对bsc)中是可见的。进行了调整，以确保阳性群体是可见的。vasa+门沿x轴(af647)迁移，以涵盖预分选样品门的主要的较高强度染色的细胞群体。记录规则事件限制更改为10000000。分选限制更改为零(无停止限制)，分选模式更改为“yield”。左侧的分选门被选为vasa+门。确保将vasa+细胞管置于收集保持器的左侧。用“冲洗2”洗涤溶液清洗管线。将抗体染色细胞管中的细胞重新悬浮，将管装载到样品管保持器上，分选细胞，直至样品管完全耗尽。在分选过程中，调整压力以使事件发生率保持在每秒200-2000次事件。取出含有分选的vasa+级分的15mlfacs管，并测量体积。用1000μl的1％洗涤溶液冲洗15ml管的侧面。使用以下步骤进行osc冷冻。将冷冻保存控制器(crysalystmptc-9500,biostasys,inc.,nv)连接到冷冻保存室。将覆盖的冷冻室放入液氮浴中。缓慢加入额外的液氮以增加体积，直到液氮离冷冻室顶部大约3cm。该程序具有以下设置：从18℃开始；最终温度为-80℃，以1℃/分钟的速度降低；在-80℃保持10分钟；并在-80℃运行信号结束。在5℃(范围：2-8℃)下，将分选的vasa+细胞级分在1200rff下分选10分钟，其中将制动器设置在中等(5)。如果在细胞分选之前将组织样品分开，则从2-8℃储存获得含有预分选卵巢细胞的冷冻小瓶，并与vasa+细胞一起离心。去除上清液，用500μl冷冻保存培养基重新悬浮细胞沉淀。使用1000μl微量移液管，取出来自15ml锥形管的上清液，并转移到15ml标记为“第一vasa+上清液”的锥形管中。使用200μl移液管除去任何剩余体积，而不干扰沉淀。将沉淀物重新悬浮在500μl冷冻保存培养基中，并将细胞悬浮液转移到冷冻小瓶中。将冷冻小瓶置于冷冻室中。程序完成后，将冷冻小瓶储存在充满液氮的杜瓦瓶中。线粒体分离程序如下进行线粒体浓缩程序。根据下表中列出的规格制备20ml体积的1x分离缓冲液：组分分离缓冲液10％hsa水浓度1x2％1x体积(ml)10.01.09.0将组分加入到50ml锥形管中，混合，并将2-3ml等分到单独的锥形管中，用于重悬浮和漂洗。将管标记为“1x分离缓冲液”，并将其储存在冰箱或金属热珠(labarmortmbeads,labarmorllc,cornelius,or)中。类似地，制备“hbss中的1％hsa”的管。制备hbss中的1％hsa的10ml体积，并将2-3ml等分到分开的锥形管中，用于重悬浮和漂洗。将管标记为“hbss中的1％hsa”并储存在冰箱或金属热珠中。将含有分选的vasa+级分的人osc的冷冻保存小瓶转移到2l杜瓦瓶中，并将小瓶浸没在液氮中。将小瓶在环境温度下空气解冻60秒。在60秒的空气解冻后，将小瓶在37.0℃±1.0℃的水浴中孵育120秒。使用1000μl微量移液管，将小瓶中的整个体积缓慢转移至标有“解冻的vasa+级分”的1.5ml微量离心管中。使用1000μl血清移液管，用500μlhbss中的1％hsa冲洗冷冻小瓶；将冲洗液转移到1.5ml微量离心管中。将vasa+级分沉淀物在1200×g(rcf)下在5.0℃(范围：2.0-8.0℃)下离心10分钟，其中制动器设置在高(9)。旋转完成后，将管转移到生物安全柜中。使用1000μl微量移液管，小心地取出来自1.5ml微量离心管的上清液，并转移到标有“第一vasa+上清液”的15ml锥形管中。除去任何剩余的体积而不干扰沉淀。将沉淀物轻轻地重悬浮于150μl冷的1x分离缓冲液中，并重新悬浮。将含有细胞悬浮液的1.5ml微量离心管放入台式冷却器模块(minifridgeiitm,boekelscientific,feasterville,pa)或金属热珠中。使用20ml注射器获得1x分离缓冲液的17-18ml等分试样，并将注射器连接到转移线-插管组件。将插管浸入1x隔离缓冲液中。将注射器组件装载到注射器泵(harvardapparatus，holliston，ma)上，同时将插管浸入1x隔离缓冲液中。获得第二个空的20ml注射器，并且拉取大约5ml的空气以平衡泵。使用泵，将注射器中的剩余缓冲液排出到1x隔离缓冲容器中。使用泵，将1.5ml冷的1x分离缓冲液取回到注射器中，使用以下泵参数：泵模式：取回；流量(μl/sec)：max75；程序化体积(μl)：1500；和直径/注射器尺寸：20.05mm/20cc。选择具有下表中列出的参数的泵程序：将插管置于细胞悬浮液中，使其接触管的底部。如果细胞沉降到管的底部，则根据需要用200μl移液管轻轻混合细胞悬浮液。开始泵以将细胞悬浮液取回注射器中。将插管转移到干净和冷的1.5ml微量离心管中。选择具有下表中列出的参数的第二个泵程序：一旦泵程序结束，将注射器从泵中取出并与输送管断开。将插管(仍然连接到转移管)留在冷的1.5ml微量离心管中。注射器，管道和插管被适当地丢弃。两个1.5ml微量离心管具有大致相等体积的裂解物。将两个裂解物管(“裂解物1”和“裂解液2”在800xg(rcf)下在5.0℃(范围2.0-8.0℃)下离心10分钟，制动器设置在中等(5)。使用200μl移液管，将等体积的来自“裂解物2”管的上清液转移到标记有“上清液1”和“上清液2”的管中。将两个上清液管以7000×g(rcf)在5±3℃(范围：2-8℃)离心5分钟，制动器设置在中等(5)。旋转完成后，使用1000μl移液管，将上清液从两个管中取出至标有“线粒体高速离心上清液1”。使用200μl移液管吸头除去任何残留的上清液，而不干扰沉淀物。用200μl移液管在具有100μl冷的1x分离缓冲液的上清液1管中轻轻重悬沉淀物。使用相同的移液管吸头，将悬浮液转移到上清液2管中，将上清液1管用100μl冷1x分离缓冲液冲洗5-10次，将溶液转移到上清液2管中。重新悬浮上清液2管中的沉淀，弃去空的上清液1管。将上清液2管在7000×g(rcf)下在5.0℃(范围：2.0-8.0℃)下离心30分钟，制动器设置在中等(5)。该管被重新标记为“线粒体高速离心上清液2”。如果沉淀不粘附到管的壁和/或上清液没有被除去，则进行额外的离心。如果适用，上清液2管在5.0℃(范围：2.0-8.0℃)下以700×g(rcf)离心10分钟，制动器设置在中等(5)。使用200μl移液管，将上清液轻轻取出至标有“线粒体高速离心上清液3”的管中。使用20μl微量移液管，将沉淀轻轻地重新悬浮在6μl冷的呼吸缓冲液中。将缓冲液上下吹吸5-10次以冲洗沉淀。测量微量离心管中的体积并转移到标记为“线粒体悬浮液”的冷的0.5ml冷冻小瓶中。将1μl悬浮液的体积转移到0.5ml冷冻小瓶中用于定量聚合酶链反应(qpcr)分析。qpcr分析证实了来自分离的osc的线粒体的存在。实施例2浓缩的线粒体制剂材料和设备如实施例1所述，线粒体溶液是通过从分离的osc(其也被称为卵前体细胞或雌性生殖系干细胞)提取而获得的自体线粒体制剂。将线粒体溶液保持在5℃±3℃直至进一步处理。使用本文所述方法产生的浓缩的线粒体制剂用于各种应用，包括但不限于augmentsm和ivf方法。ivf场所在ivf过程中使用特定于场所的标准ivf设备、材料和试剂。其它材料由ovascience，inc.提供，包括但不限于：用于临床加工和augmentsm加工的材料和设备是本领域已知的。具有反转的(水性)重和(有机)轻层的线粒体制剂制备装载线粒体溶液的管。在一些实施方案中，管是塑料管。使用10μl移液管，抽吸实施例1中制备的线粒体溶液并吹吸大约30次，以将溶液重新悬浮在小瓶中。使用移液管，取出2μl线粒体悬浮液，并分配到空的胞浆内精子注射(icsi)板上。将含有线粒体悬浮液的小瓶保持在5℃±3℃。如图1所示，将分配的2μl线粒体悬浮液120装载到描绘为管110的80μm柔性微量移液管(80μmcookmedical,bloomington,in)中。在一些实施方案中，柔性微量移液管的大小为50μm至140μm。在一些实施方案中，可以使用各种移液管材料，包括玻璃、半柔性管和塑料。图1中的层120是在管的近端部分中的含有线粒体悬浮液的水层。接下来，将约1cm的有机轻相引入到管110中。图1中的层130是在管的远端部分中的含有有机流体的轻相。在此实施例中，有机流体是生物相容性油，特别是icsi油。在其它实施方案中，如上所述，有机流体可以是矿物油，石蜡油，轻油，ivf培养矿物油，pvp溶液或蔗糖溶液等。如图1所示，在一些实施方案中，将填充的80μm管的轻相端热封闭，使得末端开口的管成为底部封闭的管，如封闭件140所示。根据需要将热封重复，并通过显微镜观察验证了封闭的完整性。为了确保紧密地配合到离心机中，将更大的管150(例如，600μm挠性片)在管110(例如，80μmflexipet)的热封闭端上滑动。超过管110(例如，80μmflexipet)的端部延伸的较大管150的多余长度被去除，如已被切割的管160所示。将管160滑入“冷冻保存吸管”170中，使得较大的管160接触吸管的缓冲材料180(例如，棉塞)。将包含管110中的线粒体悬浮液的整个组件的冷冻保存吸管170置于4℃的微量离心机中。底部封闭的管110的孔防止或减少水层120和有机层130的反转。在其它实施方案中，如图2所示，具有水层120和有机层130的管110被装配到紧密地配合到离心机中的适当尺寸的管210。在这些方法中使用了本领域已知的通用预防措施。这些预防措施是感染控制的方法，其中所有人类血液、某些体液以及新鲜组织和人源细胞如同它们已知感染了hiv，hbv和/或其它血源性病原体那样进行处理。线粒体离心将如图1中的管170和图2中的管210所示的线粒体制剂管在4℃下以10000×g离心20分钟，以在重相120和轻相130之间的界面处产生浓缩的线粒体层。在一些实施方案中，将管以小于10000g的速率离心。在一些实施方案中，以1000-5000g，2500-7500g，5000-10000或7500-12500g的速率离心。在一些实施方案中，离心的rcf值允许更短的离心时间，例如1-2分钟，2-4分钟，5-10分钟或10-15分钟。相反，较低的rcf值可能需要更长的离心时间。离心的速度和时间允许形成浓缩的线粒体层而不反转水层和油层。在10000g下离心20分钟后，从离心机中取出吸管，将管110滑出吸管170和切管160。将浓缩的线粒体层置于icsi板中，并用icsi油覆盖。浓缩的线粒体层维持在5℃±3℃的温度下用于augmentsm。重复这些步骤以产生额外的浓缩的线粒体层。在一些实施方案中，浓缩的线粒体制剂用于执行使用本领域已知的方法的icsi。通过在每个中期ii卵母细胞显微注射期间加入约1pl的浓缩的线粒体制剂来进行icsi。在一些实施方案中，使用在每次中期ii卵母细胞显微注射期间加入约1-3pl浓缩的线粒体的场所实践进行icsi。对于icsi，使用的浓缩线粒体制剂沉淀物的范围为10nl-500nl。在一些实施方案中，浓缩的线粒体制剂的线粒体浓度为每皮升1至10000个线粒体。在一些实施方案中，在所公开的制剂中，溶液包含每皮升1至10000个线粒体；每皮升50至10000个线粒体；每皮升100至10000个线粒体；每皮升150至10000个线粒体；每皮升200至10000个线粒体；每皮升250至10000个线粒体；每皮升300至100000线粒体；每皮升400至10000个线粒体；每皮升450至10000线粒体；每皮升500至10000个线粒体。在一些实施方案中，管110在水层和有机层之间的界面处具有小于1μm的内径。在一些实施方案中，浓缩的线粒体制剂中至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或99.5％的线粒体被回收为功能性的，如qpcr测定。如本文所讨论的，在一些实施方案中，浓缩的线粒体制剂用于各种受精方法，包括icsi和augment方法。等价物虽然已经参考本发明的优选实施方案具体示出和描述了本发明，但是本领域技术人员将会理解，在不脱离如所附权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对其形式和细节进行各种改变。本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来确定本文具体描述的本发明的具体实施方案的许多等同物。这样的等同物旨在包含在所附权利要求的范围内。当前第1页12