用于减少核酸扩增抑制的组合物的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年12月23日提交的美国临时专利申请62/096,217和2015年3月23日提交的美国临时专利申请62/136,682的优先权，这些临时申请的公开内容全文以引用方式并入本文。

背景技术：

用于检测病原体和其它微生物的常规方法是基于培养的方法，但是这些方法是耗时的、费力的，并且不再符合质量控制和诊断实验室提供快速的结果的需求。

克服培养微生物、在病原体检测中的假阳性等问题的努力已经引起了诸如基于dna的诊断方法或核酸增殖方法的基因测试的开发。使用基于dna的方法来源于每种病原体物种携带将其与其它生物体区分开的独特的dna或rna标记的前提。这些技术是最有前途的，并且越来越多地用于微菌的快速、敏感和特异性检测。

生物技术的进步已经引起各种各样的用于有效的核酸扩增的测定的开发。

含有微生物/病原体的试样的有效基因检测需要快速敏感的测定方法，其给出即时或实时的结果。分析和抑制由试样中的抑制物质引起的核酸扩增的时间和敏感性与基因测试的有用性有某些限制。

希望具有有效地且快速地减少或消除预期目标的核酸扩增的抑制的组合物和方法。

技术实现要素：

本公开提供了用于消除核酸扩增反应中的试样抑制的组合物以及使用该组合物的核酸扩增方法。

在第一方面，提供了用于消除核酸扩增反应中的试样抑制的含水组合物。组合物可以包含有机铁螯合试剂、三价铁和浓度大于或等于0.005％(质量/体积)的非离子表面活性剂。组合物可以具有约8.45至8.85的ph。有机铁螯合试剂可以具有相对于三价铁的大于或等于10^4.2的第一亲和常数以及相对于镁的小于10^3.8的第二亲和常数，其中第一亲和常数和第二亲和常数是在ph是8.45和20℃下的去离子水中确定的。

在任何上述实施方案中，有机铁螯合试剂可以包含多个羧酸根基团。在任何上述实施方案中，组合物还可包含2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸酯。在任何上述实施方案中，有机铁螯合试剂可以包括egta，其中三价铁与egta的摩尔比为约0.04至约0.28。在任何上述实施方案中，组合物还可包含聚乙烯吡咯烷酮。

在第二方面，本公开提供了核酸扩增方法，所述方法包括：a)使包含有机铁螯合试剂、三价铁、聚乙烯吡咯烷酮和非离子表面活性剂的组合物与目标试样接触以形成含水混合物，其中含水混合物的ph为约8.45至8.85，其中非离子表面活性剂以大于或等于0.005％(质量/体积)的浓度存在于组合物中；b)使步骤a)的含水混合物经历热裂解；以及c)在步骤b)之后，使含水混合物经历等温核酸扩增。有机铁螯合试剂具有相对于三价铁的大于或等于10^4.2的第一亲和常数以及相对于镁的小于10^3.8的第二亲和常数，其中第一亲和常数和第二亲和常数是在ph是8.45和20℃下的去离子水中确定的。

在一个实施方案中，本公开提供等温扩增方法，所述方法包括：a)使包含有机铁螯合试剂、三价铁、聚乙烯吡咯烷酮和非离子表面活性剂的组合物与目标试样接触以形成含水混合物，其中含水混合物的ph为约8.45至8.85，其中非离子表面活性剂以大于或等于0.005％(质量/体积)的浓度存在于组合物中；b)使步骤a)的混合物经历热裂解；以及c)在步骤b)之后，使混合物经历等温核酸扩增。有机铁螯合试剂具有相对于三价铁的大于10^4.2的第一亲和常数以及相对于镁的小于10^3.8的第二亲和常数，其中第一亲和常数和第二亲和常数是在ph是8.45和20°下的去离子水中确定的。

在第三方面，本公开提供了包含三价铁、有机铁螯合试剂和非离子表面活性剂的试剂盒。有机铁螯合试剂具有相对于三价铁的大于10^4.2的第一亲和常数以及相对于镁的小于10^3.8的第二亲和常数，其中第一亲和常数和第二亲和常数是在ph是8.45和20°下的去离子水中确定的。

在试剂盒的任何实施方案中，有机铁螯合试剂可包含多个羧酸根基团。在任何上述实施方案中，试剂盒还可包含2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸酯。在试剂盒的任何上述实施方案中，有机铁螯合试剂可以包含乙二醇四乙酸，其中三价铁与乙二醇四乙酸的摩尔比为约0.04至约0.28。在任何上述实施方案中，试剂盒还可包含选自以下的组分：聚乙烯吡咯烷酮、含氟表面活性剂、指示剂染料、防腐剂、缓冲剂和lamp-bart反应的增强剂以及它们的组合。

前面已经概述了本公开的一些相关目的。这些目的应该被解释为仅仅是对本公开的一些更突出特征和应用的说明。本公开包括从以下对实施方案的更详细描述中将描述或将变得显而易见的其它特征和优点。

本发明的上述发明内容并非旨在描述本发明的每个公开的实施方案或每种实施方式。以下描述更具体地举例说明例示性实施方案。在本申请的全文的若干处，通过实施例列表提供了指导，这些实施例可以各种组合使用。在每种情况下，所引用的列表都只用作代表性的组，并且不应理解为排它性列表。

下面将结合附图和描述介绍上述及其它实施方案的附加细节。通过具体实施方式、附图和权利要求书，其它特征、目的和优点将变得显而易见。

附图说明

在结合附图阅读时，将更好地理解上述发明内容以及以下对本公开的详细说明。为了帮助解释本公开的目的，在附图中示出了目前优选和被认为是例示性的实施方案。然而，应该理解，本公开不限于本文所示的精确布置和手段。附图中：

图1示出了柠檬酸铁铵(fac)在与含有蛋白质的试样的lamp-bart反应中的作用的图形表示。

图2示出了时间与峰值(ttp)的箱形图，其示出了fac在与含有七叶灵或6,7-二羟基香豆素的试样的lamp-bart反应中的作用。

图3示出了mcttp的箱形图，其示出了在lamp-bart反应中表面活性剂相对于fac的作用。

具体实施方式

在详细解释本公开的任何实施方案之前，应当了解，本发明在其应用中不仅限于下文说明中所提及或下文附图中所示出的构造细节和部件布置方式。本发明能够具有其它实施方案，并且能够以各种方式实践或进行。另外，应当理解，本文使用的措词和术语是用于说明目的而不应被视为限制性的。本文使用的“包括”、“包含”或“具有”及其变型形式意在涵盖其后列出的项目及其等同形式以及附加项目。应当理解，可利用其它实施方案，并且可以在不偏离本公开范围的情况下作出结构或逻辑改变。现在将在下文中更全面地描述本公开。为了下列详细说明的目的，除了有明确相反规定之外，应该理解的是本公开可假定各种替代的改变和步骤顺序。因此，在详细地描述本公开之前，应当理解，本公开并不限于具体例举说明的系统或实施方案，所述系统或实施方案当然可变化。在本说明书中的任何地方使用示例，包括本文所讨论的任何术语的示例仅是例示性的，并且绝不限制本公开或任何示例术语的范围和含义。同样，本公开不限于本说明书中给定的各种实施方案。

如本文所用，单数形式“一”和“所述”包括指代复数，除非上下文另有清晰的表示。术语“和/或”意指所列要素的一个或全部，或者所列要素中的任两个或更多个的组合。

当术语“约”用于描述值或范围的端值时，本公开应被理解为包括所提及的具体值和端值两者。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“涵盖”、“内含”、“含有”、“其特征在于”、“具有”或它们的任何其它变型旨在涵盖非排它性的包含之意。

如本文所用，短语“核酸”和“核酸序列”是可互换的，且并非旨在限制性的。“核酸”应具有本领域已知的含义，并指dna(例如基因组dna、cdna或质粒dna)、rna(例如，mrna、trna或rrna)和pna。其可以是多种形式，包括但不限于双链或单链构形、圆形形式、质粒、相对短的寡核苷酸、也称为pna的肽核酸等。核酸可以是基因组dna，其可以包括整个染色体或染色体的一部分。dna可以包括编码(例如，用于编码mrna、trna和/或rrna)和/或非编码序列(例如着丝粒、端粒、基因间区域、内含子、转座子和/或微卫星序列)。核酸可以包括任何天然存在的核苷酸以及人造或化学改性的核苷酸、突变核苷酸等。核酸可以包括非核酸组分，例如肽(如在pna中)、标记(放射性同位素或荧光标记物)等。

如本文所用，“扩增了”和“扩增”是指线性或指数增加多核苷酸序列的广泛范围的技术。示例性的扩增技术包括但不限于聚合酶链反应(pcr)或采用引物延伸步骤的任何其它方法。扩增的其它非限制性示例包括但不限于连接酶检测反应(ldr)和连接酶链反应(lcr)。扩增方法可以包括热循环或可以等温进行，诸如环介导的等温扩增(lamp-bart)。在各种实施方案中，术语“扩增产物”或“扩增的产物”包括来自任意数量的扩增反应循环的产物。

如本文所用，“聚合酶链反应”或pcr是由以下项组成的核酸的扩增：分离双链核酸试样的链的初始变性步骤，随后重复(i)允许扩增引物对目标序列侧翼位置特异性退火的退火步骤；(ii)在5'至3'方向上延伸引物从而形成与目标序列互补的扩增子多核苷酸的延伸步骤，以及(iii)引起扩增子与目标序列分离的变性步骤。上述各步骤可以在不同的温度下进行，优选地使用自动热循环仪。

如本文所用，“等温扩增的”或“等温扩增”等类似术语是指与常规pcr反应不同，与需要在高温和低温之间循环的扩增相比，而在恒定温度下进行扩增核酸的方法。这需要dna聚合酶是具有链置换活性的dna聚合酶。等温扩增通常在基本上单一温度下进行，因为引物与经置换的dna链结合。在等温扩增中，可以将包含核酸试样和任选的所有引物的反应混合物加热到变性温度，在该变性温度下，在扩增前以及任选地当dna聚合酶在变性温度下失活时加入dna聚合酶之前，反应混合物中的双链核酸变性为单链(例如，至少85℃至90℃)。

如本文所用，术语“预期目标”、“目标核酸区域”、“目标特异性核酸”、“目标区域”、“目标标记序列”、“一个或多个目标核酸”、“目标核酸序列”、“目标”或“目标多核苷酸序列”是指感兴趣的核酸。

如本文所用，“检测了”或“检测”是指目标多核苷酸序列或扩增的目标多核苷酸序列产物的试样中存在或不存在的公开或揭示。检测可以通过终点、实时、酶促，并且通过在凝胶上解析(resolving)扩增产物并确定预期的扩增产物是否存在，或本领域的技术人员已知的其它方法。

如本文所用，术语“试样”是指怀疑含有核酸的原料。检测试样中的核酸使人们能够检测微生物的存在。试样的示例包括但不限于食品试样(包括但不限于旨在用于人或动物消费的食品的试样，诸如加工食品、食品原料、农产品(例如水果和蔬菜)、豆类、肉类(来自牲畜和/或狩猎动物)、鱼、海产食品、坚果、饮料、酒水、发酵液和/或包含任意以上所列食物的选择性富集的食物基质)、水样、环境试样(例如土壤试样、污垢试样、垃圾试样、污水试样、工业废水试样、空气试样或来自各种水体诸如湖泊、河流、池塘等的水样)、空气试样(来自环境或来自室内或建筑物)、临床试样，从怀疑患有疾病或病症的人获得的试样、兽医试样、法医试样、农业试样、药物试样、生物制药试样，来自食品加工和制造表面的试样，和/或生物试样。根据本公开的非食品试样的示例可以是培养液。如本文所用的“培养液”是指用于培养微生物的液体培养基。

如本文所用，“抑制剂”意指任何化合物、物质或组合物或其组合，其作用是相对于当抑制剂不存在时测定的活性、精确度或准确性，直接或间接地降低测定的活性、精确度或准确性。抑制剂可以是分子、原子，或者分子或原子的组合，而不受限制。

根据本公开的一个方面，如本文所用的术语“抑制剂”是指例如用于扩增反应中的酶的抑制剂。此类抑制剂的示例通常包括但不限于蛋白质、肽、脂质、碳水化合物、血红素及其降解产物、尿素、胆汁酸、腐殖酸、多糖、细胞膜和胞质组分。用于pcr的人血液中的主要抑制剂是分别存在于红细胞、白细胞和血浆中的血红蛋白、乳铁蛋白和igg。抑制剂的示例还包含铁离子或其盐，其它金属盐诸如碱金属离子、过渡金属离子等，以及存在于生长培养基中的指示剂染料。

在本公开的一个实施方案中，作为指示剂染料的七叶灵可以充当抑制剂。七叶灵是从七叶树(aesculushippocastanum)(欧洲七叶树)获得的香豆素葡糖苷(6-(β-d-吡喃葡萄糖氧基)-7-羟基-2h-苯并吡喃-2-酮，cas号531-75-9)并且其特征在于其细小的蓝色荧光溶液。通常将七叶灵作为指示剂加入到细菌培养液中；例如在李斯特氏菌(listeria)培养物中。在demi-fraser(df)、uvm和fraser肉汤基础培养基(其是李斯特氏菌选择性富集肉汤基础培养基)中的七叶灵反应被突出为测定抑制的高度可能的贡献者。在该反应中，七叶灵

被特定细菌水解成6,7二羟基香豆素(秦皮乙素)和葡萄糖。秦皮乙素：

然后与铁离子络合以形成黑色络合物。秦皮乙素处于香豆素类药物中，且已知香豆素改性dna作用酶的活性。

如本文所用，“表面活性剂”的含义是由本领域的普通技术人员容易认识到的最宽泛的定义。也就是说，表面活性剂是降低液体的表面张力和/或降低两种液体之间的界面张力的润湿剂。在水中不具有正电荷或负电荷但仍溶于水的表面活性剂是“非离子表面活性剂”。

如本文所用，“非离子表面活性剂”是指其极性基团未带电荷的表面活性剂分子。两种或更多种非离子表面活性剂的组合涵盖在术语“非离子表面活性剂”内。在某些实施方案中，可以使用一种或多种表面活性剂。

如本文所用，聚乙烯吡咯烷酮(pvp)是由单体n-乙烯基吡咯烷酮制成的水溶性聚合物。聚乙烯吡咯烷酮(pvpp)是pvp的高度交联改性。如本文所述，聚乙烯吡咯烷酮或其改性物可以包括在扩增反应混合物中，以便减少或消除抑制物质。改性pvp包括但不限于为pvp的不溶性高度交联改性的聚乙烯吡咯烷酮(pvpp)。应当理解，本文涉及pvp的公开内容可以适用于pvpp。

在一个实施方案中，组合物可以包含非离子聚合物含氟化合物表面活性剂，其属于一类涂料添加剂，该涂料添加剂在用于热处理应用时提供低表面张力并且表现出良好的热稳定性。根据本公开的某些实施方案的非离子聚合物含氟化合物表面活性剂可以是作为3m^tmnovec^tm含氟表面活性剂的fc-4430。

如本文所用，术语“乙二醇四乙酸”和“egta”是指为螯合剂的乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-n,n,n',n'-四乙酸。egta是对镁具有较低亲和力的无色固体，使其对钙离子更有选择性。如在活细胞中发现的，当钙离子浓度低于镁时，egta可用于制备缓冲液以螯合钙离子。egta也可用于酶测定。

如本文所用，术语“细胞裂解”是指通过破坏细胞膜释放细胞中的材料的过程，并且具体地是从细胞提取细胞内材料以在扩增前分离dna或rna的过程，诸如pcr、lampbart方法以及同样的方法。

根据本公开的实施方案，细胞裂解可以通过热方法进行。根据细胞试样的形式和反应容器的特性，本领域的技术人员可以适当地选择热方法。

如本文所用，术语“微生物”或“微菌”是指任何微观生物体，其可以是单细胞或多细胞生物体。该术语通常用于指能够在合适的培养基中生长和繁殖的任何原核或真核微观生物体，包括但不限于细菌中的一种或多种。由本发明的范围涵盖的微生物包括原核生物，即细菌和古细菌；和各种形式的真核生物，其包括原生动物、真菌、藻类等。如本文所用，微生物的术语“培养”或“生长”是指通过使微生物体在预定培养基中在有助于其生长的条件下繁殖来使其倍增的方法。更具体地，其为提供合适的培养基和条件以有利于微生物的至少一个细胞分裂的方法。培养基可以是固体、半固体或液体培养基，其含有微生物生长所需的所有营养物质和必需的物理生长参数等，并且还包括病毒。术语“目标微生物”是指期望被检测的任何微生物。

如本文所用，术语“富集”是指通过以下方式选择性地富集特定微生物的生长的培养方法：提供具有有利于具体微生物的生长的特定的和已知属性的培养基和条件。富集培养的环境将支持所选微生物的生长，而抑制其它微生物的生长。

常规的基于dna的方法的使用在某种程度上受限于抑制剂的存在。包含对核酸增殖反应具有负面作用的所有物质的此类所谓的抑制剂的出现是基因检测的缺点中的一个。这些抑制剂可以源于试样本身，或者可以在试样处理或核酸提取期间被引入。部分或全部核酸增殖反应的抑制后果分别是灵敏度降低或假阴性结果。

尽管有许多基于基因的方法的可用性，但是不存在单一的快速、灵敏、廉价和更少费力的方法来有效和快速地减少或消除对预期目标的核酸扩增的抑制。为了迅速确定目标试样中病原体的存在，需要开发可靠和准确的测定方法，该方法可以满足越来越多的寻找更快、准确和更少耗时且更少费力的测定技术的需求。

在竞争性pcr系统中，对易于使用的挑战是包括蛋白酶步骤。该蛋白酶步骤用于通过消化食物蛋白质(尤其是红肉)以及裂解细胞来减少试样抑制。令人惊奇的是，已经发现，根据本公开的组合物和方法消除了通过使用柠檬酸铁铵中和抑制性蛋白质来对试样进行蛋白化的需要。有利地，本公开消除了分离/纯化的步骤，其使得目前的测定方法更快且更简单。

本公开描述了核酸扩增的组合物和方法，其消除了对蛋白酶的需要或以其他方式从试样中降低背景蛋白质。这继而也引起消除常规核酸扩增方法中的一个测定步骤。

本公开一般涉及试样的核酸增殖的新型组合物(例如含水组合物)和方法，试样的核酸增殖包括细胞裂解步骤和核酸扩增步骤，而不需要分离/纯化步骤，诸如在其间的色谱法、离心法以及同样的方法。

本公开的组合物通常用作包含相应化学组分的水溶液。因此，在任何实施方案中，本公开的组合物包含水。另选地，本公开的组合物可以与含水液体(例如水或含有水的试样)混合以形成根据本公开所使用的混合物。预定体积的含水组合物可以与预定量(例如体积)的试样混合以形成经过处理(例如通过加热)的混合物，以裂解试样中的任何微生物(如果存在)。所得裂解物的一部分可用于核酸扩增过程中，以检测指示初始试样中一种或多种目标微生物的存在的核酸序列。

通常，将试样(例如碎牛肉、胴体冲洗、工业用水、来自环境(例如食品加工设备)拭子或海绵的残留物)悬浮在含水液体(例如水或缓冲液)中。因此，第一预定体积的含水试样与组合物或与第二预定体积的包含本公开的组合物的水溶液混合，以形成经历裂解处理的混合物。因此，当试样与组合物混合时，本公开的组合物中的每种组分以考虑所发生的稀释的浓度存在于含水组合物中。

根据本公开，第一预定体积与通过混合第一预定体积和第二预定体积而形成的混合物的体积的比小于或等于1:10。在任何实施方案中，第一预定体积与通过混合第一预定体积和第二预定体积而形成的混合物的体积的比为约1:10至约1:300。在任何实施方案中，第一预定体积与通过混合第一预定体积和第二预定体积而形成的混合物的体积的比为约1:10、约1:20、约1:25、约1:30、约1:40、约1:50、约1:100、约1:200、约1:250，或约1:300。

因此，本公开提供了在约8.45至8.85的ph下包含有机铁螯合试剂、三价铁和非离子表面活性剂的组合物(例如含水液体组合物)。该组合物可用于核酸扩增方法以消除核酸扩增反应的试样抑制。任选地，组合物可以包含聚乙烯吡咯烷酮。

在任何实施方案中，组合物的合适ph为至少8.45。在任何实施方案中，ph可以在8.45至8.85的范围内。在某些实施方案中，可以使用8.65至8.75的ph。在其它实施方案中，可以使用8.75至8.85的ph。

有机铁螯合试剂对于三价铁(fe⁺³)的铁离子具有预定义的亲和常数。在ph8.45和20℃下的去离子水中，有机铁螯合试剂的亲和常数相对于三价铁离子大于或等于10^4.2。有机铁螯合试剂对于镁(mg⁺²)离子还具有预定义的亲和常数。在ph8.45和20℃下的去离子水中，有机铁螯合试剂的亲和常数相对于镁离子小于10^3.8。因此，在本公开的含水组合物中，在ph8.45下，有机铁螯合试剂对于三价铁离子比对于镁离子具有高的亲和力。

合适的有机铁螯合试剂包含有机分子。在任何实施方案中，有机铁螯合试剂是水溶性的。在任何实施方案中，有机铁螯合试剂包含多个羧酸根基团。合适的有机铁螯合试剂的非限制性示例包括乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-n,n,n',n'-四乙酸(egta)；n,n,n',n'-四(2-吡啶基甲基)乙烷-1,2-二胺(tpen)；1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-n,n,n',n'-四乙酸(bapta)；n-(2-羟乙基)乙二胺-n,n′,n′-三乙酸(hedta)；以及它们的盐。

在任何实施方案中，组合物还包含三价铁。因此，本公开的含水组合物可以包含三价铁离子。在任何实施方案中，可以通过柠檬酸铁铵在组合物中提供三价铁。

在任何实施方案中，三核铁可以以约55μm至385μm的铁离子浓度(即溶解的三价铁)存在于根据本公开的含水液体组合物中。在某些实施方案中，铁离子的浓度可以为至少110μm，在某些其它实施方案中，其可以是至少165μm。在其它实施方案中，铁离子的浓度可以为至少220μm，并且在其它实施方案中，其可以为至少275μm或至少330μm。根据本公开，在其中有机铁螯合试剂包括egta的水溶液中，组合物的溶解的三价铁/egta的摩尔比为约0.04至约0.28。在某些优选实施方案中，含水组合物的溶解的三价铁/egta的摩尔比为约0.14至约0.18。

在根据本公开的液体(例如，含水液体)组合物的任何实施方案中，存在三价铁(被提供为柠檬酸铁铵)，以产生(当组合物与试样混合时)约50μm至350μm的铁离子浓度。在某些实施方案中，铁离子的浓度可以为至少100μm，在某些其它实施方案中，其可以是至少150μm。在其它实施方案中，铁离子的浓度可以为至少200μm，并且在其它实施方案中，其可以为至少250μm或至少300μm。根据本公开，在其中有机铁螯合试剂包括egta的水溶液中，组合物的fe³⁺/egta的摩尔比为约0.04至约0.28。在某些优选的实施方案中，组合物的fe³⁺/egta的摩尔比为约0.14至约0.18。

在一个实施方案中，本公开的组合物包含至少一种非离子表面活性剂。因此，组合物可以包含任何非离子表面活性剂中的一种或多种。优选地，非离子表面活性剂的亲水-亲脂平衡值是约11至约16。具有亲水-亲脂平衡的表面活性剂在该范围内准许dna聚合酶在pcr和lamp核酸扩增反应中的足够活性，以及准许在bart报告技术中的足够的荧光素酶和atp硫酸化酶活性。合适的非离子表面活性剂的示例包括但不限于triton^tm系列洗涤剂，包括但不必限于例如tritonx-100(叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)及其衍生物、tritonx-114、tritonx-405、tritonx-101、tritonn-42、tritonn-57、tritonn-60、tritonx-15、tritonx-35、tritonx-45、tritonx-102、tritonx-155、tritonx-165、tritonx-207、tritonx-305、tritonx-705-70和tritonb-1956；脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯(poe)脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如吐温)、poe烷基醚(例如brij)、壬基酚、月桂醇、聚乙二醇、聚氧乙烯·聚氧丙烯嵌段聚合物、poe烷基胺和poe脂肪酸双苯醚和含氟表面活性剂，诸如3mnovec^tm工程液体表面活性剂fc-4430和fc4432，以及陶氏化学品公司(dowchemical)的fs系列含氟表面活性剂。

在根据本公开的液体(例如，含水液体)组合物的任何实施方案中，组合物中此类表面活性剂的浓度没有具体限制，只要可以实现本发明的有益效果(即相对于促进核酸扩增)即可。在任何实施方案中，本公开的组合物包含约0.005％(w/v)至约0.3％(w/v)的表面活性剂。因此，在任何实施方案中，本公开的组合物包含至多约0.3％(w/v)的表面活性剂。在某些实施方案中，表面活性剂的浓度可以为至少0.01％(w/v)，并且在某些其它实施方案中其可以为至少0.025％(w/v)，且在另一个实施方案中为0.032％(w/v)。

任选地，在本公开的任何实施方案中，可以使用标称分子量为30kda至1.3mda的聚乙烯吡咯烷酮(pvp)。在本公开的一个方面，pvp的标称分子量为360kda。

在本公开的一个实施方案中，当使用少量的表面活性剂时，聚乙烯吡咯烷酮可以包含在组合物中。在根据本公开的液体(例如，含水液体)组合物的一个实施方案中，组合物(添加试样之前)可以包含0％w/v至多约0.0473％w/v的pvp。当非离子表面活性剂以0.0055％w/v至0.011％w/v的浓度存在于组合物中时，组合物可以包含约0.011％w/v至约0.0473％w/v的pvp。上述浓度中的每个也应用于改性pvp。

在本公开的任何实施方案中，当使用少量的表面活性剂时，聚乙烯吡咯烷酮可以包含在组合物中。在根据本公开的液体(例如，含水液体)组合物的实施方案中，组合物(添加试样后)可以包含0％w/v至多约0.043％w/v的pvp。当非离子表面活性剂以0.005％至0.01％w/v的浓度存在于组合物中时，组合物可以包含约0.01％w/v至约0.043％w/v的pvp。上述浓度中的每个也应用于改性pvp。

在本公开的某些实施方案中(例如，当非离子表面活性剂浓度>0.01％w/v时)，聚乙烯吡咯烷酮可不包含在组合物中。

在本公开的任何实施方案中，有机铁螯合试剂包括egta。在任何实施方案中，有机铁螯合试剂可以以盐的形式提供给组合物。在某些实施方案中，组合物可以包含例如egta的钠盐。在本公开的另一个实施方案中，组合物可以包含例如egta的钾盐。

根据本公开的组合物可以包含fe³⁺(例如，经由柠檬酸铁铵提供)和乙二醇四乙酸(例如经由乙二醇四乙酸的盐(例如单价阳离子盐)提供)。因此，在组合物中，可以存在乙二醇四乙酸和fe³⁺的摩尔比。在任何实施方案中，乙二醇四乙酸与fe³⁺的摩尔比为约0.04至约0.28。

在根据本公开的液体(例如，含水液体)组合物的任何实施方案中，egta可以以0.5mm至5mm的浓度存在。在任何实施方案中，金属离子与egta的摩尔比至少为0.6。

根据本公开的一个实施方案，试样可以被直接测试，或者可以在测试之前以某种方式制备或处理。例如，可以处理试样以富集任何污染微菌，并且可以进一步处理以分离和/或裂解其中所含的微生物细胞/病毒细胞/真菌细胞。可以另外处理来自试样的裂解的微生物细胞，或准备从微菌中分离和/或提取基因物质用于分析以检测和/或鉴定污染微菌。一些实施方案是指“试样中的核酸”或“试样衍生的核酸”，并且是指包含在试样中或从试样获得的核酸。可以通过本文所述的方法以及使用组合物来测试此类核酸。

在本公开的某些实施方案中，可以将试样进行分离，以最初将感兴趣的微菌与其它微菌和其它试样组分分开。例如，对于具有络合组分的络合食品试样，分离方法可用于将微生物与食物分离。在分析前与试样分离的微菌也可富集。试样的分析可以包括一种或多种分子方法。例如，根据本公开的一些示例性实施方案，可以使用适合的寡核苷酸引物对试样进行核酸扩增(例如通过lamp-bart)，该寡核苷酸引物对于试样被怀疑污染的一个或多个微菌核酸序列是特异性的。然后可以将扩增产物进一步用特异性探针(或报告探针)进行测试，以允许检测已经从试样中扩增的微生物核酸序列。在一些实施方案中，如果从试样中扩增微生物核酸序列，则可以对扩增产物执行进一步分析，以进一步鉴定、定量和分析所检测的微菌(确定参数，诸如但不限于微生物菌株、病原性、数量等)。

本公开通常提供核酸扩增方法，所述方法包括a)使根据本公开的任何组合物(例如，含水组合物)与目标试样接触以形成含水混合物，其中混合物的ph为约8.45至8.85；b)使步骤a)的含水混合物经历热裂解；以及c)在步骤b)之后，使一部分含水混合物经历等温核酸扩增。

在本公开的任何实施方案中，核酸扩增方法包括a)使根据本公开的任何组合物(例如，含水组合物)与目标试样接触以形成含水混合物，其中含水混合物的ph为约8.45至8.85；b)使步骤a)的含水混合物经历热裂解；以及c)在步骤b)之后，使含水混合物经历等温核酸扩增，其中所述方法消除了由试样中存在的干扰组分引起的核酸扩增的抑制。

本公开通常提供核酸扩增方法，所述方法包括a)使根据本公开的任何组合物(例如，含水组合物)与试样接触以形成含水混合物，其中含水混合物的ph为约8.45至8.85；b)使步骤a)的含水混合物经历热裂解；以及c)在步骤b)之后，使一部分含水混合物经历等温核酸扩增。

根据本公开的方法中所使用的扩增方法可以等温进行。等温技术包括但不限于环介导的等温扩增(lamp)、链置换扩增(sda)，基于核酸序列的扩增(nasba)。使用链置换反应在恒定温度下进行反应。通过在恒温下培育试样、引物、具有链置换活性的dna聚合酶以及底物的混合物，可以在单个步骤中完成扩增。除了增加目标核酸序列的拷贝数的步骤或反应之外，扩增方法还可包括检测扩增的目标核酸序列的步骤或反应。此类检测步骤或反应是本领域的普通技术人员所熟知的，并且包括例如生物发光实时报告(bart)步骤或反应。

在本公开的一个实施方案中，等温扩增反应是环介导的等温扩增(lamp-bart)方法。lamp可以在等温条件下以高特异性、高效率和快速性扩增dna。lamp方法需要bstdna聚合酶和一组四至六个特异性设计的引物，其识别总共六个不同序列的目标dna并具有链置换活性。在环介导的等温扩增(lamp)中，通过使用具体设计用于分别识别目标基因上6至8个不同区域的4至6种不同引物来实现目标特异性扩增。此类方法通常在15分钟至60分钟内扩增核酸拷贝10⁹至10¹⁰次。此外，扩增反应中例如atp-硫酸化酶、腺苷-5'-o-过硫酸盐、虫荧光素和荧光素酶的存在准许经由生物发光(即bart反应)检测lamp介导的扩增反应。

除了引物之外，lamp-bart技术还使用tris、硫酸盐化合物(诸如mgso4、nh4so4)和氯化钾来保持酶功能性。因此，此类化合物充当促进lamp-bart偶联反应的增强剂。tris是有机化合物(更形式地称为三(羟甲基)氨基甲烷，具有式(hoch2)3cnh2)。链置换技术，诸如lamp，使用tris作为缓冲液，保持反应在最佳ph下。

本发明的组合物(例如含水组合物)任选地可以包含指示剂染料以监控包含组合物的水溶液的近似温度。有利地，指示剂染料可以提供第一视觉指示(例如，第一可观察到的颜色)，以指示包含组合物的含水混合物已达到大约在适于与组合物接触的微生物细胞的热裂解的范围内的温度(例如约100℃)。此外，指示剂染料可以提供第二视觉指示(例如，第二种颜色)，以指示包含组合物的含水混合物已经冷却到适合于去除一部分混合物并将其置于核酸扩增反应中的温度(例如，≤℃)。当在加热和冷却步骤期间含水混合物的ph改变时，可以容易地监测某些ph指示剂(例如，具有至少部分在约8.8至约7.2的ph范围内延伸的过渡范围的那些)。

合适的可见染料包括例如甲酚红，当ph高于8.8时，其为红紫色，且当ph小于7.2时为黄色。

在本公开的任何实施方案中，指示剂染料可以是甲酚红。

使用lamp，使用两对或三对引物以及除了复制活性之外具有高链置换活性的聚合酶，在60℃至65℃的恒温下扩增目标核酸序列。环介导的等温扩增(lamp)反应是高度特异性、敏感的等温核酸扩增反应。lamp采用被称为正向内引物(fip)、反向内引物(bip)、正向置换引物(f3)和反向置换引物(b3)的四个必需引物的引物组。这四种不同的引物用于鉴定目标基因上的6个不同区域，这高度增加特异性。由于这些引物的作用的具体性质，lamp中所产生的dna的量显着高于基于pcr的扩增。此外，可以包括有效加速反应的两种任选的引物；这些称为正向环引物(lf)和反向环引物(lb)。内引物(fip和bip)含有目标dna的有意链和反意义链的序列，而置换引物(f3和b3)和环引物(lf和lb)各含有单个目标序列。当反应中包含环引物(lf和lb)时，总共识别出八个目标序列。dna聚合酶用于扩增感兴趣的目标序列。可以使用许多不同的dna聚合酶，包括非天然存在的工程化dna聚合酶，最常见的是bstdna聚合酶，而常常较少使用土芽孢杆菌大片段(gspssd)dna聚合酶。

lamp反应通过由内引物(fip和bip)所引发的dna合成发起。之后进行通过释放单链dna的置换引物(f3或b3)所引发的dna合成。该单链dna用作dna合成的模板，dna合成由与目标的另一端杂交的第二内引物和置换引物引发。这产生了茎环dna结构。在随后的lamp循环中，一个内引物与产物上的环杂交，并发起置换dna合成。这产生了初始茎环dna以及具有两倍长的茎的新的茎环dna。循环反应在不到一小时内继续积聚约10⁹份拷贝。除了通过内引物杂交以及引发链置换dna合成的环之外，包含一个或两个环引物(lf和/或lb)通过与茎环杂交来加速lamp反应。存在各种lamp扩增检测方法。非特异性目标检测可以通过视觉鉴定浑浊试样获得，因为焦磷酸镁在阳性lamp反应中沉淀。为了阳性反应的更好的可视性，可以向反应中加入各种试剂，诸如羟基萘酚蓝或钙黄绿素。另选地，可以使用dna嵌入染料诸如甲酚红、sybr绿、picogreen或碘化丙啶来实现荧光检测，将dna嵌入染料加入到反应试剂中或在用于终点分析的反应完成后加入。

在一个实施方案中，本公开提供了方法，其包括使悬浮在根据本公开的组合物中的试样与用于目标核酸物质的等温核酸扩增反应的组分接触，从而提供扩增反应混合物；在足以进行等温核酸扩增反应的条件下温育扩增反应混合物，从而提供产物；以及确定产物中是否存在目标核酸物种的指示剂。

在另一个实施方案中，本公开的特征在于方法，其包括执行扩增反应混合物的等温反应以提供产物，包含裂解物的混合物包含与根据本公开的组合物混合的试样以及用于目标核酸物质的核酸扩增反应的组分；以及确定产物中是否存在目标核酸物种的指示剂。

等温扩增反应的组分可以以溶液和/或干燥(例如冻干)的形式提供。当以干燥形式提供一种或多种组分时，还可以使用再悬浮或重构缓冲液。另选地，在形成包含试样和本公开的组合物的含水混合物之后，且在使含水混合物经历热裂解过程之后，可以使用含水混合物来重构等温反应的组分。

基于具体类型的扩增反应，反应混合物可以含有缓冲液、盐、核苷酸以及对于进行反应所需的其它组分。反应混合物可以在适于反应的特定温度下温育。

目标核酸可以是存在于动物(例如人)、植物、真菌(例如酵母)、原生动物、细菌或病毒物种中的核酸。例如，目标核酸可以存在于感兴趣的生物体的基因组中(例如染色体上)或染色体外的核酸上。在一些实施方案中，目标核酸是rna，例如mrna。在具体实施方案中，目标核酸对于所感兴趣的生物体是特异性的，即目标核酸在其它生物体中不存在，或者在与感兴趣的生物体类似的生物体中不存在。

本公开在各种领域中具有需要检测试样中的微生物的方法的多种应用，其中组合物可以用作在热裂解步骤期间将试样容纳在其中的悬浮培养基，并且组合物可用作含水培养基，其中将lamp-bart核酸扩增试剂的冻干球粒溶解并使其反应。

本公开毫不费力地允许使用者在ph约为8.4至8.85下仅使试样与包含有机铁螯合试剂、三价铁和非离子表面活性剂、egta(或其一价盐)以及任选的聚乙烯吡咯烷酮的组合物接触，以形成含水混合物；随后使含水混合物经历裂解过程(例如，热裂解过程)；并且在冷却含水混合物之后，使含水混合物经历用于检测微生物的等温核酸扩增反应。

在另一个实施方案中，本公开提供了试剂盒。一般来讲，试剂盒包含根据本公开的有机铁螯合试剂、三价铁、非离子表面活性剂以及任选的聚乙烯吡咯烷酮。

在一个实施方案中，试剂盒包含有机铁螯合试剂、三价铁和非离子表面活性剂。有机铁螯合试剂具有相对于三价铁的大于或等于10^4.2的第一亲和常数以及相对于镁的小于10^3.8的第二亲和常数，其中第一亲和常数和第二亲和常数是在ph是8.45和20°下的去离子水中确定的。

在试剂盒的任何实施方案中，有机铁螯合试剂可包含多个羧酸根基团。在任何上述实施方案中，试剂盒还可包含2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸酯(柠檬酸)。在试剂盒的任何上述实施方案中，有机铁螯合试剂可以包括egta，其中三价铁与egta的摩尔比为约0.04至约0.28。

在另一个实施方案中，试剂盒还可包含选自以下的组分：含氟表面活性剂、指示剂染料、防腐剂、缓冲剂和lamp-bart反应的增强剂以及它们的组合。在试剂盒的任何实施方案中，任意一种或多种前述组分可以存在于组合物中的试剂盒中。试剂盒可以包含用于目标核酸的扩增的至少一种引物，诸如两种引物。试剂盒还可以包含用于目标核酸的扩增的至少一种其它引物，其可以但不一定是作为用于试剂盒中一种或多种其它引物的目标的相同核酸(以及甚至相同核酸内的相同序列)。在一些实施方案中，试剂盒包含用于扩增一种或多种独特基因组序列的两种或更多种引物。

在另一个实施方案中，试剂盒在单个包装中或在同一试剂盒内的多于一个包装中包含组分(即组合物、其组分、含氟表面活性剂、指示剂染料、防腐剂、缓冲剂和/或lamp-bart反应的增强剂)。在试剂盒内包括多于一个包装的情况下，每个包装可以独立地含有单个组分或以任何合适的组合多个组分。如本文所用，单个试剂盒中的两个或更多个包装或容器的组合被称为“包装组合”。

在试剂盒的任何实施方案中，任意一种或多种有机铁螯合试剂、三价铁、聚乙烯吡咯烷酮、非离子表面活性剂、含氟表面活性剂、指示剂染料、防腐剂、缓冲剂或增强剂设置在水溶液中。在任何实施方案中，水溶液的ph可以为约8.45至8.85。

试剂盒和试剂盒内的容器可以用任何已知的材料制成。例如，试剂盒本身可以由塑性材料或硬纸板制成。容纳组分的容器可以是例如塑性材料或玻璃。一个试剂盒内的不同容器可以由不同的材料制成。在实施方案中，试剂盒可在其内含有另一试剂盒。

本公开的试剂盒可以包含一种或多种可用于扩增目标序列的组分。在实施方案中，试剂盒中包括对于执行lamp-bart方法所需的一些或所有试剂和用品。试剂的非限制性示例是缓冲液(例如，含有tris、hepes等的缓冲液)、盐以及模板依赖性核酸延伸酶(诸如耐热酶，诸如taq聚合酶)、适用于酶的活性的缓冲液以及由酶所需的附加试剂，诸如dntp、dutp和/或udg酶。在实施方案中，试剂盒包含增强剂，诸如氯化钾和硫酸铵，以促进酶促反应。用品非限制性示例是反应容器(例如，微量离心管)。

试剂盒具有高灵敏度、高特异性、易于操作、通过肉眼判断结果的能力等优点。

示例性实施方案

实施方案a是组合物，所述组合物包含：

有机铁螯合试剂；

三价铁；

非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂浓度大于或等于0.005％(质量/体积)；并且

其中组合物的ph为约8.45至8.85；

其中有机铁螯合试剂具有相对于三价铁的大于10^4.2的第一亲和常数以及相对于镁的小于10^3.8的第二亲和常数，其中第一亲和常数和第二亲和常数是在ph是8.45和20℃下的去离子水中确定的。

实施方案b是根据实施方案a所述的组合物，所述组合物还包含水，其中非离子表面活性剂以大于或等于0.005％(质量/体积)的浓度存在于组合物中。

实施方案c是根据实施方案a或实施方案b所述的组合物，其中有机铁螯合试剂包含多个羧酸根基团。

实施方案d是根据前述实施方案中的任一项所述的组合物，其中有机铁螯合试剂是水溶性的。

实施方案e是根据实施方案d所述的组合物，其中有机铁螯合试剂选自：egta；n,n,n',n'-四(2-吡啶基甲基)乙烷-1,2-二胺；1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-n,n,n',n'-四乙酸；n-(2-羟乙基)-乙二胺-n,n′,n′-三乙酸；以及它们的盐。

实施方案f是根据实施方案e所述的组合物，其中有机铁螯合试剂包括egta，其中三价铁与egta的摩尔比为约0.04至约0.28。

实施方案g是根据实施方案f所述的组合物，其中egta以0.5mm至5mm的浓度存在。

实施方案h是根据实施方案f或实施方案g所述的组合物，其中egta作为钠盐或钾盐存在于组合物中。

实施方案i是根据前述实施方案中的任一项所述的组合物，所述组合物还包含2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸酯，其中有机铁螯合试剂和2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸酯是不同的分子。

实施方案j是根据前述实施方案中的任一项所述的组合物，其中非离子表面活性剂的亲水-亲脂平衡值是约11至约16。

实施方案k是根据前述实施方案中的任一项所述的组合物，其中非离子表面活性剂选自：叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚、壬基酚、月桂醇、聚乙二醇、聚氧乙烯·聚氧丙烯嵌段聚合物、聚氧乙烯烷基胺和聚氧乙烯脂肪酸双苯基醚，以及上述非离子表面活性剂中的任两种或更多种的组合。

实施方案l是根据前述实施方案中的任一项所述的组合物，其中非离子表面活性剂以至多约0.3％质量/体积的浓度存在。

实施方案m是根据实施方案b至l中的任一项所述的组合物，其中三价铁以50μm至300μm的浓度溶解在含水组合物中。

实施方案n是根据前述实施方案中的任一项所述的组合物，所述组合物还包含聚乙烯吡咯烷酮。

实施方案o是根据实施方案n所述的组合物，聚乙烯吡咯烷酮以至多0.043％w/v的浓度存在。

实施方案p是根据前述实施方案中的任一项所述的组合物，其中该组合物还包含含氟表面活性剂。

实施方案q是根据p的实施方案所述的组合物，其中含氟表面活性剂是fc-4430^tm。

实施方案r是根据前述实施方案中的任一项所述的组合物，其中组合物还包含指示剂染料。

实施方案s是根据r的实施方案所述的组合物，其中指示剂染料是甲酚红。

实施方案t是根据前述实施方案中的任一项所述的组合物，其中组合物还包含防腐剂。

实施方案u是根据t的实施方案所述的组合物，其中防腐剂是甲基异噻唑啉酮。

实施方案v是根据前述实施方案中的任一项所述的组合物，其用于检测试样中的微生物。

实施方案w是根据前述实施方案中的任一项所述的组合物，其中试样是食品试样、临床试样或培养液。

实施方案x是根据w的实施方案所述的组合物，其中食物试样包含蛋白质。

实施方案y是根据实施方案x所述的组合物，其中蛋白质是铁蛋白。

实施方案z是根据前述实施方案中的任一项所述的组合物，其中试样包括培养液。

实施方案aa是根据实施方案z所述的组合物，其中试样包含七叶灵。

实施方案ab是等温核酸扩增方法，所述方法包括

a)使实施方案b至aa中的任一项所述的组合物与目标试样接触以形成含水混合物；

b)使步骤a)的含水混合物经历热裂解过程；以及

c)在步骤b)之后，使含水混合物经历等温核酸扩增过程。

实施方案ac是根据实施方案ab所述的方法，用于消除由存在于试样中的干扰组分引起的核酸扩增的抑制。

实施方案ad是根据实施方案ab或实施方案ac所述的方法，其中等温核酸扩增方法是环介导的等温扩增(lamp)方法。

实施方案ae是根据实施方案ab至ad中的任一项所述的方法，其中试样是食物试样、临床试样或培养液。

实施方案af是根据实施方案ae所述的方法，其中食物试样包含蛋白质。

实施方案ag是根据实施方案af所述的方法，其中蛋白质是铁蛋白。

实施方案ah是根据实施方案ab至ag中的任一项所述的方法，其中试样是培养液。

实施方案ai是根据实施方案ah所述的方法，其中试样包含七叶灵。

实施方案aj是根据实施方案ab至ai中的任一项所述的方法，其中在步骤a)之前，将试样在约41.5℃下的培养液中温育。

实施方案ak是根据实施方案ab至aj中的任一项所述的方法，其中组合物还包含缓冲剂和促进lamp-bart反应的增强剂。

实施方案al是根据实施方案ak所述的方法，其中增强剂选自：氯化钾、硫酸铵、七水合硫酸镁以及它们的组合。

实施方案am是根据实施方案ak或实施方案al所述的方法，其中缓冲剂包含tris碱。

实施方案an是根据实施方案ab至am中的任一项所述的方法，其中使含水混合物经历热裂解过程包括将含水混合物加热至约100℃保持约15分钟，且随后将混合物冷却至约40℃保持约5分钟。

实施方案ao是根据实施方案an所述的方法，其中在将混合物冷却至约40℃之后，该方法还包括使混合物与用于lamp-bart等温扩增的试剂接触。

实施方案ap是试剂盒，其包含：

三价铁；

有机铁螯合试剂；以及

非离子表面活性剂；

其中有机铁螯合试剂具有相对于三价铁的大于或等于10^4.2的第一亲和常数以及相对于镁的小于10^3.8的第二亲和常数，其中第一亲和常数和第二亲和常数是在ph是8.45和20℃下的去离子水中确定的。

实施方案aq是根据实施方案ap所述的试剂盒，其中有机铁螯合试剂包含多个羧酸根基团。

实施方案ar是根据实施方案ap所述的试剂盒，其中有机铁螯合试剂选自：乙二醇四乙酸；n,n,n',n'-四(2-吡啶基甲基)乙烷-1,2-二胺；1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-n,n,n',n'-四乙酸；n-(2-羟乙基)乙二胺-n,n′,n′-三乙酸；以及它们的盐。

实施方案as是根据实施方案ap至ar中的任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含聚乙烯吡咯烷酮。

实施方案at是根据实施方案ap至as中的任一项所述的试剂盒，其中非离子表面活性剂选自：叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚、壬基酚、月桂醇、聚乙二醇、聚氧乙烯·聚氧丙烯嵌段聚合物、聚氧乙烯烷基胺、聚氧乙烯脂肪酸双苯基醚，以及上述非离子表面活性剂中的任两种或更多种的组合。

实施方案au是根据实施方案ap至at中的任一项所述的试剂盒，其中有机铁螯合试剂包括egta、bapta、hedta、tpen或任何前述有机铁螯合试剂的一价阳离子盐。

实施方案av是根据实施方案au所述的试剂盒，其中该一价阳离子盐选自钠盐和钾盐。

实施方案aw是根据实施方案ap至av中的任一项所述的试剂盒，其中试剂盒还包含含氟表面活性剂。

实施方案ax是根据实施方案aw所述的试剂盒，其中含氟表面活性剂是fc-4430^tm。

实施方案ay是根据实施方案ap至ax中的任一项所述的试剂盒，其中试剂盒还包含指示剂染料。

实施方案az是根据实施方案ay所述的试剂盒，其中指示剂染料是甲酚红。

实施方案ba是根据实施方案ap至az中的任一项所述的试剂盒，其中试剂盒还包含防腐剂。

实施方案bb是根据实施方案ba所述的试剂盒，其中防腐剂是甲基异噻唑啉酮。

实施方案bc是根据实施方案ap至bb中的任一项所述的试剂盒，其中试剂盒还包含缓冲剂。

实施方案bd是根据实施方案ap至bc中的任一项所述的试剂盒，其中试剂盒还包含缓冲剂和促进lamp-bart反应的增强剂。

实施方案be是根据实施方案bd所述的试剂盒，其中增强剂选自：氯化钾、硫酸铵、七水合硫酸镁以及它们的组合。

实施方案bf是根据实施方案be所述的试剂盒，其中缓冲剂包含tris碱。

实施方案bg是根据实施方案ap至bf中的任一项所述的试剂盒，其中有机铁螯合试剂、三价铁、聚乙烯吡咯烷酮和非离子表面活性剂中的至少一种设置在含水培养基中。

实施方案bh是根据实施方案bg所述的试剂盒，其中含水培养基的ph为约8.45至8.85。

实施方案bi是根据实施方案ap至bh中的任一项所述的试剂盒，其中试剂盒包含使用说明书。

实施例

通过以下实施例进一步说明本发明的目的和优点，但是在这些实施例中所述的具体材料和其量以及其它条件和细节不应被理解为不适当地限制本发明。除非另外指明，否则所有的份数和百分比以重量计，所有的水为蒸馏水并且所有的分子量为重均分子量。

实施例1-包含三价铁和有机铁螯合试剂的组合物在与含有蛋白质的试样的lamp-bart反应中的作用。

试样：生肉

在nasco过滤袋中将25g80％的瘦碎牛肉试样加入到225ml的室温demi-fraser(3m公司)中，并将混合物均质化2分钟。将容纳该均质化混合物的袋子放入37℃的培养箱中并温育24小时以进行富集。将20μl等分试样的富集试样一式三份加入到580μl分别含有150μm、100μm、50μm或0μm柠檬酸铁铵的裂解溶液的四种不同制剂中。除了柠檬酸铁铵之外，四种裂解溶液中的每种都含有如下表1给定的试剂。

表1：裂解溶液的基础制剂。如实施例1所述，向该基础制剂中加入各种浓度的柠檬酸铁铵。

将裂解溶液管在100℃的3m加热块上加热15分钟，冷却至约40℃，并将20μl等分试样加入到通用基质对照lmap-bart球粒(部件号mdmc96na，可得自明尼苏达州圣保罗的3m公司(3mcompany,st.paul,mn))。将球粒置于mds仪器(部件号mds100；可得自明尼苏达州圣保罗的3m公司(3mcompany,st.paul,mn))中，并记录生物发光(即bart反应)75分钟。

图1展示了在增加fe⁺³浓度引起更快反应时间的情况下剂量依赖性反应中的抑制缓解。它示出了不同浓度的fe⁺³对bart光发射的作用。光强度依据直接与核酸扩增成比例的相对光单位(rlu)来测量。图1显示150μm浓度下的fe⁺³引起最高的rlu峰值；100μm和50μm浓度下的fe⁺³引起较小的峰值；且在不存在fe⁺³(0μm)的情况下，rlu最小。还注意到，较高的fe⁺³浓度，反应时间快得多，且在不存在fe⁺³(0μm)的情况下最慢。

这表明本公开的组合物引起由生肉试样中存在的蛋白质所引起的核酸扩增抑制中的减少/消除的事实。

实施例2-包含三价铁和有机铁螯合试剂的组合物在含有七叶灵或七叶亭的试样的lamp-bart反应中的作用。

在如下四种不同的培养基中连续稀释(至10^-6)在demi-fraser(3m公司)中的李斯特氏菌(listeria)物种(lm7244)的过夜培养物：

1.demi-fraser(df)-没有fac

2.demi-fraser+fac(100μl/10ml)

3.demi-fraser+6,7二羟基香豆素[秦皮乙素](0.52g/l)

4.demi-fraser+6,7二羟基香豆素[秦皮乙素](0.52g/l)+fac(100μl/10ml)

然后将每种上述培养基在37℃下温育6小时。将每个试样20μl加入到如以上表1中所述的580μl裂解制剂中，在加热块上煮沸15分钟，并将20μl等分试样加入3m^tm分子检测系统(mds)1.0l的单核细胞增多性李斯特菌球粒(部件号mdalm96na；可得自明尼苏达州圣保罗的3m公司(3mcompany,st.paul,mn))。

图2是相对于如上测试的4种培养基，lamp-bart反应中“时间与峰值”(ttp)的曲线图。“ttp”是指使用3m分子检测系统到阳性结果的时间量(分钟)。词语“香豆素”，如图2所示，是指6,7-二羟基香豆素，其是七叶灵的酶促水解的产物。

这表明本公开的组合物引起由七叶灵或七叶灵的降解产物引起的核酸扩增抑制中的减少/消除的事实。

实施例3：在lamp-bart反应中，表面活性剂相对于包含三价铁和有机铁螯合试剂的组合物的作用。

在博尔顿肉汤以及5％的裂解马血中的25g鸡肉部分和鸡肉的试样在41.5℃下温育24小时：

1)将20μl等分试样的肉汤培养物一式三份加入到含有580μl裂解溶液的分离管中

2)将管置于加热块中15分钟

3)之后，将管架置于室温冷却块上5分钟

4)最后，使用20μl的裂解物重构mds基质对照球粒，并进行等温扩增反应。

裂解溶液与表1中所述相同，不同的是triton-x-100的量是变化的，且另外存在七水合硫酸镁(73.8mg/l)。表面活性剂和fac根据表2中列出的浓度而变化。

表2.

图3是表2中描述的数据的箱形图，其示出了控制表面活性剂水平低于给定表面活性剂(tritonx-100cmc＝190ppm)的临界胶束浓度(cmc)增加了铁离子的抗抑制作用，并引起性能提高(即到阳性结果的时间更快)。不受理论的约束，研究了作用可以是由于生肉试样中蛋白质增溶减少。有效表面活性剂浓度的下限约为20ppm。表面活性剂浓度<20ppm时，等温扩增反应被抑制，这可以是由于扩增/检测分析酶粘在管壁上。除了裂解缓冲液中的柠檬酸铁铵之外，当表面活性剂水平保持在表面活性剂的cmc以下时，存在有益效果。

本公开一般来讲适用于研究和诊断。也就是说，本公开的组合物、方法和试剂盒可以用于鉴定各种核酸或表达的基因的目的，或者用于其它研究目的。同样，组合物、方法和试剂盒可用于诊断许多人类和动物的疾病或病症。此外，它们可用于鉴定患病的或以其他方式污染的食物产品(例如，感染了一种或多种病原生物体/微生物的食物)，或者试样中毒性物质或毒素生产生物体的存在。因此，组合物和方法具有人体健康和兽医应用，以及食品测试和国土安全应用。

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