本发明属于核酸分析与检测领域，具体涉及一种核酸扩增产物的可视化检测方法。
背景技术：
核酸扩增技术在当今的分析检测领域具有十分重要的意义。食品安全检测、环境监控、医疗诊断、法医鉴定等领域无不依赖于核酸扩增技术。最早也是最经典的核酸扩增技术是在耐热性聚合酶的作用下，依靠温度的不断循环交替而实现模板变性、引物退火及延伸从而实现目标产物的大量积累，这种技术被称作聚合酶链式反应(pcr)。然而，pcr最大的缺陷也就在于，其不断的温度变化过程对仪器(pcr仪)提出了相对高的要求，并进而限制了其扩增速率。恒温扩增的出现彻底摆脱了对精密温控设备的依赖，仅仅一个热块、一台水浴锅甚至一只保温效果良好的保温瓶、热水瓶等即可满足反应需求。常见的恒温扩增技术包括：环介导等温扩增(lamp)、重组聚合酶扩增(rpa)、链置换扩增(sda)、依赖解旋酶的扩增(hda)、切口酶介导的扩增反应(near)等等。恒温扩增的出现为现场快速检测提供了十分大的便利。
然而，一个重要问题仍然限制核酸扩增现场快速检测，即对扩增产物的快速特异性检测。钙黄绿素通常用于核酸恒温扩增产物的可视化检测，但是常用的方法是在核酸扩增液中添加mn2+猝灭钙黄绿素的荧光。随着核酸扩增的进行，释放大量的焦磷酸盐的时候，焦磷酸盐由于与mn2+的结合作用更强，从而使钙黄绿素脱离mn2+，荧光恢复。这种方法除了检测结果不够特异以外，mn2+的引入也会对扩增本身有较大的抑制作用。同时，对于扩增效率比较低的样本其本身焦磷酸盐产生的量就不多，因而钙黄绿素的荧光恢复不明显。同时由于反应本身产生的焦磷酸盐并不会足够多，所以对钙黄绿素和mn2+的用量提出了严格的要求。
可视化试纸条用于核酸扩增检测具有特异、方便、快速、结果可靠、成本低廉等优点。但是，利用试纸条对核酸扩增结果进行检测通常需要较大体积(通常50-200μl)检测液体，以便扩增分子在试纸条上顺畅而快速的流动。但是在利用试纸条对核酸扩增结果进行检测的过程中，往往有几个方面的因素限制了扩增产物直接用于试纸条检测，必须通过对扩增产物进行稀释后才能用于试纸条检测，如：(1)反应试剂体积的增大往往意味着反应成本骤增；(2)核酸扩增反应试剂中经常含有某些试剂(如peg，pva等)导致扩增体系的过于黏稠，影响样品分子在试纸条上的涌动，造成检测结果的不准确；(3)某些通过探针检测的体系必须在反应后加入探针、缓冲溶液；(4)扩增产物量太大，超出所设计纸条的检测范围，造成钩状效应；等等。这些因素的存在都要求试纸条检测过程中必须加入额外的试剂以保证检测结果的准确性。然而在开盖操作的情况下，扩增产物容易形成气溶胶污染，影响后续检测结果的准确性。针对此问题，目前有多种检测装置，发明人开发出了一种装置(zl201520424418.5)，能够在不开盖的情况下实现对扩增产物的稀释。
但是，依靠这些装置，稀释过程中样品的混合均匀程度对检测结果仍然有很大的影响，如果样品没有混合均匀将直接影响检测结果的准确性。而如何判断样品是否混合均匀却是一个难题。因此，本发明利用钙黄绿素的荧光猝灭效果，结合核酸试纸条的检测特异性，提出了一种利用钙黄绿素检测核酸扩增产物混合均匀程度的方法，进一步保障核酸试纸条检测结果的准确性。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种核酸扩增的检测方法，能在不开盖的情况下监控试纸条检测前样品混匀程度，使采用试纸条检测的结果更加准确。为此，本发明采用以下技术方案：
一种核酸扩增的检测方法，其特征在于：
在第一pcr管加入反应扩增液，在第二pcr管加入钙黄绿素和mno2纳米材料，在第三pcr管加入焦磷酸盐溶液；试纸条探针分别放置在第二pcr管和第三pcr管中，或者，在第一pcr管放入抗原修饰的引物；以具有三个接口的可视化核酸扩增检测装置作为盖，将三个pcr管分别密封连到可视化核酸扩增检测装置的三个接口上，可视化核酸扩增检测装置的检测室内预先装好核酸检测试纸条；
将密封好的装置放在pcr仪或者金属浴上进行扩增；
待扩增反应结束后，在不打开可视化核酸扩增检测装置的情况下，以可视化核酸扩增检测装置为连通器，对可视化核酸扩增检测装置和三个pcr管的连接体进行混匀操作，将反应扩增液，钙黄绿素，mno2和焦磷酸盐溶液混合，通过判断混合液的颜色是否为黄绿色判断混合均匀，然后再进行试纸条检测核酸恒温扩增结果。
由于第一pcr管中的扩增液中加入有二硫苏糖醇dtt，能够还原棕褐色的mno2,变成mn2+,使得溶液变成无色，但是第三pcr管中焦磷酸盐的存在螯合生成的mn2+,使得钙黄绿素荧光恢复，溶液呈现黄绿色。
试纸条检测时，水平倒置装置，使混合液流向逐渐流向试纸条，并在试纸条上出现红色线条，指示检测结果。
相比于传统的利用钙黄绿素进行核酸扩增产物的检测方法，本发明虽然同样可以采用钙黄绿素进行判断，方法却有很大的差异。在本发明中，钙黄绿素和mno2同时置于第二pcr管中，由于mno2具有很强的荧光猝灭作用，使得在扩增液与检测液混合前仅第二pcr管为棕褐色，第一和第三pcr管溶液为无色。dtt是核酸扩增体系中经常使用的增强剂，也是强的还原剂，在核酸扩增体系中使用的浓度可以高达1-10mm。扩增结束后混匀的过程中，一旦具有氧化性质的mno2与还原性的dtt相遇即被还原成mn2+。尽管mn2+的存在仍然不能使钙黄绿素荧光恢复，但是当我们在第三pcr管中添加过量的焦磷酸盐时，焦磷酸盐能够充分螯合mn2+，从而使钙黄绿素的荧光充分释放。此外，由于mno2是一种很好的dna吸附剂，能够有效而快速的吸附dna，使得吸附在mno2表面的探针dna可以在室温条件下长期稳定保存。并且，当与扩增液混合时，mno2迅速捕获周围的产物dna，而当其被还原的过程中，被其捕获到的dna由于空间距离的接近以及生成的mn2+屏蔽了dna之间的静电斥力，从而可以有效地提高探针与产物之间的互补配对速率。相比于已经报道的钙黄绿素法，这种方法并不要求精确控制钙黄绿素的用量，而混合液中过量的焦磷酸盐又能够保证被dtt还原生成的mn2+能够被完全螯合，充分保证了钙黄绿素的黄绿色荧光的释放，且颜色变成很深的亮黄绿色，极利于肉眼判断，使本发明能够在不开盖的情况下检测稀释过程中样品的混合均匀程度，使核酸恒温扩增的检测更容易操作，采用试纸条检测的结果更加准确。
所述的钙黄绿素的浓度的范围在混合前优选为：20μm-500μm；更优选为50-200μm。所述二氧化锰浓度在混合前优选为50μg/ml-200μg/ml,更优选为100μg/ml-150μg/ml。所述焦磷酸盐浓度在混合前优选为500μm-50mm,更优选为1mm-10mm。所述试剂的浓度范围优选主要原因在于，钙黄绿素的浓度在高于20μm时具有明显的肉眼易于识别的黄绿色，低于此浓度，如10μm，尽管也能肉眼可见，但是通常需要在白色的背景下才易于观察。而钙黄绿素浓度过高时，如超过500μm，其浓度靠近棕红色，与mno2的棕褐色十分类似，此时很难判断mno2是否被溶解成mn2+,因此钙黄绿素的浓度范围优选为20μm-500μm。尤其在50μm-200μm之间,钙黄绿素呈现明显且纯正的黄绿色，因此，此范围为钙黄绿素的最佳浓度。二氧化锰的优选浓度必须满足能够完全猝灭钙黄绿素荧光的要求，但是由于dtt在pcr体系里面的最高浓度为10mm,其能够溶解的mno2的最高浓度约为200μg/ml，故二氧化锰的浓度范围优选为50μg/ml-200μg/ml。焦磷酸盐的浓度则必须满足能够螯合所有的由二氧化锰产生的mn2+为宜，故焦磷酸盐的浓度优选为最低500μm。但是混合液的盐浓度过高容易造成溶液太黏稠而不利于在试纸条上涌动，因此焦磷酸盐浓度最高不宜超过50mm。
附图说明
图1为实施例中所用可视化核酸检测装置的示意图。附图标号1、2、3为商业化的pcr管，附图标号4为可视化核酸检测装置，附图标号5为可视化核酸检测装置的检测室，附图标号6为核酸检测用层析试纸条。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，但具体实施例并不对本发明作任何限定。
实施例1：所述可视化核酸扩增检测装置的使用方法——利用抗原修饰的引物进行试纸条检测
1)在如图1所示pcr管1加入核酸扩增反应液和抗原修饰引物，pcr管2中加入mno2和钙黄绿素的混合溶液；pcr管3加入焦磷酸盐(焦磷酸钠或焦磷酸钾)溶液。
2)将pcr管的管1管2管3分别与可视化核酸扩增检测装置4的三个连接口进行连接，密封。可视化核酸扩增检测装置的检测室5内预先装好核酸检测试纸条6。
3)将密封好的装置放在pcr仪或者金属浴上进行扩增。所述装有试剂的三个pcr管刚好至于金属浴或者pcr仪的加热孔中。
4)按照所需要的扩增程序进行正常扩增。
5)扩增结束，取出装置。将装置的倒置甩动，使得pcr管内的溶液流出。甩动的过程尽量使试纸条所在的一头微微向上倾斜，液体在充分混匀之前不会流向试纸条。
6)观察混合液的颜色在装置内的各处都变为亮黄绿色，说明混合均匀。
7)水平倒置装置，使混合液流向逐渐流向试纸条，并在试纸条上出现红色线条。若仅出现c线，说明检测结果为阴性。若同时出现t线和c线，说明检测结果为阳性。若仅有t线没有c线，或两条线都没有，说明检测失败，试纸条的品质出现问题。
实施例2：所述装置的使用方法——利用抗原修饰的探针进行试纸条检测1
1)在如图1所示pcr管1加入核酸扩增反应液，pcr管2中加入mno2和钙黄绿素的混合溶液及抗原修饰的探针；pcr管3加入焦磷酸盐(焦磷酸钠或焦磷酸钾)溶液。
余下的步骤同实施例1。
实施例3：所述装置的使用方法——利用抗原修饰的探针进行试纸条检测2
1)在如图1所示pcr管1加入核酸扩增反应液，pcr管2中加入mno2和钙黄绿素的混合溶液及抗原修饰的探针1；pcr管3加入焦磷酸盐(焦磷酸钠或焦磷酸钾)溶液及抗原修饰的探针2。
余下的步骤同实施例1。
实施例4：所述发明用于聚合酶链式反应pcr检测猪肉成分。
1)在如图1所示pcr管1加入20μlpcr反应液，(包括5’分别标记有生物素和fict的猪肉特异性引物、dntp、tris-hcl缓冲液、mg2+、taq核酸聚合酶，5mmdtt，购于biorad；模板等)；在pcr管管2中添加100μl100μg/mlmno2和100μm钙黄绿素；管3添加100μl5mm焦磷酸盐。三pcr管的液面加棕榈油密封，避免扩增试剂蒸发。三管都与实验装置组成一个密封的整体。
2)将pcr管的管1管2管3分别与可视化核酸扩增检测装置的三个连接口进行连接，密封。显色装置内预先装好核酸检测试纸条。
3)将密封好的装置放在pcr仪上。所述装有试剂的三个pcr管刚好至于pcr仪的加热孔中。
4)按照95度变性3分钟，95度变性15s和60度退火延伸1min，扩增40循环的扩增程序进行扩增。
余下操作步骤同实施例1。
所述实施例中聚合酶链式反应pcr体系本身较为成熟简单，不存在溶液过于黏稠的现象，使用的显色试剂的浓度可以在最优浓度范围内。
实施例3：所述发明用于重组酶聚合酶扩增rpa检测转基因大豆gts40-3-2成分。
1)在如图1所示pcr管1加入50μlrpa反应液，(twist试剂盒，货号tabas03kit，包括针对转基因大豆gts40-3-2的无标记的引物f1；5’端生物素标记的引物r1；以及5’标记fitc，3’端标记spacer，中间标记thf残基的探针；dntp；tris-hac缓冲液；mg2+、bsu聚合酶，重组酶t4uvsx，单链结合蛋白t4gp32，2mmdtt，购于twistdx；模板等)；在pcr管管2中添加100μl50μg/mlmno2和20μm钙黄绿素；管3添加100μl500μm焦磷酸盐。三管都与实验装置组成一个密封的整体。
2)将pcr管的管1管2管3分别与可视化核酸扩增检测装置的三个连接口进行连接，密封。显色装置内预先装好核酸检测试纸条。
3)将密封好的装置放在金属浴上。所述装有试剂的三个pcr管刚好至于金属浴的加热孔中。
4)37度扩增20min。
余下操作步骤同实施例1。
所述实施例中由于重组酶聚合酶扩增反应rpa体系中本身含有十分高浓度的peg，扩增试剂本身的粘度非常高。为了保证试纸条检测时扩增产物的正常涌动，所述各种显色试剂浓度不宜过高。
实施例4：所述发明用于环介导等温扩增lamp检测副溶血弧菌。
1)在如图1所示pcr管1加入25μllamp反应液，包括：针对副溶血弧菌的无标记的引物f3，b3，lf，bip；5’端生物素标记的引物lb；以及5’标记fitc的探针；dntp；betaine，bst聚合酶；5mmdtt，模板等)；在pcr管管2中添加100μl100μg/mlmno2和50μm钙黄绿素；管3添加100μl3mm焦磷酸盐。三管都与实验装置组成一个密封的整体。
2)将pcr管的管1管2管3分别与可视化核酸扩增检测装置的三个连接口进行连接，密封。显色装置内预先装好核酸检测试纸条。
3)将密封好的装置放在金属浴上。所述装有试剂的三个pcr管刚好至于金属浴的加热孔中。
4)63度扩增60min。
余下操作步骤同实施例1。
所述实施例中由于环介导等温扩增反应体系中本身betaine浓度通常达1m，反应试剂本身的粘度相对较高。在保证试纸条检测时扩增产物的正常涌动的条件下，可以使用颜色最为明亮的显色剂浓度，因此使用50μm钙黄绿素，100μg/mlmno2和3mm焦磷酸盐使检测结果更为准确。
实施例5：所述发明用于交叉引物恒温扩增cpa检测柑橘黄龙病。
1)在如图1所示pcr管1加入50μlcpa反应液，包括：针对柑橘黄龙病的无标记的引物f3，b3，cpf，cpr，5r；5’端生物素标记的引物5f；dntp；betaine，bst聚合酶；5mmdtt，购于杭州优思达生物；模板等)；在pcr管管2中添加100μl100μg/mlmno2和50μm钙黄绿素以及5’标记fitc的探针；管3添加100μl3mm焦磷酸盐。三管都与实验装置组成一个密封的整体。
2)将pcr管的管1管2管3分别与可视化核酸扩增检测装置的三个连接口进行连接，密封。显色装置内预先装好核酸检测试纸条。
3)将密封好的装置放在金属浴上。所述装有试剂的三个pcr管刚好至于金属浴的加热孔中。
4)63度扩增60min。
余下操作步骤同实施例1。
所述实施例中由于交叉引物恒温扩增cpa体系中本身betaine浓度通常达1m，反应试剂本身的粘度相对较高。在保证试纸条检测时扩增产物的正常涌动的条件下，可以使用颜色最为明亮的显色剂浓度，因此使用50μm钙黄绿素，100μg/mlmno2和3mm焦磷酸盐使检测结果更为准确。
实施例6：所述发明用于切口酶扩增near检测柑橘黄龙病。
1)在如图1所示pcr管1加入50μlnear反应液，包括：针对柑橘黄龙病的无标记的引物f1，r1及bf,dntp；bst3.0聚合酶；切刻酶nt.bstnbi，kcl；购于envirologix；10mmdtt模板等)；在pcr管管2中添加100μl200μg/mlmno2和500μm钙黄绿素以及5’标记fitc的探针p1；管3添加100μl50mm焦磷酸盐和5’端标记生物素的探针p2。三管都与实验装置组成一个密封的整体。
2)将pcr管的管1管2管3分别与可视化核酸扩增检测装置的三个连接口进行连接，密封。显色装置内预先装好核酸检测试纸条。
3)将密封好的装置放在金属浴上。所述装有试剂的三个pcr管刚好至于金属浴的加热孔中。
4)56度扩增10min。
余下操作步骤同实施例1。
所述实施例中由于切口酶扩增near的反应体系具有极高的反应速率，很容易产生非特异性扩增。使用高浓度的显色试剂能够起到抑制酶的反应活性的作用，从而抑制混合过程中探针与引物之间形成非特异性扩增，因此使用500μm钙黄绿素，200μg/mlmno2和50mm焦磷酸盐。