地耳草中具有抗EB病毒和抗卡波氏肉瘤相关疱疹病毒作用化合物及其制法及应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，涉及抗EB病毒和抗卡波氏肉瘤相关疱疹病毒作用化合物化合物及其分离制备方法和应用，具体涉及分离纯化过程，结构确证，抗病毒及抑制病毒DNA复制作用等。

背景技术：
EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)属于疱疹病毒科γ疱疹病毒亚科，是一种嗜人类淋巴细胞病毒，全球范围内约95％的健康成人携带该病毒。EBV主要潜伏于人类静止状态的成熟B淋巴细胞，是传染性单核细胞增多症的病原体，同时与多种人类淋巴细胞性和上皮细胞性肿瘤的发生发展有关，如鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，NPC)、何杰金氏病、T/B淋巴细胞瘤、Burkitt’S淋巴瘤以及免疫缺陷病人的B淋巴细胞瘤等，是公认的DNA肿瘤病毒。EB病毒在裂解期的DNA复制是它在细胞里繁殖的重要阶段，因此，筛选和研发针对EBV裂解期的DNA复制的药物，对于治疗EBV相关疾病具有重要的意义。卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’ssarcomaassociatedherpesvirus，KSHV)又称为人疱疹病毒8型(Humanherpesvirus8，HHV-8)，属于疱疹病毒科(Herpesviridae)，是一种双链DNA(dsDNA)病毒。KSHV是卡波氏肉瘤(Kaposi’ssarcoma，KS)、原发性渗出性淋巴瘤(Primaryeffusionlynphoma，PEL)及多中心卡氏病(Multicentrecattleman’sdisease，MCD)的病原体，在我国新疆维吾尔自治区地区有较高的KSHV感染率及KS发病率。目前临床上治疗KSHV相关疾病的方法取得了一定的进展，但是这些方法不能完全治愈，并且对人体有一定的副作用。因此，筛选和研发针对KSHV裂解期复制的药物，对于治疗KSHV相关疾病具有重要的意义。地耳草(Hypericumjaponicum)是藤黄科金丝桃属多年生草本植物地耳草[Hypericumjaponicum(Thunb.)Herb]的全草，又名田基黄、小元宝草、四方草、千重楼(浙江)等，产于辽宁、山东至长江以南各省区。民间以全草入药，有清热解毒、止血消肿的功效；主要用于治疗传染性肝炎、泻痢、小儿惊风、疳积、喉蛾、肠痈、疖肿蛇咬伤等。在欧洲、美洲的民间也有药用记载。现代药理研究表明,田基黄具有抑菌、保肝、抑制肿瘤和防治心血管疾病等作用,现已开发成针剂在临床上治疗急、慢性肝炎。

技术实现要素：
：本发明的任务是提供具有抗EB病毒和抗KSHV活性的化合物及其来源以及分离纯化方法和应用。实现本发明的具体方案是：本发明提供的具有抗EB病毒和抗KSHV活性的化合物是具有以下式(I)所示的化合物1至化合物18：化合物1：地耳草右旋抗EB病毒素A[(+)-hyperjaponolA(1)]化合物2：地耳草左旋抗EB病毒素A[(－)-hyperjaponolA(2)]化合物3：地耳草右旋抗EB病毒素B[(+)-hyperjaponolB(3)]化合物4：地耳草左旋抗EB病毒素B[(－)-hyperjaponolB(4)]化合物5：地耳草右旋抗EB病毒素C[(+)-hyperjaponolC(5)]化合物6：地耳草左旋抗EB病毒素C[(－)-hyperjaponolC(6)]化合物7：地耳草抗EB病毒素D(hyperjaponolD)，R＝CH(CH3)2化合物8：地耳草抗EB病毒素E(hyperjaponolE)，化合物9：地耳草抗EB病毒素F(hyperjaponolF)，化合物10：地耳草绵马素G(hyperjaponolG)化合物11：地耳草右旋抗KS疱疹病毒素A[(+)-japonicolA(11)]化合物12：地耳草左旋抗KS疱疹病毒素A[(－)-japonicolA(12)]化合物13：地耳草右旋抗KS疱疹病毒素B[(+)-japonicolB(13)]化合物14：地耳草左旋抗KS疱疹病毒素B[(－)-japonicolB(14)]化合物15：地耳草右旋抗KS疱疹病毒素C[(+)-japonicolC(15)]化合物16：地耳草左旋抗KS疱疹病毒素C[(－)-japonicolC(16)]化合物17：地耳草右旋抗KS疱疹病毒素D[(+)-japonicolD(17)]化合物18：地耳草左旋抗KS疱疹病毒素D[(－)-japonicolD(18)]式(I)我们在抗病毒活性筛选的指导下，对采自湖北省蕲春县大别山地区和采自江西省庐山市庐山地区的地耳草进行了系统的抗病毒活性成分研究，分离得到了18个新化合物。其中，从采自湖北省蕲春县大别山地区的地耳草中分离得到化合物1-10，从采自江西省庐山市庐山地区的地耳草种分离得到化合物11-18。结构式如式(I)所示。通过这18个化合物对两种致瘤疱疹病毒进行抗病毒活性研究，发现化合物1、3、4、7和8对EB病毒的DNA复制有抑制活性；化合物3、6和13-17对卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)裂解期的复制有抑制活性。本发明涉及地耳草中化合物的分离制备、以及它具有抑制病毒的活性。化合物1、3、4、7和8可以预期发展成为治疗由EB病毒引起的红斑狼疮、风湿性关节炎、和鼻咽癌、何杰金氏病、T/B淋巴细胞瘤、Burkitt’S淋巴瘤以及免疫缺陷病人的B淋巴细胞瘤等肿瘤疾病的药物；化合物3、6和13-17可以预期发展成为治疗由KSHV引起的卡波氏肉瘤、原发性渗出性淋巴瘤及多中心卡氏病等疾病的药物。由此完成了本发明。本发明人通过对采自湖北省蕲春县大别山地区的地耳草全草的乙醇提取物进行分离纯化，得到10个新化合物，即化合物1-10。对采自江西省庐山市庐山地区的地耳草全草的乙醇提取物进行分离纯化，得到8个新化合物，即化合物11-18。运用多种波谱分析方法和其他手段，确定它们的结构为杂萜类化合物，具体结构如式(I)所示。通过对化合物1-18的抗病毒活性评价，发现化合物1、3、4和7-9对EB病毒在B95-8细胞中用佛波酯(PMA/TPA)诱导后进行裂解复制，表现出良好的抑制病毒DNA复制的活性，其中化合物3和7的活性尤其显著，可以作为抑制EB病毒药物开发的潜在药物；发现化合物3、6和13-17对KSHV在iSLK.219细胞中用四环素(Dox)和丁酸钠(NaB)诱导后进行裂解复制，表现出良好的抑制KSHV裂解复制的活性，其中化合物13活性较为显著，可以作为抑制KSHV药物开发的先导化合物。本发明的另一任务是提供式(I)中所示化合物1-18在制备抗病毒药物中的应用。当为化合物3和7时，所述的抗病毒药物优选为抗EB病毒的药物。当为化合物13时，所述的抗病毒药物优选为抗KSHV。附图说明图1：式(1)所示化合物地耳草右旋抗病毒素B、地耳草左旋抗病毒素B、地耳草抗病毒素D和地耳草左旋抗KS病毒素C的结构鉴定。对化合物地耳草右旋抗病毒素B、地耳草左旋抗病毒素B、地耳草抗病毒素D和地耳草左旋抗KS病毒素C进行质谱，紫外光谱，红外光谱，旋光，核磁共振，圆二色谱和X射线单晶衍射等数据测试，从而确定化合物的结构。化合物3和4：UV(CH3OH)λmax(logε)＝227(3.22),242(3.25),325(3.28)nm；IRνmax＝3460,2963,2930,1658,1624,1553,1474,1383cm–1；for1HNMR(600MHz)and13CNMR(150MHz)dataseeTable1and2；HRESIMS[M+H]+m/z457.2946(calcdforC28H41O5,457.2954)。3:Colorlessoil,+135.4(c0.03,MeOH)；ECD(MeOH)λ(Δε)216(+13.01)nm；4:Colorlessamorphouspowder,-134.5(c0.03,MeOH)；ECD(MeOH)λ(Δε)217(-10.91)nm。化合物3和4的绝对构型的确定是通过计算ECD的方法。实验所测的CD(圆二色谱)的Cotton效应与计算值吻合。如图1所示。图2：化合物7：orange-redoil,+64.7(c0.11,MeOH)；ECD(MeOH)λ(Δε)227(+3.23),272(+0.78),317(+0.74)nm；UV(CH3OH)λmax(logε)＝229(3.64),240(3.15),329(3.26)nm；IRνmax＝3521,3054,2980,2933,2873,1659,1626,1475,1383cm–1；for1HNMR(400MHz)and13CNMR(100MHz)dataseeTable1and2；HRESIMS[M+H]+m/z475.3046(calcdforC28H43O6,475.3060)。化合物7绝对构型的确定是通过计算ECD的方法。实验所测的CD(圆二色谱)的Cotton效应与计算值吻合。如图2所示。图3：化合物16晶体结构如图3所示。具体实施方式实施例1：化合物地耳草右旋抗病毒素B、地耳草左旋抗病毒素B、地耳草抗病毒素D和地耳草左旋抗KS病毒素C的制备和结构鉴定。(一)如式(1)所示化合物地耳草右旋抗病毒素B、地耳草左旋抗病毒素B、地耳草抗病毒素D和地耳草左旋抗KS病毒素C的制备1.地耳草(Hypericumjapocicum)的采集：采自湖北省蕲春县大别山地区的地耳草：10月份采集全草50kg，晒干，真空干燥后，保存于华中科技大学同济医学院药学院中草药标本库。采自江西省庐山市庐山地区的地耳草：8月份采集全草，晒干，真空干燥后，保存于华中科技大学同济医学院药学院中草药标本库。2.提取：均采用溶剂提取法，将干燥的地耳草全草粉碎后，加入95％乙醇进行渗漉提取4次。低于40℃下减压浓缩回收乙醇。采自湖北省蕲春县大别山地区的地耳草，得到230.0g浸膏；采自江西省庐山市庐山地区的地耳草，得到130.0g浸膏。3.分离：将230.0g的总浸膏(采自湖北省蕲春县大别山地区的地耳草)用100-200目硅胶拌样，干法装柱后，用石油醚-丙酮梯度洗脱(100:1–5:1)，TLC检测，合并相同的组分，共得到5个组分。组分3再经过反复的正反相硅胶柱色谱，凝胶色谱和高效液相色谱分离得到化合物地耳草抗病毒素B(3.7mg)，并通过手性制备柱进行手性拆分，得到一对质量相等的对映异构体，即(±)-hyperjaponolB(3和4)；组分4经过反复的正反相硅胶柱色谱，凝胶色谱和高效液相色谱分离分到化合物地耳草抗病毒素D(10.1mg)，即hyperjaponolD；将130.0g的总浸膏(采自江西省庐山市庐山地区的地耳草)用120目硅胶拌样，干法装柱后，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(100:1–5:1)，TLC检测，合并相同组分后，得到8个组分。组分7经过反复的正反相硅胶柱色谱，凝胶色谱和高效液相色谱分离分到化合物地耳草抗KS病毒素C，即(±)-japonicolC(5.1mg)，然后用手性制备柱进行手性拆分，得到一对质量相等的对映异构体，即(±)-japonicolC(15和16)。(二)如式(1)所示化合物地耳草右旋抗病毒素B、地耳草左旋抗病毒素B、地耳草抗病毒素D和地耳草左旋抗KS病毒素C的结构鉴定对化合物地耳草右旋抗病毒素B、地耳草左旋抗病毒素B、地耳草抗病毒素D和地耳草左旋抗KS病毒素C进行质谱，紫外光谱，红外光谱，旋光，核磁共振，圆二色谱和X射线单晶衍射等数据测试，从而确定化合物的结构。化合物3和4：UV(CH3OH)λmax(logε)＝227(3.22),242(3.25),325(3.28)nm；IRνmax＝3460,2963,2930,1658,1624,1553,1474,1383cm–1；for1HNMR(600MHz)and13CNMR(150MHz)dataseeTable1and2；HRESIMS[M+H]+m/z457.2946(calcdforC28H41O5,457.2954)。3:Colorlessoil,+135.4(c0.03,MeOH)；ECD(MeOH)λ(Δε)216(+13.01)nm；4:Colorlessamorphouspowder,-134.5(c0.03,MeOH)；ECD(MeOH)λ(Δε)217(-10.91)nm。化合物3和4的绝对构型的确定是通过计算ECD的方法。实验所测的CD(圆二色谱)的Cotton效应与计算值吻合。如图1所示。化合物7：orange-redoil,+64.7(c0.11,MeOH)；ECD(MeOH)λ(Δε)227(+3.23),272(+0.78),317(+0.74)nm；UV(CH3OH)λmax(logε)＝229(3.64),240(3.15),329(3.26)nm；IRνmax＝3521,3054,2980,2933,2873,1659,1626,1475,1383cm–1；for1HNMR(400MHz)and13CNMR(100MHz)dataseeTable1and2；HRESIMS[M+H]+m/z475.3046(calcdforC28H43O6,475.3060)。化合物7绝对构型的确定是通过计算ECD的方法。实验所测的CD(圆二色谱)的Cotton效应与计算值吻合。如图2所示。化合物16：Colorlesscrystal,-100.6(c0.24,MeOH)；UV(CH3OH)λmax(logε)＝203(4.49),226(4.37),289(4.31)nm；IRνmax＝3225,2964,2927,2854,1718,1619,1494,1460,1420cm–1；ECD(MeOH)λ(Δε)218(+6.80),275(+2.78),307(-10.72)nm；for1HNMR(400MHz)and13CNMR(100MHz)dataseeTable1and2；HRESIMS[M+Na]+m/z371.1807(calcdforC20H28O5Na,371.1834)。化合物16绝对构型的确定是通过X射线单晶衍射的方法。16晶体结构如图3所示。实施例2：化合物1-10对EB病毒的DNA复制的抑制活性；化合物1-18对KSHV裂解复制的抑制活性。化合物1-10的抗EB病毒活性的评价：首先采用了cellviabilityreagent试剂盒(thermofisher)检测化合物物对细胞的毒性作用；然后利用带有EBV病毒的B95-8细胞作为评估化合物对EBV裂解复制的模型，利用TPA(20ng/mL)激活EBV进入裂解复制，通过QPCR的方法检测EBV基因拷贝数评估化合物对复制的影响。化合物1-18的抗KSHV活性的评价：首先采用了cellviabilityreagent试剂盒(thermofisher)检测化合物对细胞的毒性作用；然后利用潜伏存在重组GFP基因的KSHV病毒的细胞系iSLK.219作为评估化合物对EBV裂解复制的模型，利用Dox联合NaB诱导KSHV进入裂解期复制，观测分析Vero细胞中GFP表达的荧光密度，从而得知化合物对细胞上清液中感染性病毒颗粒产生水平的影响。结果如Table3所示。Table1.1HNMRdataforcompounds3/4,7,and16(400MHz,JinHz,inCDCl3)a600MHzTable2.13CNMRforcompounds3/4,7,and16(100MHz,JinHz)a150MHzTable3.anti-EBVactivitiesofcompounds1–10.Table4.anti-KSHVactivitiesofcompounds1–18.注：选择指数(SI)是CC50/EC50所得的值，用来判断药物的效果，SI大于3可视为有效，指数越大说明药物抗病毒效果越好，一般来讲如果药物的SI值大于10，且EC50值相对较低(小于100μM)，那么该药物可以作为潜在药物进行开发。实验结论：化合物1、3、4、7和8表现出较低的毒性和较高的选择指数，可以作为抑制EB病毒药物开发的先导化合物，并且，其中化合物3和7的活性尤其显著，EC50均远低于阳性药物Gancilovir，而且化合物7的选择指数高于Gancilovir，可以作为潜在抗EB病毒药物进行开发；化合物13-17表现出低毒性和较高的选择指数，可以作为抑制KSHV药物开发的先导化合物。