专利名称：肽基化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的肽基化合物，及其在医疗上有效治疗以及用于诊断成 像技术的用途。更特别的是，本发明涉及所述肽基化合物用作与血管生成 相关的受体，特别是avp3整合素(iiitegrin)受体结合的靶向媒介物的用 途。这种造影剂可以用于诊断，例如恶性病、心脏疾病、与炎症相关的疾 病、风湿性关节炎和卡波济氏肉瘤。并且所述化合物也可以用于这些疾病 的治疗。
背景技术：
新血管可以通过两种不同的机理形成血管发生或血管生成。血管生 成是通过从现有血管分枝形成新的血管。这一过程的主要刺激因素可能是 对组织中细胞的养分和氧(缺氧)供应不充足。细胞通过分泌血管生成因子 产生应答，所述因子有很多种； 一个常常提及的例子是血管内皮生长因子 (VEGF)。这些因子引发了破坏基膜蛋白的水解酶的分泌还抑制了限制这些 潜在的有害酶活动的抑制剂的分泌。血管生成因子的另一个突出作用是导 致内皮细胞迁移和分裂。附着于基膜的内皮细胞不进行有丝分裂，所述基 膜在腔面对侧(contralumenal )围绕血管形成连续的薄层。内皮细胞附 着的缺失和来自血管生成因子受体的信号的合并效杲导致内皮细胞移动、 繁殖和自身重排，并最终围绕新血管合成基膜。
血管生成在组织的生长和改型，包括伤口愈合和炎症过程中是重要 的。当肿瘤达到毫米尺寸时，为了保持其生长的速度而必须引发血管生成。 血管生成伴随着内皮细胞及其环境的特征改变。除了影响和控制蛋白水解 所涉及的各种蛋白质之外，这些细胞的表面在准备迁移的过程中改型，并 且隐蔽的结构在基膜降解时暴露出来。在肿瘤的情况下，形成的血管网络 一般是紊乱的，伴有尖锐扭结的形成和动静脉分流。血管生成的抑制也被 视作抗肿瘤治疗的有希望的策略。伴随血管生成的变化对于诊断也是非常有希望的， 一个明显的例子是恶性疾病，不过这种概念在炎症和各种与炎 症相关疾病，包括动脉硬化症中也显示了很大希望，因为早期动脉粥样硬 化损害的巨噬细胞是血管生成因子的潜在来源。这些因子也参与心肌梗塞 部分的血管再形成，这发生在狭窄在很短时间内被緩解的情况下。
与新血管再形成或血管生成，新血管的成长或增殖有关的不希望的条
件的更多例子列于下表1。关于这一点也可参见W098/47541。
与血管生成相关的疾病和征兆是，例如不同形式的癌症和转移，诸如
乳房、皮肤、结肠直肠、胰腺、前列腺、肺或卯巢癌。
其它疾病和征兆是炎症(例如慢性的)、动脉硬化症、风湿性关节炎和
牙龈炎
与血管生成相关的更多疾病和征兆是动静脉形成异常、星细胞瘤、绒 毛膜癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、血管瘤(儿童，毛细管)、肝细胞瘤、 子宫内膜增生、心肌局部缺血、卡波济氏肉瘤、黄斑变性、黑素瘤、成神 经细胞瘤、咬合外周动脉疾病、骨关节炎、牛皮藓、视网膜病(糖尿病性 的、增生性的)、硬皮病、精原细胞瘤、实体瘤形成和溃痴性结肠炎。
血管生成涉及对内皮细胞特有的受体。整合素avp3是已知与血管生 成相关的一种受体。受刺激的内皮细胞在血管生成过程的临界期为了存活 而显示出对这种受体应答，因为av|33整合素受体/配体相互作用的拮抗剂 诱导细胞程序凋亡并抑制血管生长。
整合素avp3是作为受体的跨膜蛋白质家族的一员，细胞可以通过所 述受体附着在细胞外基质上。整合素是杂二聚分子，其中a和f3亚单位穿 透细胞膜的脂质双分子膜。a-亚单位在其细胞外链上有四个Ca^结合区 域，{3_亚单位有许多细胞外半胱氨酸富集区域。
许多参与细胞附着的配体(例如粘连蛋白)含有三肽序列精氨酸-甘氨 酸-天冬氨酸(RGD) 。 RGD序列显示作为该序列中存在的配体和细胞表面受 体之间的主要识别位点。 一般认为，配体和受体之间的二级相互作用增强 了相互作用的特异性。这些二级相互作用可能在配体部分和紧紧靠近RGD 序列的受体之间或在远离RGD序列的位点上发生。
已知RGD肽与一定范围的整合素受体结合，并且具有调节许多在临床 中有重要应用的细胞内活动的潜力。(Ruoslahti， J. Ci in. Invest.， 87: 1-5 (1991))。对RGD肽和其模拟物的最广泛的研究成果涉及它们作为 抗血栓形成剂的用途，其中它们针对的是血小板整合素GpIIbIIIa。在例如W0 97/06791和W0 95/25543中，已经描述了使用抗体或含肽 RGD，通过服用avp3或av[35拮抗剂抑制组织中的血管生成。EP 578083 描述了一系列含肽的单环RGD，并且W0 90/14103描述了 RGD抗体。Haubner 等在J. Nucl.Med. (1999); 40: 1061-1071中描述了一类新型的基于含肽 单环RGD的示踪物用于肿瘤导向。但使用全身自动放射照相成像的生物分 布研究显示，标记的肽具有非常快的血液清除率，并且显著的肝胆管 分泌途径导致背景噪声高。
在W0 98/54347和WO 95/14714中，已经描述了环状RGD肽，其中通 过三肽序列末端的桥联限定了 RGD部分。通过体内淘选(biopanriing)衍生 的肽(W0 97/10507)已被用于多种耙向应用。具有不确定的桥位置的序列 CDCRGDCFC (RGD-4C)已被用于耙向药物，例如doxirubicin (WO 98/10795)、 核酸和对细胞的腺病毒(参见WO 99/40214， WO 99/39734， W0 98/54347， W0 98/54346, US 5846782)。
与体内血管生成有关的整合素受体的有效耙向和成像需要选择性的， 高亲和性的基于RGD的媒介物，该媒介物是化学稳固和稳定的。此外，当 设计显影剂以减少背景问题时，分泌途径是重要的因素。本发明所述的含 离散桥(discrete bridge)的结构符合这些严格的条件。
发明内容
本发明的一个方面提供了式I定义的新肽基化合物。这些化合物可以 用作对整合素avp3具有亲和力的媒介物，其包含側面与两个离散桥连接 的直链RGD序列，其中 一个或两个桥是二硫桥。与已知的直链RGD肽相比， 目前所述媒介物通过改善的结合/功效显示出意想不到的活性。这些新的 肽基化合物可以用于医疗上的有效治疗以及用于成像的目的。
因此，式I定义了用作媒介物(V)的肽基化合物，其具有对整合素a、，卩3 的亲和力。但是，根据R，和Xh的定叉，式I还包括式"V-L-R"的化合物， 其中V是媒介物，L是连接部分或健，且R是例如在成像过程中可检测的 可检测部分(报告分子)，诸如在人体内成像或血管化的非人的动物体(例 如，哺乳动物、鸟类或爬行动物体)的体内成像，其中所述化合物由通式 (I)表征((X8) -X7)r-R广X!-X2-X3-G-D-X4-X5-Xs- (X7- (X8)g)
(工)
其中 r-O或l p=0或1 且r+p=l
当r=0时，R,是-(CH2) -CO-或—(CH丄-C晶-C0-，其中ii=l、 2、 3、 4
或5,
当r=l时，R,是一个或多个成桥(bridge-forming)氨基酸，优选半胱
氨酸，并且优选R)和X2之间的桥含有硫醚或二硫键，
并且当r-l(因此p-O)时，R,特别优选是半胱氨酸并与X2形成二硫桥。 X严一个键或l、 2、 3、 4或5个氨基酸，或碳水化合物部分发生衍生
的氨基酸，或被间隔基或连接基和/或螯合物官能化的氨基酸，所述螯合
物连接或能够连接适于体内成像的才艮告分子，优选金属放射性核素。 优选X，是天冬氨酸、酪氨酸、酪氨酸-天冬氨酸或赖氨酸。 义2和l分别是半胱氨酸、高半胱氨酸或能够形成环状键的其它氨基
酸，例如天冬氨酸和赖氨酸。
X3是精氨酸、N-甲基精氨酸或精氨酸模拟物。
X,是疏水氨基酸，优选苯丙氨酸、酪氨酸、碘酪氨酸(更优选3-碘-酪氨酸)、二蛾酪氨酸或萘基丙氨酸。
X6是能够形成环状键的氨基酸，优选半胱氨酸或高半胱氨酸。
X 是一个键或1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、或10个氨基酸，优选 甘氨酸，或间隔基或连接基，任选#1如1定义的多种螯合物标记，并任选 含有一个或多个乙二醇单元或任意的其它间隔基成分，以及
Xx是连接或能够连接适于体内成像的金属放射性核素或其它任意报
告分子的螯合物，或是-冊2或不存在。
q是0、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7或8，以及 一个桥(在R,和X2之间或^和Xe之间)含二硫键。在本发明的某些方面，此处描述的媒介物-螯合物共轭物的媒介物组 分不具有游离的tt或羧基末端。所述末端的引入明显增加了这些化合物 对于酶降解作用的拮抗性，使得它们与许多已知的游离肽相比具有增加的 体内稳定性。
具体实施例方式
本发明优选涉及的式(I)化合物由式(II)进一步定义
<formula>formula see original document page 9</formula>天冬
(工i:
其中Cys-半胱氨酸 其中
X，，是1、 2或3个氨基酸，最优选天冬氨酸、酪氨酸、酪. 氨酸、赖氨酸或乙酰基-赖氨酸， 乂3如式I定义；
X 是苯基丙氨酸、酪氨酸、3-碘-酪氨酸或萘基丙氨酸； X ，是一个键、甘氨酸、或0-双(氨乙基)乙二醇间隔基，优选X 是甘 氨酸；和
Xs，是与金属放射性核素连接的螯合物，其中螯合物结构是
或这些螯合物的其它Nj或双-肝类型物质，以及
如式n所示， 一个桥包括硫键，另一个桥包括二疏键,在通式(II)化合物的特别优选实施方案中，X3是N-甲基-精氨酸和/ 或X 是萘基赖氨酸。
报告分子R可以在X和/或X7内的任何合适位点与V (通过L)连接。 优选选择连接点使得V的生物活性或V对其靶点的连接亲和度基本或不明 显降低(与不带有R的V的生物活性或V的连接亲和力相比)。最优选R通 过X，和/或X,与V连接。
此处使用的术语"氨基酸"的最广泛涵义是指产生蛋白质的L-氨基 酸、D-氨基酸、化学修饰的氨基酸、N-甲基、C-甲基和氨基酸侧链类似物 和非自然氨基酸，例如萘基赖氨酸。
术语"环状键"指氨基酸(或带有氨基酸和-(CH2),,-C0-或 -(CH2),,-CA-C0-)与便于？ 1入桥的官能团的任意结合。 一些优选的实施例 是二硫化物、二疏化物类似物，例如-(CH》广碳代桥(carba bridge )、硫 缩醛、硫醚桥(胱疏酮或羊毛硫氨酸)和含酯和醚的桥。
通过以下化合物1-5举例说明式(I)化合物的一些优选实施方案
化合物1:
化合物2: A某介物<formula>formula see original document page 10</formula>化合物3:式I的V-L-R化合物的例子
<formula>formula see original document page 11</formula>
化合物4:式II化合物的例子
<formula>formula see original document page 11</formula>
化合物5:能够连4秦，例如""Tc的式？化合物的例子
在大多数情况下，优选媒介物V中的氨基酸是L-形式。但是，在本发明的一些实施方案中，媒介物v中的一个、两个、三个或多个氨基酸优
选是D-形式。含有这种D-形式氨基酸对于媒介物的血清稳定性有重要效 果。在这方面，特别关注的是在X,位点带有D-酪氨酸的媒介物。
本发明也提供了一种药物组合物，其含有有效量(例如，有效增强在 体内成像中的图像对比度和/或治疗的量)的通式(I)化合物或其酸加成盐 以及一种或多种药理可接受的助剂、赋形剂或稀释剂。
如上所述，式I化合物可以包^Hf某介物、连接基和报告分子部分。连 接基部分可以用以连接一个媒介物和一个报告分子；或者它可以同时连接 多个媒介物和/或多个报告分子。同样，报告分子或媒介物可以与多个连 接基连接。以这种方式使用多个报告分子(例如，若干个连接基-报告分子 部分连接至一个媒介物，或若干个4良告分子连接至一个本身连接在一个媒 介物上的连接基上)可以使造影剂的可检测性增强(例如，通过增加其射线 不透明性、产生回波性或relaxivity),或可以使其能够以多于一种图像 方式被检测到。以这种方式使用多个^f某介物可以增加造影剂的靶向有效性 或使得造影剂能够耙向多于一个位点，例如，不同的报告分子针对具有报 告分子多相性的一种试剂。
连接基
可以使用宽范围的连接基，包^fe可生物降解的连接基和生物聚合物。 造影剂的连接基组分以其最简单形式位于媒介物和报告分子部分之 间的键上。但更通常的是，连接基向例如直链、环状、支链或网状的分子 骨架，或分子聚集体之类一个或多个报告分子提供了共价地或非共价连接 了 一个或多个媒介物的单-或多分子骨架，所述报告分子带有共价或非共 价，例如配位连接了媒介物和报告分子部分或密封、阻挡或固定这些部分 的嵌入基或侧基。
实现， 一般包括用位于报告分子和/或媒介物上的一种或多种官能团相互 作用。可用于这一目的的化学反应性官能团的例子包括氨基、羟基、巯基、 羧基和羰基，以及碳水化合物基团、邻位二醇、硫醚、2-氨基醇、2-氨基 硫醇、胍基、咪唑基和酚基。
如果需要，将报告分子和/或媒介物中的官能团在反应之前转化为其 它官能团，以例如具有额外的反应性或选择性是适合的。
也可以使用酶作为零长度交联剂进行媒介物-报告分子的偶合；因此，例如，可以使用转谷氨酰胺移酶、过氧化物酶和黄噪呤氧化酶产生交联产 物。反向蛋白水解也可以用于通过酰胺键形成交联。
非共价媒介物-报告分子的偶合可以通过，例如静电荷相互作用，通 过以稳定金属络合物形式螯合或通过高亲和性连接相互作用而实现。
也可以使用与肽、脂寡糖或包舍能够调节膜插入的成分的脂酰肽偶合 的々某介物。
也可以使用具有四个对生物素的高亲和性连接位点的抗生物素蛋白 或抗生蛋白链菌素进行偶合。因此，如果媒介物和报告分子都是生物素化 的，抗生物素蛋白可以用于将媒介物连接至报告分子。
所谓零长度连接剂，是指在不引入额外的连接材料的情况下，诱导两
个反应性化学基团直接共价结合的试剂，如果需要，其可以用于本发明。 但最常用的连接剂包含两个或多个反应性部分，例如如上所述，通过 间隔基成分彼此连接。所述间隔基的存在使得双官能连接基与分子内或在 两个不同分子之间的特定官能团反应，在这两个组分之间生成键并将外来 的连接基衍生材料引入报告分子4某介物的共扼物。
通过连接剂引入的外来材料的性质对把向能力、药物动力学和终产物 的整体稳定性具有关键影响。因此，需要引入，例如含有间隔基臂的不稳 定连接，所述间隔基臂是生物可降解或化学敏感的或者结合了酶解离的位 点。或者间隔基可以包括，例如作为表面活性剂和增强试剂稳定性的聚合 組分。间隔基也可以包含，例如如上所述增强表面交联的反应性部分。
间隔基成分也可以包括大分子结构，例如葡聚糖和聚(乙二醇)， 一般
称为PEGs。除了间隔基成分之外，PEGs还可用于对媒介物的体内特征进 行修饰。
通过网状内皮组织系统(RES)的细胞吸收颗粒的主要机理是血液中血 浆蛋白的调理作用；这些标记的外源颗粒随后被RES吸收。本发明使用的 PEG间隔基成分的生物特性可以按照与观察到的PEG化的脂质体相同的方 式增加试剂的循环时间。使用与PEG间隔基末端结合的抗体也可以增加对 感兴趣区域的偶合有效性。
其它有代表性的间隔基成分包括结构型多糖、储存型多糖、聚M酸 及其甲基和乙基酯，以及含或不含酶解离位点的多肽、寡糖和低聚核普酸。
优选的连接基团是从选自以下々某介物反应性基团衍生的，但不限于这 些基团可以直接与媒介物上的羧基、醛、胺(N肌)、醇、巯基、活化的亚甲 基等反应的基团，例如活化的含卣素基团，
可以容易地与含媒介物反应性基团的修饰过的媒介物分子反应的基 团，即例如通过将媒介物氧化为醛或羧酸，将所含的一个反应性基团改性 为含多个反应性基团的媒介物，和
可以通过使用交联剂，与含反应性基团的媒介物或与如上所述修饰的 媒介物相连接的基团。
优选使用的连接基团是从各种杂双官能(heterobifunctional)交联 剂，例如那些歹寸于 Pierce Chemical Company Immunotechnology Catalog—Protein Modification Section, (1995和1996)中的交联剂4汙生 的基团。
除前述外，连接基团，全部或部分可以由核苷酸的互补序列和核芬酸 的残基组成或衍生，均为天然的或^f饰过的，优选非自身締合的低聚核苷 酸序列。
本发明使用的连接剂一般导致媒介物与报告分子或报告分子与报告 分子的连接具有某种程度的特异性，并且其还可以用于连接一种或多种治 疗活性剂。
3 --5:页上给出，这些页上公开的内i在此全部引作参考。因此表明，':
上述页中公开的每一种连接基或其部分可以视为本说明书中描述的本发 明的一部分。 报告分子
本发明造影剂中的报告分子部分可以是任何在体内诊断成像方法 中能够直接地或间接检测的部分，例如，发射或可以导致发射可检测 射线(例如通过放射性衰变、荧光激发、自旋共振激发，等等)的部分， 影响局部电磁场的部分(例如顺磁的、超顺磁的、亚铁磁的或铁磁性物 质)，吸收或散射射线能量的部分(例如生色团或荧光团)，颗粒(包括 含泡液体)、重元素及其化合物，以及产生可检测物质的部分，等等。
通过诊断成像方式可检测宽范围的物质是本领域已知的，并且报 告分子将按照使用的成像方式进行选择。这样例如对于超声成像，一 般选择产生回波的物质，或能够产生回波物质的物质。媒介物可以通 过连接基与合适的类脂报告分子/载体偶合掺入充气的微泡中。这种微泡可以用于靶向超声成像。
对于x-射线成像，报告分子一般是重原子或包含重原子(例如重量 38或以上的原子)。对于MR成像，报告分子可以是非零核自旋同位素(例 如"F)或有未配对电子自旋并因此具有顺磁性、超顺磁性、亚铁磁性或 铁磁性性质的物质。对于光成像，报告分子是光散射体(例如有色或无 色颗粒)，光吸收体或光发射体。对磁成像，报告分子一般具有可检测 的磁性；对电阻抗成像，报告分予一般影响电阻抗。对闪烁扫描法、 SPECT、 PET等等，报告分子是放射性核素。
合适的报告分子的例子从诊断成像文献中可知，例如磁性氧化铁 颗粒、含泡的X-射线造影剂、螯合的顺磁性金属(例如Gd、 Dy、 Mn、 Fe等)。参见例如US-A-4647447、 PCT/GB97/00067、 US-A-4863715、 US-A-4770183 、 WO 96/09840 、 WO 85/02772 、 TO 92/17212 、 PCT/GB97/0(M59 、 EP-A-554213、 US-A-5228"6 、 WO 91/15243、 WO 93/05818、 WO 96/23524、 W0 96/17628、 US-A-5387080、 W0 95/26205、 GB9624918. 0等。还可参见W0 98/47541 (63-66页和70-86页)。
特别优选作为报告分子的是螯合的顺磁金属离子例如Gd、 Dy、 Fe和Mn，特别是当通过大环螯合剂基团螯合时。
一般说来，报告分子可以是(1)含可螯合金属或多原子金属的离子 (即Tc0等)，其中金属是高原子序数金属(例如原子序数大于37)，顺 磁性类(例如过渡金属或镧系元素)，或放射性同位素，(2)共价结合的 非金属类，具有未配对电子位点(例如，持久游离基形式的氧和碳)， 高原子序数非金属，或放射性同位素，(3)含高原子序数原子而显示协 同磁性状态(例如超顺磁性、亚铁磁性或铁磁性)，或含放射性核素的 多原子簇或晶体，(4)生色团(用其涵盖荧光和磷光的种类)，例如，无 机或有机结构，特别是复合金属离子或具有广泛的离域电子系统的有 机基团，或(5)例如由于广泛的离域电子系统而具有阻抗变换特性的结 构或基团。
下面更详细地描述特别优选的净艮告分子基团的例子。 螯合的金属报告分子金属放射性核素、顺磁金属离子、焚光金
属离子、重金属离子和簇离子。
优选的金属放射性核素包括"'Y、 "raTC、 mIn、 47Sc、 67Ga、 "Cr、 '""'Sik
67Cu、 "7Tm、 "Ru、 mRe、 mLu、 mAu、 2"3Pb和"'Ce。优选的顺磁金属离子包括过〉度金属和镧系元素金属的离子(例如
原子序数为6到9、 21-29、 42、 43、 44或57-71的金属)，尤其是Cr、 V、 Mn、 Fe、 Co、 Ni、 Cu、 La、 Ce、 Pr、 Nd、 Pm、 Sm、 Eu、 Gd、 Tb、 Dy、 !!o、 Er、 Tm、 Yb和Lu的离子，特别是Mn、 Cr、 Fe、 Gd和Dy，更特别 是Gd。
金属离子需要通过螯合基团在连接基部分或在颗粒内或颗粒上进 行螯合，(例如小泡或多孔或非多孔的无机或有机固体)，特别是直链、 大环、三联吡吱和N2S2螯合剂，例如DTPA、 DTPA-BMA、 EDTA、 DG3A和 TMT。合适的螯合剂基团的更多例子在US-A-4647"7、 W0 89/00557、 US-A-5367080、 US—A—5364613等中公开。
连接基部分或颗粒可以包含一个或多个这样的螯合剂基团，如果 需要，其被多于一种的金属金属化(例如，以便在不同的成像方式中提 供可检测的报告分子)。
其它合适的螯合试剂残基包括修饰的蛋白质，用于例如在US专利 No. 5078985中描述的锝和铼的金属螯合(其公开在此引作参考)。
将现有的任何螯合剂金属化的方法是本领域技术人员已知的。可 以通过三种常规方法直接结合、；漠板合成和/或金属转移作用中的任 一种将金属结合至螯合剂部分。优选直接结合。
这样，需要金属离子可以很容易地与螯合试剂络合，例如，通过 单纯地将含螯合试剂部分的水溶液^接触或与水溶液(优选pH值在范围4 到11内)中的金属盐混合的方法。盐可以是任何盐，但是优选盐是金 属的水溶性盐，例如面盐，并且更优选选择所述盐，使其不影响金属 离子与螯合试剂的结合。含螯合试剂的部分优选是pH约5到约9，更 优选pH约6到约8的水溶液形式。含螯合试剂的部分可以与緩冲盐， 例如柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐和硼酸盐混合以产生最佳pH。优选选 择緩冲盐，使之不影响随后的金属离子与螯合试剂的结合。
在诊断成像中，媒介物-连接基-报告分子(VLR)结构优选含有在所 述诊断成像应用中有效的金属放射性核素与螯合试剂之比。在优选的 实施方案中，金属离子与螯合试剂的摩尔比为约1:1，000到约1:1。
在放射治疗应用中，VLR优选包含在所述放射治疗中有效的金属离 子与螯合试剂之比。在优选实施方案中，金属离子与螯合试剂的摩尔 比是为约1:100到约1:1。放射性核素可以选自例如，放射性同位素Sc、 Fe、 Pb、 Ga、 Y、 Bi、 Mn、 Cu、 Cr、 Zn、 Ge、 Mo、 Ru、 Sn、 Sr、 Sm、 Lu、 Sb、 W、 Re、 Po、 Ta和Tl。优选的放射性核素包括"Sc、 "Cu、 "Cu、 2'2Pb、 68Ga、 9"Y、 '"Sou 2'2Bi、 '"Re和'"Re。其中特别优选的是9"丫。这 些放射性同位素可以是原子或优选离子型。
下面的同位素或同位素对可以用于成像和治疗，而无需改变放射 性标记方法或螯合剂47Sc2,; 141Ce5" mRe"; mLu71; "9Au79; "SC21;' ;
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和I"; Sm"和Sm62;Y"和 In49。
也可以使连接基部分与多个螯合剂基团偶合。所述多螯合剂连接 基中的螯合剂部分可以通过螫合剂的骨架官能化或通过利用螯合剂的 一种或多种金属配位基团或通过在酸性螯合剂和连接基骨架携带的胺 或羟基之间生成酰胺或醚键而连接，例如在聚赖氨酸-聚DTPA、聚赖氨 酸-聚DOTA和在PCT/EP96/00565中称为放大器的聚螯合剂中。这种聚 螯合剂连接基可以与 一种或多种媒介物基团直接(例如，利用聚螯合剂 连接基中的胺、酸或羟基)共轭，或通过上述的用于单螯合剂连接基的 双官能连接基化合物共轭。
当螯合的种类是被颗粒(或分子聚集体，例如小泡)连接基携带时， 螯合物可以是，例如在颗粒内包裏的未附着的单或聚螯合物(例如 DTPA-BMA或Gd HP-D03A)，或是通过共价连接或通过单/聚螯合物上的 锚固基团(例如亲脂基团)与小泡的膜的相互作用而与颗粒共轭的单 或聚螯合物(参见例如PCT/GB95/02378)。
优选的非金属原子报告分子包括放射性同位素，例如'"I和"'I及非 零核自旋原子，例如"F，和重原子，例如1
所述报告分子，优选其中多个，例如2到200个可以通过直接使用常 规的化学合成技术或借助于负栽基团，例如三碘苯基与连接基骨架共价连 接。
在本发明的一个实施方案中，特別考虑使用碘的放射性同位素。例如， 如果媒介物或连接基由可以在共价键形成反应中被碘化学取代的取代基 组成，例如由含羟苯基的官能团的取代基组成，那么这种取代基可以通过 本领域已知的方法被硤的》丈射性同位素标记。 >喊核素可以在治疗和诊断成 像应用中使用。同时，在相同媒介物-连接基上的螯合试剂中的金属也可 以用于治疗或诊断成像。由于具有上述的金属螯合体，这种金属原子报告分子可以与连接基连
接，或在颗粒连接基例如，在小泡中携带或位于其上(参见WO95/26205和 GB9624918. 0)。
上述类型的连接基与金属报告分子连接一起使用，可以代替某些或全 部螯合体基团，用于非金属原子报告分子，所述非金属原子报告分子带有 非金属原子报告分子或携带了这种"^告分子的基团。
优选本发明的V-L-R试剂具有靶向媒介物的报告分子，所述媒介物直 接或间接与报告分子偶合，例如与碘放射性同位素共价结合，直接或通过 一种有机连接基与金属螯合物附着或与颗粒报告分子或连接基-报告分 子，例如超顺磁性晶体(任选涂覆的，例如参见PCT/GB97/00067),或小 泡，例如含胶束或脂质体的碘化的造影剂偶合。
筒单地说，对于肌I、 X-射线、光成像、核素成像、磁性断层摄影和 阻抗断层摄影，优选以下报告分子
MRI: —般颗粒尺寸小于约80nm，特别是那些尺寸小
于20nm的超顺^兹氧化4失颗粒。特别是被各种涂 料，例如聚电解质、PEG、淀粉，优选水解淀粉 涂覆的氧化铁。也可以使用包括螯合物和颗粒 材料的顺》兹金属物质。
任何光成像报告分子基团u特别注意在近红外 范围有吸收的物质。 放射性螯合物，包含，c或 记的卤素取代基，例如'"I、 "Br的直接标记的媒介物。 上述的超顺磁性氧化铁颗粒。 聚离子类，例如，在重复单元中具有离子基的 聚合物。
本发明的一个优选实施方案涉及通式(I)的放射性标记试剂，特别用 于肿瘤成像。
本发明的诊断试剂可以以用特定成像技术足以产生对比度所需的量 向患者给药，用于成像。当报告分子是金属时，达到足够的对比度增强的 有效剂量通常是每Kg病人体重0. 001到5. Ommol螯合的成像金属离子。 对大多数MRI应用而言，优选成像金属离子的剂量在0. 02到1.2mmol/Kg
光成像 核医学
'In及有放射性标 '"I、 "'I、 "Br或
磁性断层摄影: 阻抗断层摄影:体重范围内，而对于X-射线应用，通常达到X-射线衰减的有效剂量是0. 05 到2. 0mmol/Kg。对于大多数X-射线应用，优选剂量为0. 1到1. 2mmols的 镧系元素或重金属化合物/Kg体重。当报告分子是放射性核素时，通常每 70Kg体重0. Ol到100mCi，优选0. 1到50mCi的剂量就足够了。当报告分 子是超顺磁颗粒时，剂量通常是0. 5-30mgFe/Kg体重。
本发明化合物用于治疗用途的剂量根据待治疗的条件而变化，但通常 是约1pmol/kg-l画l/kg体重
可以使用生理可接受载体或赋形剂，按照本领域熟知的方式配制本发 明化合物用于给药。例如，化合物任选与药物可接受赋形剂一起悬浮或溶 解于含水介质，随后将得到的溶液或悬浮体灭菌。
式I的试剂在疾病状态的治疗上是有疗效的，并且在体内成像中是可 检测的。因此，例如VU化合物的媒介物可能因为例如放射性核素报告分 子的放射治疗效果、发色团(或荧光团)报告分子的光动力疗法或媒介物部 分的化学治疗效杲而具有治疗效力。
因此，可以将式I的试剂在药物组合物的生产以及在人体或非人类动 物体的治疗和预防性治疗方法中的用途视作代表本发明的另 一方面。
另一方面，本发明提供了式I试剂用于生产诊断方法中使用的造影剂 的用途，所述诊断方法包括向生命体施用所迷造影剂并使至少 一部分所述 生命体产生图像。
另一方面，本发明还涉及一种-使具有生命力的人类或非人类(优选哺 乳动物或鸟类)动物体产生图像的方法，包括向所述研究对象的例如血管 系统内施用造影剂，并通过例如X-射线、MR、超声、闪烁扫描、PET、 SPECT、 阻抗、光或磁量成像形式，使分布所述造影剂的至少一部分所述生命体产 生图像，其特征在于将式I试剂用作所述造影剂。
另 一方面，本发明提供了一种监控使用药物治疗人类或非人类动物体 以对抗与血管生成有关的症状，例如细胞毒性试剂的效果的方法，所述方 法包括向所述研究对象施用式I试剂，并检测所述试剂被内皮细胞报告分 子，特别是a、f3报告分子的吸收情况，所述施用和检测任选但优选重复 进行，例如在使用所述药物进行治疗之前、过程中和之后。
另一方面，本发明还提供了一种式I试剂的制备方法，所述方法包括 将媒介物V与在诊断成像过程中可检测的化合物或螯合化合物共扼，并且
.i》螯合剂的基团金属化。
另一方面，本发明还提供了一种用于治疗的式I试剂的制备方法，所 述方法包括将媒介物V与化合物结合，以在疾病状态的治疗上有效。
本发明的报告分子可以使用所有已知的化学合成方法合成出来，但特
别有用的方法是使用肽自动合成器的Merrifield的固相法 (J. Am. Chem. Soc. ， 85:2149 (1964))。含多个二硫桥的报告分子可以使用 不同的半胱氨酸保护基团合成，使^f寻报告分子的最终折叠形式不存在双关 性(ambiguity)。肽和肽螯合物可以使用高效液相色镨(HPLC)纯化，并且 在体外筛选测试之前通过质谱和分4斤HPLC表征。
以下是一系列非限制性的实施例。
实施例1:化合物1的合成
锝螯合物-Pn216的合成
a) 氯-亚硝基中间体(3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷)
搅拌2-甲基丁-2-烯(18. 5ml)和硝酸异戊酯(19. 5ml)的混合物，冷却 至-1(TC并小心地加入浓盐酸(17. 5ml)，保持温度^f氐于G。C。在此温度下 搅拌反应混合物30分钟。通过过滤收集形成的沉淀，用4 x 5ml乙醇(-2() 'C)洗涤并真空干燥，得到白色固体状的3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷。
b) Pn216-(3， 3， 11， 11-四甲基-7-氨乙基-4， 7， 10-三氮杂十三碳烷 -2， 12-二酮二肝)
向三-(2-氨乙基)胺的乙腈(20ml)溶液中加入/疾酸氪钠(2. 2g, 26,ol)。在G。C下緩慢加入3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷(l. 8g， 13ramo1) 的干燥乙腈溶液。在室温下搅拌反应混合物4小时并随后过滤。用乙腈洗 涤滤出物并蒸发滤液。将粗产物溶于乙腈并使用HPLC纯化，得到Pn216。 0. 88g，收率19%。c) Pn216-琥珀酸中间体的合成
琥珀酸酐(IOO) Pn216 (358) 四氟笨石克朌(182) DCCI (206)
将Pn216 (G. 5g, 1. 4tnffio1)溶于D膨(5ml)并在搅拌下分几份加入溶于 画F(l()ml)的琥珀酸酐(O, G15g, 1.5mmol)。搅拌反应混合物16小时，使 其完全转化为所需产物。通过HPLC色谱法以较好的收率得到纯酸。
d) Pn216-琥珀酸衍生的四氟^琉酚酯的合成
MTU[O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1， 1， 3， 3-四甲基脲镞六氟磷酸 盐]-Mwt = 380
Pn216-NH-CO-(CH2) 2-C00H-Mwt =458 N塵-N-曱基吗啉-Mwt = 101 TFTP-四氟苯妓L酚-Mwt = 182
向Pn216酸(lOmg， 0. 022mmol)的！)MF(l. 0ml)溶液中加入HATU (8. 3mg， 0- 022mmol)和N丽(O. 07ml, 0. 066mmol) D搅拌混合物5分钟并随后加入TFTP(O. 022画1， 4mg)。搅拌溶液30分钟并随后用20%乙腈/1!20 (3rol)稀 释反应混合物，并用反向色谱纯化产物，得到6mg所需产物，随后冻干。 e)带有连接了 Cys2和4; Cys8和10的二硫键的肽媒介物 NH2-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-0H的合成
<formula>formula see original document page 22</formula>
使用l,ol-氮#1酸药筒，以0. lmmol的量级4吏用Fmoc-Gly wang树脂 (Novabiochem)为原料，在ABI 433A肽自动合成器上合成肽。使用三苯甲 基保护对半胱氨酸残余2和4进行S-保护，同时使用乙酰氨基甲基(Acra) 保护对8和1G进行保护。在偶合之前，使用HBTU将氨基酸预活化。在含 TIS(5%)、 1120(5%)和苯酚(2. 5%)的TFA中,从树脂上同时除去肽和侧链 保护基(除了 Acm)，该除去过程进行2小时。
上迷处理之后，得到部分保护的粗肽100mg(分析HPLC:梯度，经20 分钟0-3()°/ 的B，其中A = H20/0. 1%TFA和B = CH3CN/0.监FA;柱，VYDAC CI8 218TP54;检测，UV 214rnn;产物保留时间，16.7分钟)。随后，经制备 HPLC VYDAC柱纯化粗产物(25mg)的等分试样，得到12. 5mg纯化的部分保 护的肽。
通过将纯中间体溶于20ml2. 5%的DMS0/TFA溶液，在Cys2和Cys4之 间形成笫一个二硫键。40分钟后，出现了一个对应氧化产物的新峰 随 后向肽溶液中加入苯甲醚(O. 02ml)，并将溶液升温至6(TC， 50分钟。随 后真空下除去过量的TFA，加入乙醚以沉淀出产物。进行后续的制备HPLC 步骤，收集纯产物并冻干。使用MALDI-TOF分析确定分子量，并与其它两 种可能的二硫化物异构体一起注入，以确i人一致性。
f)化合物1的合成
将上述步骤e)得到的肽与上述步骤d)到的Pn216活性酯以1: 2的比 例(w: w)—起溶于DMF。将反应混合物搅拌两天，并用水稀释混合物，通 过反向HPLC纯化所需产物。实施例2: [CySH'"'"]类似物
a) 合成 C1CH2C0—Lys—Asp—Cys-Arg-Gly—Asp—Cys(tBu)一Phe-
Cys (tBu)-Gly-Gly-OH
〇H
使用lminol氨基酸药筒，以0. 25mmol的量级使用Fmoc-Gly wang树 脂(Novabiochem)为原料，在ABI 433A肽自动合成器上合成肽。在偶合之 前，使用HBTU将氨基酸预活化。使用氯乙酸酐的l)MF溶液进行最终的N-末端氯乙酰化3()分钟。
在含TIS (5%) 、 H20 (5%)和苯酚(2. 5 %)的TFA中，从树脂上同时除去 肽和侧链保护基(除了 tBu)，该除去过程进行2小时。
上述处理之后，得到粗肽260rag(分析HPLC:梯度，经10分钟5-50% 的B，其中A = H20/0、 IOTA和B = CH3CN/G, 1订FA;柱，Phe廳enex Luna 3 fi CI8 (2) 50x4. 6mm;流速，2ml/min,检测，UV ,14mn;产物保留时间， 6.5分钟)。使用质谱对产物进行进一步的表征预计，M+H位于1348.5， 实测，位于1348. 5)。
b) 合成环[CH2CO-Lys-Asp-Cys ] -Arg-Gly-Asp-Cys (tBu) -Phe-
Cys (tBu)-Gly-(;ly-OH将 lOOmg C1CH2C0-Lys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys (tBi^-Phe-CysUBu)-Gly-Gly-OH 溶于水/乙腈。使用氨水将混合物调节至pH8并搅 拌24小时。
上述处理之后，得到粗肽26()mg(分析HPLC:梯度，经1()分钟5-50% 的B，其中A = H20/0. 1订FA和B = C仏CN/(). 1%TFA;柱，Phei]omenex L簡3 p C18 (2) 50x《6mm;流速，2ml/min，检测，UV 214nm;产物保留时间， 6. 32分钟),，使用质语对产物进行进一步的表征预计，M+H位于13〗2. 5， 实测，位于1312. 6)。
c)合成[Cys7—9 ]环[CH2C0-Lys-Asp-Cys ] -Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-
Cys-Gly-Gly-Oil和Pn216-琥珀酸的共扼
<formula>formula see original document page 24</formula>
用苯甲醚(200 ;i 1) 、 l)MS()(lml)和TFA(50ml)的溶液处理400mg环 [CH2CO—Lys—Asp—Cys]—Arg—Gly—Asp—Cys (tBu) —Phe—Cys (tBu) —Gly—Gly-O H，随后真空下除去TFA并通过加入乙醚将肽沉淀出来。
使用0-30%B，其中A = H2O/0. 1。/dTFA和B = CH3CN/0. 1订FA,以10ml/ 分钟的流速，经40分钟对粗原料(40mg)进行制备性HPLC( Phenomenex Lima 5p C18 (2) 250x21. 20mm)纯4匕。冻干后得到14. 3mg纯物质(分析 HPLC:梯度，经IO分钟0-30%1 ，其中A = H2O/0. 1°/ TFA和B = 1%TFA; 柱，Phe廳e認L醒3p C18 (2) 50x4. 6mm;流速，2iol/min,检测，UV 214nm;产物保留时间，6. 10分钟。使用质谱对产物进行进一步的表征 预计，M+1I位于1198. 4，实测，位于1198.5)。
d)〖Cys"]环[C一Lys-Asp-Cys ] -Arg-G1 y-Asp-Cys-Phe-<formula>formula see original document page 25</formula>将〖Cys ]环[CH2C0-Lys—Asp-Cys ] -Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-0H、 Pn216螯合物活性酯和N-甲基吗啉溶于DMF。搅拌混合 物直至通过RP-HPLC监测观察到共扼完成。通过制备性RP-HPLC对反应混合物进行纯化，得到纯物质，随后冻干。 使用RP-HPLC和质语对产物进行表4正,，
权利要求
1. 通式(I)的化合物其中r＝0或1p＝0或1且r+p＝1当r＝0时，R1是-(CH2)n-CO-或-(CH2)n-C6H4-CO-，其中n＝1、2、3、4或5，当r＝1时，R1是半胱氨酸，其中R1和X2之间的桥含有硫醚或二硫键，X1＝1或2个氨基酸，或碳水化合物部分发生衍生的氨基酸，或被间隔基或连接基和/或螯合物官能化的氨基酸，所述螯合物连接或能够连接金属放射性核素，X2和X4分别独立地是半胱氨酸、高半胱氨酸、天冬氨酸或赖氨酸，X3是精氨酸、N-甲基精氨酸或精氨酸模拟物，X5是疏水氨基酸，X6是能够形成环状键的氨基酸，X7是一个键或1或2个氨基酸，或间隔基或连接基，任选被如X8定义的多种螯合物标记，并任选含有一个或多个乙二醇单元或任意的其它间隔基成分，以及X8是连接或能够连接适于体内成像的金属放射性核素或其它任意报告分子的螯合物，或是-NH2或不存在，q是0、1、2、3、4、5、6、7或8，以及一个桥(在R1和X2之间或X4和X6之间)含二硫键。
2. 权利要求l的化合物，其中R,是半胱氨酸u
3. 权利要求l的化合物，其中X,是半胱氨酸或高半胱氨酸。
4. 权利要求1的化合物，其中Xs是苯基丙氨酸、酪氨酸、捵酪氨酸、二碘酪氨酸或萘基丙氨酸。
5.由下式II定义的权利要求1的化合物，<formula>formula see original document page 3</formula>(工工)其中Cys-半胱氨酸 其中X,，是l、 2或3个氨基酸，所述氣基酸选自天冬氨酸、酪氨酸、酪氨 酸-天冬氨酸、赖氨酸或乙酰基-赖-氮酸， X3如权利要求1定义；Xs，是苯基丙氨酸、酪氨酸、3-碘-酪氨酸或萘基丙氨酸； V是一个键、甘氨酸、或O-双(氨乙基)乙二醇间隔基；和 X8，是与金属放射性核素连接的螯合物，其中螯合物的结构是或这些螯合物的其它N,S或双-肝类型，以及 如式II所示， 一个桥包括硫键，另一个桥包括二疏键。
6. 权利要求5的化合物，其中X,，是天冬氨酸、酪氨酸、酪氨酸-天 冬氨酸、赖氨酸或乙酰基-赖氨酸。
7. 权利要求5的化合物，其中X,，是甘氨酸。
8. —种药物组合物，其含有增强在体内成像中的图像对比度或治疗 的有效量的权利要求1定义的式I化合物或其酸加成盐以及一种或多种药 理可接受的助剂、赋形剂或稀释剂。
9. 权利要求1定义的式I化合物在生产用于人类或非人类动物体的 治疗或预防中的药物组合物和/或在生产用于诊断方法中的造影剂的用 途，所述诊断方法包括向所述生命体施用所述造影剂，并使至少一部分所 述生命体产生图像。
10. —种权利要求1定义的式I化合物的制备方法，所述方法包括将 媒介物V与在诊断成像过程中可检测的化合物或螯合剂化合物共轭，并且 在需要的情况下用诊断成像过程中可检测的金属离子将所得共辄物中螯 合剂的基团金属化。
全文摘要
本发明涉及新的肽基化合物，及其在医疗上有效治疗以及用于诊断成像技术的用途。更特别的是，本发明涉及所述肽基化合物用作与血管生成相关的受体，特别是αvβ3整合素受体结合的靶向媒介物的用途。这种造影剂因此可以用于诊断，例如恶性病、心脏疾病、与炎症相关的疾病、风湿性关节炎和卡波济氏肉瘤。并且所述化合物也可以用于这些疾病的治疗。
文档编号A61P17/00GK101531704SQ200810190778
公开日2009年9月16日 申请日期2001年9月25日 优先权日2000年9月26日
发明者A·库斯伯特森 申请人:通用电气医疗集团股份有限公司