专利名称：一种表达HSA-vMIP-Ⅱ融合蛋白的酵母表达体系及其构建方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种能够高效表达HSA-vMIP- II融合蛋白的酵母表达体系及其构建方法。
背景技术：
卡波氏肉瘤(Kaposi’ s sarcoma，KS)是一种血管多发性肿瘤，常见于免疫缺陷病的患者。自从AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome)流行以来，KS己成为非洲地区最常见的肿瘤之一。对KS或可能患有KS的高危人群进行活检，发现了卡波氏肉瘤病 # (Kaposi's sarcoma-associate herpsvirus, KSHV) WSSiIDNA,
毒8 (HHV8)，表明KSHV参与了 KS的病理发生过程。卡波氏肉瘤病毒是HIV感染者或移植病人用免疫抑制剂后常发生的Kaposi肉瘤的病原体。此病毒共有80余个基因，其K6和K4基因分别编码一个类似于人单核细胞炎性蛋白-Ia (MIP-Ia)的蛋白产物病毒巨噬细胞炎症蛋白I (viral macrophage inflammatory protein-I，vMIP-I)和病毒巨噬细胞炎症蛋白 II (vMIP- II),vMIp- I 由 289 bp的开放阅读框(ORF) K6基因编码，蛋白分子大小为10. 5 KDa,与hMIP_l β的氨基酸序列同源性为37. 9%, vMIP- II是由ORF K4基因编码的10. 5KDa蛋白，与hMIP-la的氨基酸序列同源性为41. 1%，vMIP-I和vMIP- II的同源性为48%，两者的基因序列有70%的一致性， 而另一种vMIP- III与两者基因相比只有37%的同源性。vMIP- II全基因编码94个氨基酸，成熟蛋白为74氨基酸，与人的MIP同源性高达 41%，其中8种非极性氨基酸占40%，具有较强的疏水性。vMIP- II蛋白与人类的CC类趋化因子在氨基酸序列上有较高的同源性。vMIP- II蛋白的二级结构和折叠方式与趋化因子有相同之处，但也存在差异，即使在较高的浓度水平上也呈单体结构，正是这种单体结构使它能够采取任何一种二聚体形式与细胞表面的受体结合，从而解释了它与趋化因子受体之间有交叉连接关系。vMIP- II N末端的受体结合部位高度无序，在保守的半胱氨酸区有带正电荷的氨基酸残基，而CC类趋化因子通常有疏水性或中性氨基酸残基，这一区域对CC类趋化因子二聚体形成起着重要作用，从而说明vMIP- II缺乏二聚体结构的原因。vMIP- II与趋化因子受体结合区域主要是非典型区域，这一区域主要包括两个部位参与受体的结合及活化一个是蛋白N末端的近8 10氨基酸残基，另一个是N — loop环。vMIP- II三维结构是通过2个二硫键和由β片层、C端超螺旋结构形成的疏水核团来维持。vMIP- II蛋白可以广谱地结合CC和CXC两类趋化因子家族受体，如CCRl、CCR2、CCR3、CCR5、CCR8、CCR10、 CXCR4、CX3CR等10余种趋化因子受体。用来源于vMIP- II N末端的Vl肽段对vMIP- II结构和功能进行研究，结果表明，Val-I、Arg-7、Lys-9残基对vMIP- II结合CXCR4受体起重要作用。因此vMIP- II蛋白不仅能够通过与趋化因子受体结合在免疫炎症病理反应中发挥作用，而且还可以作用于免疫细胞上的趋化因子受体，通过激动或拮抗受体来调节免疫细胞的功能，在HIV感染/艾滋病和移植排斥反应等方面有更多的研究应用价值。vMIP- II能与作为HIV感染的辅助受体的趋化因子受体结合，干扰HIV的gpl20与辅助受体的结合而可以抑制HIV的感染。试验证实，对于HIV-I病毒89. 6株(可以广泛的利用辅助受体CCR3、 CCR5、CXCR4进行感染)，vMIP- II可以具有与RANTES和SDF-Ia相同或者稍差的阻断其利用 CCR5和CXCR4受体的作用。进一步研究证实，vMIP- II结合CCR5的结合部位和分子机制不同于RANTES (CCL5)和MIP-I α，并具有更高的结合常数。利用NMR研究认为，νΜΙΡ- II是在单体状态下发挥作用的。已有报道，克隆表达的νΜΙΡ- II具有野生型νΜΙΡ- II的活性。CCR8也是HIV感染的辅助受体之一，尤其在脑组织和淋巴组织的感染过程中， νΜΙΡ- II也可以通过结合CCR8而抑制HIV感染这些组织的细胞。HIV感染机制中辅助受体扮演的角色，为抗HIV治疗提供了新靶点。在能够介导体外HIV-I进入细胞的众多趋化因子受体中，CCR5和CXCR4有药理学意义。以CCR5、CXCR4为靶向的抗病毒治疗在疾病各阶段都有作用，R5株是最常传播的毒株，主要出现于疾病无症状期，因此针对CCR5的抗病毒治疗宜在早期进行，而X4株主要在疾病发展晚期，象征疾病进展，所以针对CXCR4的治疗主要在疾病晚期有效。目前采用的能够阻断CCR5和CXCR4的主要方案有以下三种一是对那些CD8 + T细胞不能产生足够趋化因子者人为地给予更多的趋化因子；二是开发能直接阻断辅受体结合位点的药物；三是将缺失性CCR5基因用于干细胞移植。生物技术的发展极大地促进了多肽/蛋白药物的研发，截止2004年2月，美国FDA 批准了 64种重组多肽/蛋白类治疗药物上市。药代动力学研究表明多肽/蛋白类药物主要通过降解、排泄、以及受体介导的内吞等作用在体内被清除。其中分子量小于20KDa的多肽因子在代谢过程中易被肾小球滤过，通过肾小管时多肽因子又被其中的蛋白酶部分降解并从尿中排出，因而半衰期短。以β干扰素为例，肌肉注射的体内半衰期一般在2h-4h左右，即使大剂量给药六个半衰期(24h)后，其血药浓度已无法达到抑制病毒复制的目的。为了达到的治疗效果，需要频繁的大剂量用药，长期的频繁注射不仅增加了病人的痛苦和治疗费用，而且易引发一系列严重的毒副作用。长效多肽/蛋白类药物的开发已成为对第一代基因工程多肽/蛋白药物进行二次开发的重要方向。目前延长蛋白药物半衰期的主要基于增大蛋白药物的分子量，减少肾小球滤过率，减少异源蛋白的免疫原性，从而减少其体内清除率，持续缓慢释放维持药物浓度，延长药物作用时间等三个方面考虑。常用技术有制备缓释制剂、构建突变体、化学修饰以及基因融合等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够高效表达HSA-vMIP- II融合蛋白的酵母表达体系。本发明通过以下技术方案实现上述目的
一种表达HSA-vMIP- II融合蛋白的表达体系，由质粒pPICZaA-HSA-vMIP- II转化至巴斯德毕赤酵母(pichia pastorid)得到。所述质粒pPICZaA-HSA-vMIP- II来源于含有质粒pPICZaA-HSA-vMIP- II的大肠杆菌 DH5a。所述巴斯德毕赤酵母菌株优选为酵母菌X33。上述表达体系的构建方法，是从含有质粒pPICZaA-HSA-vMIP- II的大肠杆菌中提取重组质粒，对重组质粒进行线性化，利用电转化方法转化巴斯德毕赤酵母菌感受态细胞，经抗性筛选后，PCR鉴定得到阳性克隆，利用阳性克隆子进行诱导表达，对表达产物进行 SDS-PAGE分析，Western-Blot鉴定，获得表达体系。上述质粒的构建方法为
上述质粒pPIC ZaA-HSA-vMIP- II来源于含有质粒pPIC ZaA- HSA- νΜΙΡ- II的大肠杆菌 DH5a。上述构建方法中，PCR是以重组酵母的基因组为模板，两种不同的引物分别扩增， 第一组上游引物序列如SEQ ID NO: 1所示，下游引物序列如SEQ ID N0:2所示，第二组上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物序列如SEQ ID NO: 4所示。上述对重组质粒进行线性化使用的限制性内切酶为/^e I。所述电转化的参数优选为电压1. 5kV，电容25PF，电阻200 Ω ；电击时间为4 10 秒，电击一次。所述表达系统的表达产物HSA- νΜΙΡ- II融合蛋白。HSA- νΜΙΡ- II融合蛋白在制备抑制外周血单个核细胞药物中的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果如下
(1)使用毕赤酵母(pichia pastorid)表达系统。与原核表达系统相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有如下特点首先，酵母是真核生物，可以使某些蛋白的糖基化更加稳定，进行翻译后修饰，例如正确的二硫键的形成和信号肽的去除，N—结合和0—结合的糖基化修饰；其次，酵母具有单细胞微生物结构，具有细菌系统的快速生长和易于基因工程操作等优点；与大肠杆菌相比，酵母没有内毒素，没有溶源性病毒，且酵母和人类关系密切，无致病性，长久以来被用于面包和制酒工业。酵母也是一个理想的分泌表达系统。通常酵母培养基中没有蛋白质的加入，正常的酵母分泌蛋白仅为酵母细胞总蛋白的0. 5% ；它还能把产生的外源蛋白质分泌到培养基中，便于产品的分离纯化，这能在很大程度上降低成本。对于那些需要翻译后正确折叠、自然分泌的蛋白质，以及胞内不稳定或有毒性的外源蛋白，很适合在此种分泌型的表达系统中表达。毕赤酵母系统得以广泛应用，原因在于该系统具有以下几个优点(1)极高的表达产量，该系统采用甲醇诱导的启动子，单拷贝乙醇氧化酶基因在该启动子驱动下可产生细胞总可溶性蛋白量的30%乙醇氧化酶，将该启动子引入表达载体以驱动外源基因的表达。正如预料那样，一些外源基因在该系统中得到极高水平的表达。如破伤风毒素C片段的表达产量达12克每升，该结果使得基因工程技术生产重组蛋白能力从毫克级越升至克级。(2)高密度生长，在70年代，毕赤酵母用于制备单细胞蛋白，由此产生毕赤酵母的发酵技术，可达每升培养物100克干细胞。(3)高水平分泌在无蛋白培养基中，该表达载体带有酿酒酵母a因子信号肽，能将表达产物分泌到胞外。用于表达培养基包括一些无机盐、微量元素、生物素和碳源，且无毒素和致热源，这样，分泌的表达产物极易纯化。(4)毕赤酵母的糖基化形式更加接近于哺乳动物，表达产物N-结合的甘露糖一般只有(8 14)个，而酿酒酵母中多达(50 150)。而且这些产物不象酿酒酵母中包含末端a-1，3-甘露糖的结合，这种修饰会造成免疫遗传性。(5)质粒稳定性好，毕赤酵母本身并无质粒，允许表达组件串联重复，而且适于整合到染色体上表达外源基因。报道表明，乙肝表面抗原从摇瓶转到发酵罐后，仍维持单细胞的产率，而且它的多拷贝整合子保持了 150 代也未丢失。(6)分泌产物通透性好，酿酒酵母中由于过度糖基化，造成每个N—结合的寡糖链上均有很多的甘露糖残基，进一步影响到通透性。一般分子量超过20KDa的外源蛋白都不能分泌到培养液中，毕赤酵母则不存在此现象，其体内具有一套和真核生物极其相似的分泌途径，从内质网经高尔基体、囊泡分泌到体外。分子量超过50KDa的转向酶和人血清蛋白均能分泌到胞外，且表达量都在lg/L的水平。因此毕赤酵母是当前较为理想的外源基因表达系统，非常适合于基因工程产品的研制和开发。另外，毕赤酵母用甲醇为唯一的碳源，被O2氧化得到甲醛和过氧化氢，催化酶为醇氧化酶(alcohol oxidase，简称AOX )。毕赤酵母体内有两种醇氧化酶，分别命名为AOXl和 A0X2。醇氧化酶对O2的亲和性很弱，所以毕赤酵母需要产生大量的该酶来补偿甲醇代谢。 当以甲醇为唯一碳源时，AOXl起主要作用，产生的醇氧化酶超过30%的总可溶蛋白，此种菌株的表型命名为Mut+ (Methonal utlization slow)。到目前为止国内外已有多家实验室利用此系统进行了许多成功的表达，表达的蛋白种类涉及到酶、抗原、抗体、调控蛋白、膜蛋白、蛋白酶和蛋白酶抑制剂等。其中包括牛溶菌酶(0. 55g/L )、人血清蛋白(3g/L)、人表皮生长因子(0. 4g/L )和鼠表皮生长因子(0. 45g/L )。毕赤酵母体内具有一套和真核生物极其相似的分泌途径，从内质网经高尔基体、 囊泡分泌到体外。影响分泌表达的因素很多，如表达载体、宿主菌、基因剂量、Mut表型、表
达产物的产量和质量等。毕赤酵母表达系统的产生和广泛应用，对生物技术产业的发展己产生十分重要的影响。一些产品如细胞因子类、疫苗类及其他生物试剂已进入临床试验阶段。毕赤酵母表达的乙肝疫苗也已进入了市场。随着菌株及载体等方面的进一步完善，毕赤酵母定能成为主要的外源基因表达系统，发挥其优势。(2)本发明使用PPICZaA质粒，其信号肽来自酿酒酵母的α-交配因子 (a-factor)，并且作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它还拥有一个特点是其具有 Zeocin抗性标记基因，给我们筛选转化子的工作带来很大的便利。pPICZaA质粒是作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它的主要特点如下⑴具有强效可调控启动子AOXl (alcohol oxidase,醇氧化酶)；⑵具有Zeocin抗性筛选标记基因，重组转化子可直接用 Zeocin进行筛选，即在YPDZ平板上生长的转化子中，100%都有外源基因的整合，大大简化了重组转化酵母的筛选过程。在操作过程中，Zeocin也可用来筛选含表达载体pPICZ α A的大肠杆菌转化子，不必另外使用Amp，经济而又简便；⑶在表达载体AOXl 5’端启动子序列下游，有供外源基因插入的多克隆位点，多克隆位点下游有AOXl 3’端终止序列；(4)分泌效率强的信号肽α-factor。(3)本发明将人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)与vMIP-II进行融合表达。HSA是血浆的重要成分，也是许多内源因子和外源药物的载体，正常情况下不易透过肾小球，它是由585个氨基酸残基组成的蛋白质，其分子量约为66. 5KDa,在血浆中的半衰期较长，长达2周体内分布极广而且没有酶学和免疫学活性(可抵御生物体内酶的作用)。同时，HSA是一个稳定的惰性蛋白，蛋白药物与其融合后可以提高药物的稳定性，延长蛋白药物在体内的半衰期。其表达水平较高，与其融合后可以提高目的蛋白药物的表达水平，因而是一种理想的生物活性蛋白载体。(4)本发明表达体系得到的HAS-vMIP- II融合蛋白，不但保留了 νΜΙΡ- II的功能，同时还使其在血浆中的半衰期得到了显著延长，可以降低给药频率和剂量，但发挥出与 vMIP- II相似的药效作用。
图 1 抽提载体线性化电泳图，1. DNA ladder marker, 2. pPICZaA-HSA-vMIP- II ； 图2 阳性克隆子基因组DNA PCR后电泳图，1为HSA-vMIP(1.4kb)，2为重组质粒
pPICZaA-HSA-vMIP- II，3 为质粒 pPICZaA, 4 为 DL2000 Marker, 5 为 HSA-vMIP (240bp)，6 为重组质粒 pPICZaA-HSA-vMIP- II，7 为质粒 pPICZaA ；
图3 诱导表达上清经TCA浓缩后电泳图，1.表达上清，2. Marker ； 图4:融合蛋白Western-Blot鉴定图，1.阴性对照，2.目的蛋白条带； 图5 盐析(硫酸铵沉淀法浓缩)梯度浓缩图，1. 30%饱和度，2. 40%饱和度，3. 50%饱和度，4. 60 %饱和度，5. 70%饱和度，6. 80%饱和度，7. Marker，8.表达上清；
图6 诱导表达上清经M亲和柱纯化的记录图，其中紫外吸收曲线上右侧的小峰为目的蛋白峰，左侧的吸光度较高的峰为上清中其他成分的吸收峰；
图7 :目的蛋白经纯化后电泳图，1. Marker, 2.纯化后目的蛋白； 图8 =Bradford法测蛋白含量的标准曲线图； 图9 :HSA-vMIP- II对PBMC的趋化抑制曲线图。
具体实施例方式以下实施例中使用的材料及试剂为质粒pPICZa A (购自Invitrogen)；含有质 SpPICZaA- HSA-vMIP- II的大肠杆菌DH5 a ；酵母菌X33。hMIP — 1β趋化因子购自 Peprobiotech ；RPMI1640购自美国GIBCO ；hMIP-1 β购自英国P印rotech公司；淋巴细胞分离液购自天津TBD公司；EB替代物、限制性内切酶fee I购自鼎国生物；限制性内切酶 ^coR I、限制性内切酶损a I购自TAKARA BIO INC。实施例1 HAS-vMIP- II酵母表达体系构建
1.碱裂解法从大肠杆菌中提取含目的基因的质粒
(1)培养重组质粒pPICZaA-HSA-vMIP- II转化的大肠杆菌DH5 a，菌体的收获将
I.5ml菌液倒入微量离心管中，12000g离心30秒，吸去培养液。上清要务必吸取干净，否则会影响质粒的质量。必要时可以离心2次。(2)将菌体沉淀重悬于100 μ 1用冰预冷的溶液I中(溶液I配制50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-HCl / 10 mM EDTA, pH 8.0 ；高压灭菌后于 4°CC存)，加入 1/50 体积 RNase A贮存液，剧烈振荡，使之完全分散。葡萄糖可以由NaCl代替，以利于储存；提取大于15kb 的质粒，应将细菌悬于等渗蔗糖溶液中，并用溶菌酶处理；务必使细菌沉淀完全分散，以利于碱液作用充分；震荡时可以在离心管中加入牙签或枪头，提高效率；配制RNase A贮存液时，煮沸时间不宜过长或过短；溶液I每2个月重新配制1次。(3)加200 μ 1溶液II (溶液II配制0. 2Μ NaOH / 1% SDS,新鲜配制)，轻微颠倒混勻5次，在冰上放置5min。若菌体裂解得充分，则溶液会变得很粘稠；不要剧烈震荡，否则会混入基因组DNA ；每2个月重新配制1次。(4)加150 μ 1用冰预冷的溶液IIK溶液III配制5mol/ L乙酸钾60ml，冰乙酸
II.5ml，水28. 5ml)，轻微震荡混勻10次。所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/ L，pH4. 8左右；尽量不要有大的块状沉淀，以利于下步离心；每1个月重新配制1次，并分装贮存于小口瓶中。(5) 12000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。(6)在上清中加入等体积的氯仿(预冷)，颠倒混勻后，室温静置5min。12000g离心 5 lOmin，小心吸取上清液。(7)在上清加入2倍体积无水乙醇(预冷)，12000g离心5 lOmin，去上清。此时沉淀即为质粒DNA。(8)加入Iml 70%乙醇(预冷)洗涤DNA沉淀，离心，小心吸去上清。为洗涤充分， 可以洗2次。(9)在空气中静置3 10min，待沉淀干燥后，溶解于50μ 1 TE中。2.毕赤酵母菌感受态细胞的制备
(1)首先对保种的酵母菌Χ33进行平板培养，待长出单菌落，挑取酵母单菌落，接种至含有IOml YPD液体培养基的50ml三角瓶中，30°C、200r/min培养过夜；
(2)取100-500μ1的培养物接种至含有IOOml新鲜培养基的三角摇瓶中，2纩30°C、 200r/min培养过夜，至0D600达到1. 3 1. 5 ；
(3)将细胞培养物于4°C，1500g离心5min，用IOOml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重
悬；
(4)按步骤3离心，用IOOml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
(5)按步骤3离心，用20ml的冰预冷的Imol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；
(6)按步骤3离心，用0.4ml的冰预冷的Imol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为0. 6ml，将其分装为150μ1 —份的包装。3.线性化DNA电转化
首先培养重组质粒pPICZaA-HSA-vMIP- II转化的大肠杆菌，从中提取重组质粒(提取质粒的方法如前所述)，并利用限制性内切酶I进行酶切Ih使其线性化。酶切体系 pPICZaA-HSA-vMIP- II (200ηδ/μ1) 10 μ ，限制性内切酶/^e I (10 unit/μ ) 2 μ , L Buffer (IOX) 4 μ , dd H2O 14 μ 。将线性化DNA溶解在TE溶液中，与上述步骤6所得的菌体混勻，转至0. 2cm冰预冷的电转化杯中，电转化杯冰浴5min，根据电转化仪提供的资料，确定合适的电转化参数， 优选为电压1. 5kV,电容25PF，电阻200 Ω，电击时间为4 10msec，电击一次。电击完毕后，加入Iml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混勻，转至1. 5ml的EP管中。将上述电击后的表达宿主X33感受态细胞至于30°C环境下lh，然后将悬液涂布于含有Zeocin的YPD平板上 ((YPD平板培养基配制蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，加蒸馏水至 1000ml, 121°C高压灭菌20min)。将平板置于30°C培养2 3天，直至单个菌落出现。4.阳性克隆子的筛选
电转后的表达宿主X33感受态细胞在YPD平板上培养经Zeocin抗性筛选长出约10个克隆，这些克隆就是巴斯德毕赤酵母X33转化子。挑取在YPDZ上长出的单菌落接种于3ml 含Zeocin的YPD液体培养基中，30°C、180 200rpm/min摇床培养2 3天(YPDZ培养基配制YPD平板培养基加入Zeocin 100ug/ml)。5.酵母基因组PCR鉴定阳性克隆子 (1)提取酵母基因组DNA将变混浊的YPD (含Zeocin)液体培养液，室温离心收集菌体于1. 5mL Ep管中，用灭菌水洗涤一次后再用0. 5mL的SCE溶液悬浮菌体，并添加1 μ 1浓度为200mg/mL的蜗牛酶和10 μ 1巯基乙醇，370C 200r/min振荡处理Ih后离心去上清。沉淀的菌体用0. 5mLTris/ EDTA(含 50mmol/L Tris-HCL, 20mmol/L EDTA)重新悬浮并添加 50 μ 1 10%SDS，65°C处理 20min。加入200 μ 1 5mol/L的KAc，倒置混勻后放冰上30_60min。室温离心并将上清转移至一新的离心管中，加入约ImL预冷的无水乙醇，室温离心5 min，倒去上清后倒置挥干DNA 沉淀。所得的DNA用30 μ 1的TE重新溶解并加入适量的RNase消化。37°C保温Ih降解 RNA。 (2)0.8%琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶的制备称取琼脂糖0. 16g，加入10倍TAE电泳缓冲液20ml，在电炉上加热溶解，配制成0.8%琼脂糖凝胶，稍凉后加入EB替代物1μ 1。将琼脂糖凝胶溶液倒入电泳模板，插入梳子。冷凝后将梳子拨出，电泳胶放入电泳槽中。取样品溶液20μ1，将溶液加到样品孔中，同时在另一样品孔中加入标准分子量DNA。一般DNA样品最好控制在0. 5 1. Oyg之间。加入TAE缓冲液，通电维持电压100V，电泳至胶中下部时停止电泳。电泳完毕，于紫外灯下观察，DNA存在的位置呈现荧光。5. PCR鉴定转化子
以重组酵母的基因组为模板，两种不同的引物分别扩增。第一组引物上游引物序列FP如SEQ ID NO: 1所示，下游引物序列RP如SEQ ID NO:2所示，预测扩增片断L4kb。第二组引物上游引物序列FP如SEQ ID NO: 3所示，下游引物序列RP如SEQ ID NO:4所示，预测扩增片断240bp。PCR反应体系在冰浴中，按下表1顺序将各成分加入一无菌0. 5ml离心管。表 权利要求
1.一种表达HSA-VMIP- II融合蛋白的表达体系，由质粒pPICZaA-HSA-vMIP- II转化至巴斯德毕赤酵母得到。
2.权利要求1所述的表达体系，其特征在于所述质粒pPICZaA-HSA-vMIP-II来源于含有质粒pPICZaA-HSA-vMIP- II的大肠杆菌DH5a。
3.权利要求1所述的表达体系，其特征在于所述巴斯德毕赤酵母菌株为酵母菌X33。
4.权利要求1所述的表达体系的构建方法，是从含有质粒pPICZaA-HSA-νΜΙΡ- II的大肠杆菌中提取重组质粒，对重组质粒进行线性化，利用电转化方法转化巴斯德毕赤酵母菌感受态细胞，得到重组酵母，经抗性筛选后，PCR鉴定得到阳性克隆，利用阳性克隆子进行诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE分析，Western-Blot鉴定，获得表达体系。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述PCR是以重组酵母的基因组为模板，两种不同的引物分别扩增，第一组上游引物序列如SEQ ID NO: 1所示，下游引物序列如 SEQ ID NO: 2所示，第二组上游引物序列如SEQ ID NO: 3所示，下游引物序列如SEQ ID NO: 4所示。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述对重组质粒进行线性化使用的限制性内切酶为/^e I。
7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述电转化的参数为电压1.5kV，电容 25μψ,电阻200 Ω ；电击时间为4 10秒，电击一次。
8.根据权利要求1所述表达系统的表达产物HSA-νΜΙΡ- II融合蛋白。
9.根据权利要求6所述的HSA-νΜΙΡ- II融合蛋白在制备抑制外周血单个核细胞药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种表达HAS-vMIP-Ⅱ融合蛋白的表达体系，由质粒pPICZaA-HSA-vMIP-Ⅱ转化至巴斯德毕赤酵母得到。本发明还公开了该表达体系的构建方法，是从含有质粒pPICZaA-HSA-vMIP-Ⅱ的大肠杆菌中提取重组质粒，对重组质粒进行线性化，电转化法转化巴斯德毕赤酵母菌感受态细胞，经抗性筛选后，PCR鉴定得到阳性克隆，利用阳性克隆子进行诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE分析，Western-Blot鉴定。本发明使得vMIP-Ⅱ在不丧失功能的情况下，在血浆中的半衰期得到显著地延长。这样HSA-vMIP-Ⅱ融合蛋白会降低给药频率和剂量，发挥出与vMIP-Ⅱ相似的药效作用。
文档编号C12N15/81GK102220256SQ20111009370
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月14日 优先权日2011年4月14日
发明者孙晗笑, 张光, 李秀英, 王峰, 肖威, 莫雪梅, 贾忠伟 申请人:暨南大学