一种编码叶绿体碳酸酐酶基因在构建耐高浓度CO2且快速生长的工业工程微藻中的应用的制作方法

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及公开一种编码叶绿体碳酸酐酶基因在构建耐高浓度co2且快速生长的工业工程微藻中的应用。

背景技术：

随着全球化石能源日益短缺，以及现代工农业的发展带来的全球气候变暖等问题，发展清洁、可再生型新能源已成为必然趋势，微藻生物能源就是其中被寄予厚望的救世主。据统计，自然界中空气中co2的碳固定总量的40％是由海洋微藻等光合生物完成的。这要归功于微藻在海洋生态系统中分布广泛、具有比陆地植物更高的固碳速率和拥有较快的生长速率(微藻的代时是4-16小时)。同时，由于微藻能够利用太阳能和co2去合成中性脂(三酰甘油)、多糖(诸如淀粉)和其他高附加值产品(如多不饱和脂肪酸和虾青素)，因此它们碳捕获能力正在被开发应用于清洁燃料或材料等方面的工业应用。

然而，开发微藻碳捕获应用于大规模工业co2碳减排和生物能源仍然面临一些巨大挑战。第一，由于工业烟道气的二氧化碳浓度是10％-30％，这样通过微藻捕获co2的一个前提条件就是微藻需具有较高光合固碳效率、较快生长速率和高co2浓度耐受性。第二，为应对全球气候变暖和海洋酸化的日益严重，也需要认识提高co2浓度下微藻的响应及其机制。第三，高co2浓度下培养微藻，一定程度上避免了不耐受高浓度co2细菌或真菌的污染，满足了生物防治的要求。这样，为筛选具有高co2耐受表型的微藻，使用了许多研究策略，但收效甚微，主要原因有：(1)对微藻的碳固定机制缺乏系统的认识，目前认识相对较清楚的也只有蓝藻和衣藻；(2)采用传统策略诸如化学诱变、物理诱变和适应性进化等取得的筛选效果不明显；(3)在绝大多数微藻中，完善的遗传操作工具尚未建立；(4)另外，许多研究显示可耐受高浓度co2的微藻明显缺乏碳浓缩机制(co2concentrationmechanism，ccm)，因此，微藻ccm活性可能限制了高co2耐受性。

一般情况下，对于大多数微藻而言，最适宜生长的co2浓度是1-5％，值得庆幸的是，由于古老的微藻生长在一个较低的co2浓度环境(低于0.04％)，因此绝大多数微藻都进化了一个适应低二氧化碳环境生长的co2浓缩机制(ccm)，这个机制主要通过碳酸酐酶和无机碳运输蛋白参与的一系列酶促反应，能够辅助浓缩碳固定位点的co2浓度，从而提高固碳效率。在原核生物蓝细菌和真核微藻(如衣藻、硅藻等)，ccm机制的网络模型已经基本建立，对ccm关键组分(碳酸酐酶和碳酸氢盐转运蛋白等)的调控具有了清楚的认识，并且通过基因工程手段过表达ccm相关组分基因(如碳酸氢盐转运蛋白)，能够筛选到在空气水平(0.04％co2)浓度下具有较快生长表型的突变株，在高等植物烟草中导入蓝细菌rubisco能够提高光合作用效率,但仍不能解决高co2浓度耐受这一瓶颈问题。但是，在高co2浓度培养中ccm机制通常都是关闭的，尤其是在自然界栖息在极高co2环境的微藻中，它们的ccm机制都是不存在的，可见，ccm活性可能影响着高co2的耐受性。因此，系统认识ccm代谢网络和理性工程设计是解决此瓶颈问题的必由之路。

微拟球藻是一种单细胞光合微藻，广泛分布于海洋、淡水等环境水域。这一类微藻能够作为一个潜在的模型去研究在不同二氧化碳浓度下无机碳吸收和利用机制，主要出于以下几点考虑：(1)在以色列的seambiotic公司，微拟球藻已用于烟道气大规模室外养殖；(2)它能够耐受较广的ph值范围(从6.0-10.2)，这意味着它的生长很少受酸化和钙化的影响(提高co2浓度会导致酸化，降低co2浓度会导致钙化)；(3)据文献报道，微拟球藻不会产生胞外的碳酸酐酶，这可能暗示出它具有主动运输碳酸氢盐系统或能够利用碳酸氢盐作为惟一碳源。这样，它可能使用一个独特的ccm机制协助固碳，因此，这类高产油的微藻正在崛起为产油和光合碳固定的研究模型。但是，目前对微拟球藻ccm网络调控机制的认识以及遗传改造都是非常匮乏的。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种编码叶绿体碳酸酐酶基因在构建耐高浓度co2且快速生长的工业工程微藻中的应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种编码叶绿体碳酸酐酶基因在构建耐高浓度co2且快速生长的工业工程微藻中的应用。

所述编码叶绿体碳酸酐酶基因为具有下述(1)至(3)中任一项所述的核苷酸序列：

(1)具有序列表seqidno.1中的核苷酸序列；

(2)具有编码序列表seqidno.1中核苷酸的蛋白质序列的多核苷酸；

(3)具有与序列表中seqidno.1的dna序列有较高的序列同源性，且编码相同功能蛋白质的dna序列。

上述微拟球藻碳酸酐酶，命名为ca2，来源于工业微藻(nannochloropsisoceanicaimet1)，其中，序列表中的seqidno.1由1218个碱基组成，编码一个完整的开放阅读框，它编码具有序列表seqidno.2的氨基酸残基序列的蛋白质。

所述构建耐高浓度co2且快速生长的工业工程微藻：通过反向遗传学rna干涉技术将工业微藻微拟球藻叶绿体碳酸酐酶基因特异敲低，进而获得能够耐受高浓度co2并能够快速生长的工程微藻。

具体为：rnai表达载体构建，采用硅藻用rnai表达载体作为骨架，将载体骨架的硅藻fcp基因启动子置换为微拟球藻内源启动子，并克隆微拟球藻叶绿体碳酸酐酶的反向重复序列，再连接到载体得到rnai表达载体；而后通过电脉冲转化微拟球藻，转化后微拟球藻培养液培养于高浓度的co2环境下，能够耐受高浓度co2并生长速率高的藻株即耐高浓度co2的工程微藻。

其中，生长速率高为转化后微拟球藻培养液生长速率快于野生型的生长速率，生长速率提高20％-30％。

本发明构建了用于反向遗传学研究rna干涉(rnai)技术的表达载体，其载体骨架主要包括启动子序列(微拟球藻内源tublin基因启动子)，ble抗性基因序列以及针对靶基因ca2形成发夹结构的反向重复序列，其原理主要是基于不同基因的反向重复序列形成发夹结构而被微拟球藻本身固有的rnai元件所识别，进而实现靶标基因的特异下调。

本发明通过电脉冲的方法将外源片段导入野生型工业微藻微拟球藻中，通过抗性筛选获得突变株。

本发明所具有的优点：

本发明从微拟球藻由低co2浓度诱导ccm过程中全局表达谱变化动态，同时联合gc-ms鉴定了此过程中主要代谢物的变化，构建了ccm等中心碳代谢网络模型，系统理解微拟球藻ccm功能控网络机制基础，进而本发明在微拟球藻中通过rnai手段下调叶绿体碳酸酐酶的表达，一定程度上、下调或部分关闭ccm机制----基因敲低(geneknockdown)，筛选到了高co2浓度耐受和生长速率同时都得到了增加的突变株，生长速率能够提高30-45％左右，高浓度co2培养有效避免或降低培养过程中杂菌(细菌和真菌等)的污染，具有生物防治效应，并能降低生产成本可用于工业生产。本发明获得的工业藻株在生物能源工业化应用等方面开辟了一扇新的大门。

附图说明

图1为本发明提供的微拟球藻碳酸酐酶rnai表达载体的构建示意图，主要包括启动子，抗性基因和目的基因的反向重复序列；

图2为本发明提供的转化株的pcr验证的电泳图利用pcr扩增抗性基因序列，发现转化株存在目的条带约400bp(第三和第四泳道有条带)，其中wt为野生型(第一和第二泳道无条带)；

图3为本发明提供的突变株和野生型的ca2基因在高、低co2浓度下相对表达丰度变化突变株的碳酸酐酶基因ca2在rna表达水平明显被抑制，相对表达丰度降低在60％-80％左右；

图4为本发明提供的突变体和野生型在高低co2培养条件下表型点滴实验和液体培养下的表型表征；

图5为本发明提供的突变株和野生型微拟球藻在高、低co2浓度培养条件下的生长曲线；

图6为本发明提供的突变株和野生型微拟球藻在高co2浓度下干重曲线图。

图7为本发明提供的来自高、低co2浓度培养条件下突变株和野生型微拟球藻细胞的光合放氧速率；

图8为本发明提供的来自高co2浓度培养条件下突变株和野生型微拟球藻细胞的油脂含量。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。

本发明通过反向遗传学策略rna干涉(rnai)技术敲低了工业微藻微拟球藻中的一个编码叶绿体碳酸酐酶基因进而获得了能够耐受高浓度co2并能够快速生长的突变株，突变株的生长速率在高浓度co2(5-10％)较野生型有明显提高(40％)，而在空气浓度co2下生长速率差异不明显，高浓度co2下培养有效地避免了大规模培养过程中细菌、原生动物等污染问题，另外，油脂含量相应得到提高，提高幅度在20％-30％左右。本发明所公开的方法为工业微藻固定工业co2废气奠定了基础及可行性方法。

本发明实施例中所用的方法如无特别说明均为常规实验方法。

实施例1微拟球藻(nannochloropsisoceanicaimet1)碳酸酐酶全序列的获得

通过对微拟球藻全基因组测序，初步获得了核基因组编码的叶绿体碳酸酐酶的全序列，如seqidno.1和seqidno.2所示；以及seqidno.2的同源序列seqidno.3。

进一步通过聚合酶链式反应pcr验证获得其叶绿体碳酸酐酶的完整阅读框(orf)，pcr引物序列为：f1为5’atgtggcggcgtgtgctcgca3’；r1为5’ctagacgcttttattaacc3’。pcr反应体系包括5xpcr反应缓冲液(5xdnabuffer)5ul、脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)4ul、硫酸镁(mgso4)2ul、正向引物(forwardprimer)2ul、反向引物(reverseprimer)2ul、dna3ul、dna聚合酶(koddnapoleymase)0.5ul、ddh2o为32.5ul,总反应体系为50ul；

pcr反应程序均为第一步95℃5min，第二步95℃反应1min、58℃30s、72℃反应30s(30个循环)，第三步72℃延伸7min，第四步4℃反应5min。

实施例2

1)rnai表达载体的构建

rnai表达载体的构建以phir-ptgus为载体骨架，首先通过pcr扩增反应以微拟球藻基因组为模板，扩增获得229bp的片段(ca2基因序列1395bp到1623bp位置)和404bp片段(ca2基因序列1395bp到1798bp位置)两个pcr片段；

其中，扩增229bp的片段的引物为：

ca2_fw(5’cggaattcgggcatagagtgcgaattga3’；包含ecori位点)/ca2_rv1(5’gctctagacgcttttattaaccccatcc3’；包含xbai位点)；

扩增404bp的片段的引物为：

ca2_fw(5’cggaattcgggcatagagtgcgaattga3’；包含ecori位点)/ca2_rv2(5’gctctagaatcctggtcgtcaaagaacg3’；包含xbai位点)。

上述进行pcr扩增的反应体系均为50ul：包括5xpcr反应缓冲液(5xdnabuffer)5ul、脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)4ul、硫酸镁(mgso4)2ul、正向引物(forwardprimer)2ul、反向引物(reverseprimer)2ul、dna3ul、重组dna聚合酶(koddnapoleymase)0.5ul、ddh2o为32.5ul,总反应体系为50ul；

pcr反应程序均为第一步95℃5min，第二步95℃反应1min、60℃30s、72℃反应30s(30个循环)，第三步72℃延伸7min，第四步4℃反应5min。

由上述获得两个片段含有一个共同的片段为229bp，目的形成反向互补序列(颈环发夹结构)。然后用ecori和xbai限制内切酶消化以上两个pcr片段并用pcr产物纯化试剂盒进行纯化，同时用ecori消化phir-ptgus载体并用牛小肠碱性磷酸酶进行片段去磷酸化处理后纯化。再将ecori和xbai消化的两个pcr片段与线性化载体(phir-ptgus的ecori消化后线性片段)用t4连接酶进行连接得到质粒phir-ptca2。微拟球藻beta-tubulin基因的启动子使用引物notub_fw(5’gcgagctcgccagctgcctcat3’；包含saci位点)和notub_rv(5’ggccatgg3tgtgtccgccgcc’；包含ncoi位点)被扩增，然后用saci和ncoi限制性内切酶酶切，同时载体phir-ptca2也用用saci和ncoi限制性内切酶酶切并纯化，随后再将beta-tubulin基因的启动子片段与线性化载体(beta-tubulin基因的启动子)用t4dna连接酶进行连接得到载体phir-ngca2，其载体包含beta-tubulin基因的启动子区、抗性基因ble、ca2的正反向重复序列以及fcp基因的终止子，组成表达盒(如图1所示)。

2)rnai表达盒的pcr扩增

用pcr引物(f1：5’cccagtcacgacgttgtaaaacg3’；r1：5’ggaaacagctatgaccatg3’)扩增以上实施例2的表达载体得到包含有tub基因启动子、抗性基因ble、能形成发夹结构的ca2序列以及转录终止子序列，pcr反应体系为5xpcr反应缓冲液(5xdnabuffer)5ul，脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)4ul,硫酸镁(mgso4)2ul,正向引物(primerf1)2ul,反向引物(primerr1)2ul,模板dna(dna)3ul,dna聚合酶(koddnapoleymase)0.5ul,ddh2o32.5ul,总反应体系为50ul；pcr反应程序为第一步95℃5min，第二步95℃1min56℃30s72℃45s(30个循环)，第三步72℃延伸7min，第四步4℃5min。待pcr扩增反应完成后，将得到的pcr产物电泳检测和进一步pcr产物纯化，使其浓度达到3-5ug/ul，放于-20℃保存，待下一步电脉冲转化时备用。

3)微拟球藻突变株的获得

采用电脉冲转化方法将上述得到rnai表达盒片段导入野生型微拟球藻。具体实施方法为：将野生型微拟球藻在f/2培养基中培养至浓度达到3×10⁷cells/ml(培养条件为25℃，连续光照培养，光强为50umol/m^-2s^-1，通气量为100ml/min)，离心收集微藻细胞倒掉上清液，然后用4℃预冷的375mm的山梨醇溶液洗涤藻细胞三次并用其重悬藻细胞，使藻细胞浓度为8×10⁸cells/ml；将浓缩后的藻细胞溶液分成200ul一份，然后向每份中加入3ug上述获得线性化载体和1ul鲑鱼精dna(15ug/ml)，混匀后冰上放置10min；再将混合物转移入2mm电击杯，以2200v(hv)，600欧姆，50微法(uf)进行电击，电击后立即将藻体以5ml新鲜的f/2培养基转移入无菌的白头玻璃管，遮光后在光照摇床中培养(用弱光进行复苏)，转速设置为100rpm，25℃复苏48h；复苏后将其在5000g离心5min，弃尽上清，而后用1ml20％玉米淀粉重悬藻体后，倒在琼脂含量0.8％的f/2的平板上，均匀铺开并将平板在超净工作台吹干后密封，放于25℃光照培养，待3-4周后挑选转化子。

所述20％玉米淀粉为取2g玉米淀粉，用无水乙醇和超纯水交替洗3遍，再用10ml70％乙醇重悬即成，以f/2培养基洗4次，再以10ml含0.8％peg8000的f/2培养液进行重悬。

所述琼脂含量0.8％的f/2的平板上为预先制备琼脂平板，再添加3-5ug/ml的zeocin抗生素)

实施例3转化子的pcr验证

用牙签挑选转化子于新鲜的f/2培养基(包含3-5ug/ml的zeocin抗生素)，放于光照培养箱培养，待其生长2-3周，离心收集藻细胞，用基因组dna提取试剂盒(omegahpdnaextrationkit)提取转化株的基因组dna，同时也提取野生型微拟球藻的基因组dna，作为后续实验的对照。提取基因组并用nannodrop定量后，用正向引物f1(5’ttatcaacggcataccggcactg3’)和反向引物r1(5’ctgatgaacagggtcacgtcgt3’)进行pcr扩增反应，反应体系为50ul：5xpcr反应缓冲液(5xdnabuffer)5ul，脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)4ul,硫酸镁(mgso4)2ul,正向引物(primerf1)2ul,反向引物(primerr1)2ul,模版dna(dna)3ul,dna聚合酶(kodplusdnapoleymase)为0.5ul,ddh2o32.5ul,总反应体系为50ul。反应程序为：第一步95℃5min，第二步95℃1min56℃30s72℃45s(30个循环)，第三步72℃延伸7min，第四步4℃5min。pcr扩增反应完成后，琼脂糖凝胶电泳检测，看是否使用转化子dna为模板有400bp条带，而且野生型没有条带，如图2所示，证实外源片段已经整合到微拟球藻基因组，电脉冲转化成功，得到突变株，突变株可分别标记为m2、m4。

实施例4微拟球藻突变株ca2基因相对表达水平测量

将上述获得突变株和野生型分别在不同co2浓度(不同co2浓度为高浓度为5％co2，低浓度为0.04％co2)下培养，光强控制一致在50umol/m²/s，通气速率在100ml/min。待微藻培养至对数生长期时收集微藻，5000g离心5min，然后用液氮迅速冷冻，保存在-80℃备用。

突变株表达丰度实验测量分为以下三步：

第一步rna的提取，将冷冻保存的藻细胞进行rna提取，首先采用液氮研磨的方式破碎藻细胞，一般液氮研磨5-10min，然后加入1mltrizol(invitrogen公司)迅速充分混匀并加入200ul氯仿在12000rpm下离心10min，吸取上清液转入新的eppendorf管中再加入等体积氯仿，充分振荡混匀，静置2-3min后以12000rpm下离心10min，将上清液转入新的离心管并加入等体积异丙醇室温沉淀15min，离心15min后，再用75％乙醇洗涤沉淀后，吹干加入50uldepc处理的ddh2o，测量rna浓度后，保存于-80备用；

第二步，cdna的制备，rna样本按照takara试剂rtreagentkitwithgdnaeraserkit的流程说明使用随机引物进行cdna的合成，备注基因组dna去除反应体系为20ul，其中包括2ug的总rna、5xreactionbuffer和gdnaeraser酶；

第三步，荧光定量pcr反应，通过480ii(采用罗氏的快速启动通用绿色荧光)荧光定量qrt-pcr进行定量。pcr的反应体系为1ul的cdna(来自上一步的反转录制备)、正反向引物各1ul、10ul的2xrochefaststartsybrgreenmaster(rox)、ddh2o添加7ul补足至20ul，其中引物序列为正向引物：5’atccaggaacaattatttcgct3’；反向引物：5’gagtcggaacaagcaataa3’。反应条件参照roche试剂盒说明执行。实时荧光qpcr结果数据的分析使用2^-δδct方法,其中δδct值为(ctca2基因-ct内参基因)突变株-(ctca2基因-ct内参基因)野生型。

通过以上方法计算ca2基因在突变株中的相对野生型的基因表达丰度，结果证实突变株(m2或m4)的ca2基因表达丰度无论是在低co2还是在高co2培养条件下显著低于野生型ca2的表达，证实ca2基因在转录水平被抑制，大约下调60％-80％，如图3所示，进一步证实ca2基因在突变株m2、m4中被沉默。

实施例5微拟球藻耐co2突变株的生长表型测量

将突变株和野生型微拟球藻分别用牙签挑取单藻落置于f/2培养基中在50ml三角瓶中培养2-3周，然后测量od750下的细胞密度，而后重新接种至新鲜的f/2培养基，使接种浓度保持一致，即相同的od750值＝0.5-1.0，然后连续传代培养2-3次，将微藻接种至200ml的柱式反应器培养(反应器内培养基为f/2培养基)，当生长到对数生长期后，将突变株和野生型微拟球藻分别稀释至相同的浓度(上述测定od750值相同)，分别吸取10ul稀释液滴到预先制备好的f/2固体琼脂平板上(琼脂浓度为0.8％并且不添加抗生素)，每个藻样分别滴到两块平板上(在两个co2浓度下培养，分别是0.04％和5％的co2浓度)，在超净工作台上吹干后，在室温、无光或低光环境下放置2-3天，然后将平板放置于简易培养箱(专利申请号：201410339234.9)，并将其中一个培养箱通入空气浓度co2，另外一个通入高浓度co2(5％)或通入低浓度co2(0.04％)，光强50umol/m²/s，用此培养箱可以进行相对封闭式培养筛选，通过调节培养箱进气口和出气口阀门可以控制培养箱内部稳定的co2环境，不定期观察微藻(突变株和野生型)的生长情况(图4)。同时，也将从200ml柱式反应器中接种微藻到新鲜液体培养基中测量生长曲线和干重等生理指标。测量结果如图5，6所示，发现突变株在高co2浓度下生长快于野生型，经10天培养后干重增加30％左右(图6)。因此，通过基因敲低的方法获得了耐受高co2浓度切能够快速生长的突变株，为工业化烟道气下培养工业微藻打下了坚实的产业化基础。

实施例6微拟球藻耐高浓度co2突变株的生理表型测量

将上述耐高co2浓度的微拟球藻突变株和野生型细胞的光合放氧速率测定采用clark-ii型氧电极(英国hansatech公司)进行，测定时反应槽的温度为4℃(水浴调整)，光强用遮光片调整为300μmolm^-2s^-1。将微拟球藻突变株和野生型细胞培养至对数生长期，以5000g离心5min收集藻细胞与15ml离心管，每个样品收集两份，一份用于测定光合放氧速率，另外一份用于叶绿素含量的测量。收集的微藻细胞先用无碳水(预先通入n2排除掉溶液中的co2)洗涤，然后又悬浮在不同ph值的缓冲液中，依次为20mmoll-1的mes缓冲液，20mmoll-1tris缓冲液和20mmoll-1的apes缓冲液的无碳水中(ph6.0、7.8或9.0)，缓冲液的配置用海水然后分别测定突变株和野生型细胞在不同ph条件下的光合放氧速率。同时每个样品留取一份用来测量叶绿素a的含量，叶绿素a的测量采用甲醇抽提的方法，采用以下这个公式计算叶绿素a(chla)的含量：

chla的含量(ug/ml)＝16.5169xa665-8.0962xa652

光合放氧速率用叶绿素a的含量进行换算。测量结果显示，突变株细胞的光合放氧速率在ph6.0条件下，突变株的光合放氧速率有显著提高，而在ph9.0条件下，突变株的光合放氧速率又显著降低，因此突变株能够抵抗由于co2浓度升高导致的ph降低，在一定程度上显示出耐酸性，可能叶绿体内部的微环境得到改善，即ph得到提升，所以显现出快速生长，如图7所示。

而后，对上述获得突变株进行油脂含量的测定，油脂提取采用甲醇/氯仿方法抽提，粗油脂经氮吹仪干燥后称重，结果显示突变株在正常培养条件下油脂含量增加20％左右，如图8所示，油脂含量由原来的0.18mg/mg干重增加到0.25mg/mg细胞干重。

seqidno.1

atgtggcggcgtgtgctcgcatattcctcgagattcgatgtaacacatctcaatagcgaggtaacgctatccacgtatctcaccattgtctccaccctctctattaaccccatctttctatgcagttcgcaaaaatctccgatacgcggccctgcggttaatccaacaagtcaagaccttgaaacgtcggaaatgagcaacccgccgtctcctgtcgtgccgtctcccagccttacacaatcaaatcatgacatgctcaccagcatccgcagccacctagacgaccaagaggtcaagatccaggaacaattatttcgcttccagggcattaagagggccattgaccgcatttgcaagaatgacgaggcctacatggactcccccgatattgtcaaggcacagaccacgctcgaagatcgcccggagctggaaaggaaaggagagactgctgctgaagccttgcgcctgctcaaagtgggcaacgctgcctttttgcgcgatgaggttgtgcctgtccaccgctctgacagacatattggcctacattttgcccagaaaccccacgccataattattgcttgttccgactctcgggtcccgccggagatgatctttaattgcgcgtttggtgaactcttcgtcatccgccttgccggcaacaccgtcgatgcactcgctcgcgccagcctcctttacgcggtgcaacacctccaatctcccctggtcgttgttctgggccacgaaaagtgcggcgccgtcacagccgccttgcagccggaagaggagctggcggatgctcccggggacattaagaccttggtgcgaaacatcaaaaggggcatagagtgcgaattgattgacccgagcgcccacattttcggcgatgaaagactgttgtgcgcgattgtctgcaacgtgcattacgtggcccgcaccctgtcggaacaccccgatatccgcccatttattgaccgaaggaaactgtccgtcgtgggcgcctactacgcttttagtggggtggtgtcgttctttgacgaccaggatgagggaggaaggatggagagagggcgggtgtttgggggtgtggagggaaacggatccttgtgcttaagttgttccggaactttgtccggaaactcgagtccgatggcggggggagggagcaagggatccagtccgcctccgagcgtgcaggatggggttaataaaagcgtctag

seqidno.2

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seqidno.3

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